содержание   ..  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  ..

ФИЗИОЛОГИЯ ДРОЖЖЕЙ

Питание дрожжевой клетки.

Питательные вещества либо входят в состав клетки, либо снабжают ее необходимой для жизни энергией.

Перенос питательных веществ через цитоплазматическую мембрану, которая обладает способностью регулировать проникновение различных веществ в клетку и выход из нее, осуществляется в результате переноса двух типов: диффузии и стерео-химического специфичного переноса. Каждый тип переноса имеет активную и пассивную формы (рис. 25).

Процесс пассивной диффузии происходит без затрат энергии клеткой, и вещества проникают через цитоплазматическую мембрану при растворении в ней, а процесс активной диффузии

с затратой энергии (обычно АТФ) в процессе дыхания. Так, для проникновения вещества R—О в клетку потребуется затрата энергии на восстановление его водородом до R — ОН, растворимого в ци-топлааматической мембране, с последующим окислением до R—О в клетке и освобождением водорода для восстановления новой молекулы R—О.

Перенос же в клетку большинства веществ, нерастворимых в цитоплазматической мембране, осуществляется находящимися на мембранах особыми белка-ми-переносчиками — пермеазами. Таким образом, проницаемость цитоплазматической мембраны связана с наличием веществ, роль которых заключается в транспорте ряда веществ в клетку микроорганизма. При пассивном стереохимическом специфичном переносе питательных веществ комплекс вещество — пермеаза растворяется в цитоплазматической мембране, диффундирует в клетку и пермеаза возвращается за новым веществом.

Активный стереохимйческий специфичный перенос питательных веществ требует затраты энергии клеткой микроорганизма на превращение вещества в форму, способную соединиться с белком-носителем и пройти через мембрану. Например, вещество R2—О должно быть превращено в R2—ОН, которое и объединяется со специфической пермеазой [112].

Следует отметить, что эффект переноса растворенных веществ обеспечивает определенная стереохимическая структура пермеазы и транспортируемого вещества. Так, перенос определенного углевода протекает только при участии одной пермеазы. Установлена зависимость поступления в клетки дрожжей сахаров от их циклического строения. Потеря циклического строения у сорбита, маннита и других шестиатомных спиртов приводит к четкому изменению проницаемости. Обнаружена видовая специфичность проникновения сахаров. Клетки Sacch. cerevisiae используют трегалозу, тогда как Sacch. fragilis — нет. Проницаемость клеток в смесях сахаров обусловлена конкуренцией, например, между глюкозой и галактозой, галактозой и мальтозой. Таким образом, физиологическую разнокачественность микроорганизмов определяет не только комплекс ферментов, но и обладание специфической проницаемостью или транспортным механизмом.
На процессы переноса растворенных веществ у микроорганизмов влияют факторы окружающей среды Активность пермеаз обычно ингибируется ионами тяжелых металлов, величиной pH, температурой и др. Изменяется проницаемость мембран дрожжей и от условий культивирования. Так, на среде с большим недостатком биотина проницаемость мембран увеличивается [77].

Как и во всех живых организмах, основную часть дрожжевой клетки составляет вода — в пределах 75% от общей массы. Состав сухой массы дрожжей следующий [154], %:

Неорганические вещества     5—10

Углеводы                              25—50

Азот                                       4,8—12

Белки   (N * 6,25)                 30—75

Липиды                                      2—5
 

Неорганические вещества дрожжевой клетки в основном состоят из фосфорной кислоты (около 50%) и калия (около 25%). Остальные элементы (сера, кальций, железо, хлор, марганец, цинк, молибден, бор и др.) содержатся в ней в незначительных количествах. Углеводы дрожжей составляют полисахариды, гликоген. Содержание свободных аминокислот в дрожжах к концу брожения составляет (в мг/г лиофильно-высушенных дрожжей) [135]: лизин — 7,5; аргинин—1,3; гистидин—11,0; аспарагиновая кислота — 2,9; серии — 2,7; глицин— 1,5; глутаминовая кислота — 3,9; аланин — 8,7; пролин — 2,0; тирозин — 2,8; метионин — 2,9; лейцин (изолейцин) — 5,4; цистеин — следы.

Нуклеиновые кислоты дрожжей — пуриновые и пиримидиновые основания — составляют соответственно 8 и 4% от общего количества азота [154].

Витамины, содержание в 1 г сухих дрожжей, мкг
 

Инозит                                      6000— 15000

Биотин                                     0,6—2,7

Пантотеновая кислота           2,0—19,0

Тиамин                                      24—50

Пирйдоксин                                 14—39

Никотинамид                             370—750

Рибофлавин                          30—60
 

Химический состав дрожжей может изменяться в зависимости от состава питательной среды, возраста культуры и условий культивирования. Отношение дрожжей к веществам, входящим в состав среды, зависит главным образом от ферментов, вырабатываемых данным видом или расой дрожжей.

Среды для культивирования дрожжей должны содержать все необходимые им химические элементы и в достаточно легко усвояемой форме,
 

Углеродное питание. Источниками углерода для дрожжей могут быть самые разнообразные органические соединения углеводы (сахара и их производные), спирты, органические кислоты, аминокислоты, белки, углеводороды и многие другие. Однако в отношении сахаров существует видовая специфичность. На этом построена диагностика видов дрожжей. Так, при общности химизма углеводного обмена большая часть видов рода Saccharomyces различается между собой прежде всего по отношению к сахарам. Что касается других источников углерода — спиртов и органических кислот,— то отношение к ним одинаково у всех видов данного рода [90].

Однако большинство видов винных дрожжей сбраживают глюкозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу и галактозу; рафинозу используют частично, а лактозу, мелибиозу, пентозы, декстрины и крахмал совсем не сбраживают. В виноградном сусле примерно в равных количествах содержатся глюкоза и фруктоза. Фруктоза значительно слаще глюкозы, поэтому для приготовления вин с остаточным сахаром лучше использовать дрожжи, обладающие способностью в первую очередь сбраживать глюкозу.

По интенсивности утилизации глюкозы или фруктозы (к моменту, когда сброжено около 50% фруктозы) дрожжи разделяют на 3 группы [154]:

1) глюкозофильные — сбраживают к этому моменту от 80 до 85% глюкозы (большая часть видов рода Saccharomyces, а также виды родов Saccharomycodes и Brettanomyces);

2) фруктозофильные — в этот период используют только от 5 до 10% глюкозы (Sacch. bailli, Sacch. rouxii, T. stellata);

3) дрожжи, использующие оба сахара почти с одинаковой скоростью: к моменту, когда они утилизируют половину фруктозы, исчезает 40—60% глюкозы (Sacch. rosei, Pichia membra-naefaciens).

Органические кислоты занимают важное место в обмене веществ у дрожжей: они могут стимулировать или ингибировать их рост, служить единственным источником углерода и энергии [26,126,178].

Все промежуточные продукты цикла Кребса (пировиноград-ную, уксусную, янтарную, фумаровую и яблочную кислоты) дрожжи в состоянии использовать в качестве единственного источника углерода. Однако скорость роста на средах с этими кислотами ниже, чем на средах с глюкозой. При выдержке вина под хересной пленкой показано образование щавелевой, гликолевой, фумаровой и глутаровой кислот, которых в исходном вине не было [178]. Специальные опыты подтвердили синтез хересными дрожжами из яблочной кислоты фумаровой, янтарной, гликолевой; из пировиноградной — лимонной, яблочной, молочной, янтарной кислот.

Ненасыщенные жирные кислоты, особенно олеиновая, линоле-вая, линоленовая, пальмитолеиновая, арахидииовая, являются важными ростовыми факторами дрожжей в анаэробных условиях. А. Андреазен и Т. Стийер [232] установили, что винные дрожжи могут свободно размножаться в анаэробных условиях, если в среду для культивирования ввести два вещества: какую-либо
ненасыщенную жирную кислоту (олеиновую, линолевую, лино-леновую) и стерины (эргостерин или холестерин). П. Брешо с соавторами [239, 242] изучали дрожжи в процессе приготовления вин углекислотной мацерацией. Ими установлено присутствие стимуляторов роста дрожжей в виноградном сусле (пруин винограда), необходимых для развития в анаэробных условиях.

Использование дрожжами углеводородов как единственного источника углерода широко применяется для получения кормового белка. Парафины могут активно потребляться углеводо-родокисляющими дрожжами рода Candida при технологическом процессе производства дрожжевой массы.

В настоящее время существует подкрепленное экспериментальными данными мнение об участии СОг в обмене веществ дрожжей [35]. А. К. Родопуло [161] была доказана способность дрожжей синтезировать из пировиноградной кислоты и углекислоты ряд органических кислот: лимонную, яблочную, янтарную, молочную и др.

При производстве шампанских вин дрожжи оказываются в среде с повышенным содержанием СОг. Л. В. Дубинчук, Н. Н. Глонина, Е. С. Дрбоглав исследовали фиксацию С1402 дрожжами при шампанизации и установили активное использование С02 для синтеза белковых веществ, кислот [54, 56].

Таким образом, среди всех разнообразных органических источников углерода углекислый газ является биологически активным веществом, связанные формы которого являются необходимым продуктом для дрожжей [50].
 

Азотное питание. Источники азота, необходимые для синтеза азотсодержащих компонентов клетки (аминокислот, белков, пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов и некоторых витаминов), должны содержаться в среде в виде органических или неорганических соединений. Большинство дрожжей не усваивают нитраты. Однако род Hansenula характеризуется способностью использовать их, чем и отличается от рода Pichia. Некоторые виды рода Brettanomyces также усваивают нитраты. В качестве неорганических источников азота дрожжи хорошо используют: сернокислый и фосфорнокислый аммоний, аммиачные соли уксусной, молочной, яблочной и янтарной кислот [76].

В этом случае ближайшим предшественником органического азота является аммиак, который дрожжи рода Saccharomyces усваивают в первую очередь и только потом — органические азотистые вещества — аминокислоты. Дрожжи могут использовать в качестве источника азота мочевину и пептон. Для получения большой биомассы Sacch. cerevisiae в аэробных условиях в среде должен содержаться азот как в органической, так и неорганической форме. Один миллиард клеток усваивает около

4—7 мг азота [78].

Аммиачный азот, содержащийся в виноградном сусле (от 25 до 100 мг/л), быстро усваивается дрожжами в первые часы (сутки) размножения клеток. Иногда, при недостатке аммиачного азота в сусле (в годы сильного вызревания винограда или поражения ягод грибом Botrytis cinerea), для усиления роста культуры дрожжей вводят соли аммония. Но делать это можно только перед забраживанием, так как в процессе брожения дрожжи усваивают аммонийные соли не полностью [154]. Следует также обратить внимание на то, что добавки солей аммония повышают в вине титруемую кислотность и снижают величину pH.

Н. Ф. Саенко и другие исследователи установили, что хересные дрожжи лучше развиваются при внесении дополнительных источников азотистого питания (0,5% дрожжевого автолизата или лебедевского мацерационного сока или водного раствора аммиака в количестве 80—120 мг/л). Наиболее быстрому развитию хересной пленки способствует одновременное внесение 0,5% автолизата и 80 мг/л аммиачного азота [178].

Хорошо усваиваются дрожжами аминокислоты, хуже — пептиды и совсем не усваивается нативный белок. Однако при наличии усвояемого азота в среде дрожжи способны расщеплять белок, выделяя протеолитические ферменты [229].

По питательной ценности для вийных дрожжей Э. Пейно и С. Лафон-Лафуркад [292] аминокислоты разделили на хорошо усваиваемые — изолейцин, триптофан, аргинин, валин, гистидин, аспарагиновая кислота и плохо усвояемые — треонин, фенилаланин, тирозин, метионин, серин, лизин, глицин, глутаминовая кислота, лейцин. Совершенно не усваивается пролин.

Примечательным фактом является то, что дрожжи используют только природные формы аминокислот (L-формы).

Дрожжи в процессе брожения виноградного сусла, с одной стороны, потребляют азотистые вещества, с другой — выделяют их в среду. При этом поступление аминокислот и других азотистых веществ значительно увеличивается к концу брожения, когда возрастает число мертвых клеток дрожжей и соответственно — автолитические процессы усиливаются. Однако надо учесть и то, что аминокислоты могут выделяться в среду и живыми клетками.

Н. М. Сисакян и Э. Н. Безингер [188] исследовали изменение состава аминокислот в процессе брожения виноградного сусла и формирования вина и показали, что в процессе сбраживания сусла дрожжи интенсивно ассимилируют большинство аминокислот, не затрагивая пролин, и по окончании брожения отдают в вино аспарагиновую, глутаминовую и у-аминомасляную кислоты, аланин, валин, гликокол, серин, треонин. Таким образом, при культивировании дрожжевых клеток на среде, содержащей полную смесь аминокислот, возможна прямая их ассимиляция в таком количестве, которое соответствует их содержанию в белке дрожжей [76]. Это свидетельствует о том, что для построения белков при размножении и росте клеток необходим не только азот, но и углеродистый остаток аминокислоты. Установлено, что дезаминированный остаток аминокислоты является фактором, определяющим его питательную ценность, позволяет рассматривать аминокислоты не только как источник азота, но одновременно и как источник углерода. Этим можно объяснить принципиальную разницу в ценности различных аминокислот.

Основой метаболизма аминокислот являются реакции трех главных типов: дезаминирование, переаминирование, декарбок-силирование.

В процессе распада и образования «вторичных» аминокислот исключительная роль принадлежит реакциям переаминирования при участии аминотрансфераз. Наличие систем переаминирования у винных дрожжей Sacch. vini и Sacch. oviformis показано В. К. Липатовой [41]. Дрожжи, выращенные в аэробных условиях (виноградное сусло-агар), имели незначительную активность L-аспартат- и L-аланин-аминотрансфераз. У них отсутствовала L-тирозин-аминотрансфераза по сравнению с этими же дрожжами, выращенными в анаэробных условиях (виноградное сусло), хотя выход клеточного экстракта из 1 г сухих дрожжей оставался в тех же пределах. Активность аминотрансфераз дрожжей, выращенных на виноградном сусле, характеризуется данными, приведенными в табл. 9. Несмотря на то что содержание белка в дрожжах рас Киевская и Херес 20 С/96 в аэробных условиях было выше, чем в анаэробных, активность аминотрансфераз была незначительной. Это указывает на связь реакций переаминирования с функциональной деятельностью дрожжей — брожением. Наряду с влиянием условий культивирования на активность аминотрансферазных систем дрожжей оказывал вли-

Таблица 10

 

Источник азота среды Ридер	Активность аминотрансфераз			дрожжей расы Феодосия 1-19
	L-Аспартат: 2-оксо- глутарат-амннотра не- фераза		L-Аланин: 2-оксоглу- тарат-аминотрансфераза		L-Тирозин: 2-оксоглутарат- аминотрансфераза
	I	II	I	II	I	II
(NH4)2S04	3,1	61,1	0,35	6,9	Сл.	Сл.
(NH4)2S04 +	48,2	3528,0	2,65	158,4	3,87	227,2
+ 0,25 г/л аланина
Аланин	56,8	2862,7	3,2	161,3	4,12	207,6
(NH4)2S04+0,25	49,0	1239,7	0,46	11,6	3,62	15,7
г/л аспарагиновой
кислоты
Аспарагиновая кис­	54,5	2485,2	1,47	67,0	5,31	241,7
лота
(NH4)2S04+  0,25	0,82	18,4	0,21	4,7	0,1	2,24
г/л тирозина
Тирозин	38,2	565,4	1,15	17,0	1,22	18,0

Примечание. I — удельная активность, ед./мгбелка; II — активность, ед./г сухих дрожжей.

яние также и азотистый состав среды, применяемой для культивирования (табл. 10).

Добавки аминокислот к сернокислому аммонию и полная замена сернокислого аммония аминокислотами значительно увеличивали активность изучаемых ферментов.

Аминокислоты оказывали влияние не только на соответствующие аминотрансферазы, но и на другие, для которых они не являлись субстратами. Аланин, добавленный в среду, оказывал заметное воздействие на активность всех исследуемых ферментов. При добавке тирозина увеличивалась активность только ти-розин-аминотрансферазы, и лишь при полной замене сернокислого аммония тирозином повышалась активность аминотранс-фераз.

Вполне очевиден факт проявления аминотрансферазной активности при наличии в среде аминокислот. Об этом же свидетельствуют данные увеличения активности ферментов на синтетической среде с сернокислым аммонием к концу брожения, когда в ней появляются аминокислоты, как в результате обмена веществ дрожжей, так и частичного автолиза дрожжевых клеток. Активность аспартат-аминотрансферазы с 3,1 ед./мг белка в середине брожения возросла до 47,7 ед./мг белка к концу брожения; активность аланин-аминотрансферазы увеличилась с 0,35 до 0,92 ед./мг белка. В конце брожения активность тирозин-амино-трансферазы составляла 2,64 ед./мг, в то время как в середине 64 брожения обнаружены только следы этого фермента. Таким образом, наличие в среде аминокислот служит условием для проявления аминотрансферазной активности, что позволяет предполагать их индуцируемость.

Экстремальное воздействие на дрожжи как избытка кислорода, так и избытка С02 значительно изменяет азотистый обмен. Так, наличие кислорода сдвигает обмен в сторону накопления больших количеств биомассы и способствует усиленному потреблению азотистых веществ, в том числе и аминокислот из среды. Поэтому в ней уже к середине брожения остается только 25% аминокислот и 9% общего азота. Наоборот, избыточное давление С02 тормозит размножение дрожжей, но единицей биомассы расходуется больше и аминокислот, и общего азота.

Влияние условий брожения на содержание азотистых веществ в дрожжах и в виноматериале к концу брожения виноградного сусла видно из данных, приведенных в табл. 11.

Условия брожения оказывают существенное влияние на про-теиназную активность. Максимальной удельной активностью обладают дрожжи в аэробных условиях брожения—100% и минимальной— 66% при брожении в атмосфере С02 при давлении 0,4 МПа. Пептидазная активность во много раз ниже протеиназ-ной. Это обусловлено тем, что гидролиз белка в живой клетке идет главным образом до полипептидов и в очень незначительной степени до аминокислот [135].

В целом при выдержке вина на осадке дрожжи могут возвратить 75% аминокислот, потребленных ими во время брожения [252].

Динамика аминокислот в процессе сбраживания виноградного сусла различными расами дрожжей описана В. К. Липато-
 

	Содержание азотистых веществ к концу брожения виноградного сусла, мг/л
Условия брожения		в виноматериале				в дрожжах
	общий азот	белок	аминный азот	аминокис­ лоты	общий азот	раствори­мый белок	аминный  азот	аминокис­ лоты
Аэробные — принудительная по­дача воздуха	43,8	3,6	11,5	45,5	39,7	52,8	7,7	31,7
Анаэробные —с затворами Мейссля При избыточном дав­	119,4	5,5	77,3	429,0	65,8	40,7	9,0	42,0
лении С02—0,4 МПа	239,2	4,9	88,8	752,4	64,1	53,5	5,2	26,6

Примечание. В виноградном сусле содержалось (в мг/л): общего азота — 532,0; белка —11,1; аминного азота—142,1; аминокислот— 1333,6.

вой [41, 96] и Н. И. Бурьян с сотр. Выдержка вина на дрожжах показала, что расы дрожжей Судак VI-5 и Херес 20 С/96 сильнее обогащают вино аминокислотами, чем расы Феодосия 1-19 и Киевская.

Описаны случаи усвоения атмосферного азота хересными дрожжами при недостаточном содержании азотистых веществ в виноматериале [178].

Азотистый обмен наряду с углеводным является основным в процессе брожения. На грани этих двух обменов синтезируются компоненты, влияющие на органолептические показатели вина [145]. Избыток азотистых веществ в винах при наличии доступа кислорода воздуха приводит к переокисленности и появлению в вине мадерных тонов. Г. Г. Валуйко для регулирования содержания азотистых веществ в виноматериалах рекомендует проводить брожение при температуре 16—18°С, что обеспечивает получение легких шампанских и столовых виноматериалов [32, 40].

Для снижения содержания азотистых веществ в винах рекомендуется биологическое азотопонижение (многократное брожение и фильтрация), используемое в технологии приготовления мускатных игристых вин, описанной Е. П. Шольцем [41], и столовых полусладких,— Л. Т. Ермачковой [41].