содержание   ..  60  61  62  63  64  65  66  67  68 

Молочнокислые бактерии

Морфологические признаки бактерий. Морфологию изучают после выращивания культур (18—24 ч) на какой-либо из сред, например на капустной. Изучают форму, размеры и соединение клеток. Для этого готовят препараты живых или фиксированных окрашенных клеток.

Форма колоний или 5 изучается на агаризованных средах, не содержащих поверхностно-активных веществ. Форму колоний исследуют в глубине питательного агара после засева его уколом или внесения в него небольшой петлей культуры, выросшей на жидкой среде. Посевы выдерживают при температуре 30°С в течение 2 сут.

Влияние температуры на рост культуры. Для молочнокислых палочек показатель роста при различных температурах является признаком для предварительной классификации £73]: при температуре 45°С растут L. fermenti и иногда L. buchneri; не растут —

L. brevis, L. cellobiosus, L. viridessens; при температуре 15°С растут L. buchneri, L. brevis, L. cellobiosus, L. viridescens, не растут — L. fermenti.

Жидкие питательные среды, лучше МРС или АТБ, разливают по 10 мл в пробирки, засевают и выдерживают при температуре 15°С в течение 2—3 недель, а при температуре 45°С — 4—7 дней. Пробирки закрывают колпачками или резиновыми пробками для предотвращения испарения.

Принадлежность к гомо- или гетероферментативной группе устанавливают по образованию бактериями углекислого газа из сахаров. Для этого широко используется среда Джибсона и Абдэль-Малека: глюкоза—5,0 г; капустный или томатный сок — 10 мл; дрожжевой автолизат — 0,25 мл; мясопептонный желатин

10—12%-ный — до 100 мл. Капустный сок готовят из листьев, нарезанных и нагретых на водяной бане в течение 15 мин. Затем листья растирают, выжимают сок, фильтруют его и устанавливают pH 6,5. Можно использовать консервированный томатный сок, профильтрованный через марлю и бумажный фильтр, с pH 6,5. Среду разливают в пробирки по 5—6 мл и стерилизуют текучим паром.

Перед засевом среды расплавляют, охлаждают до 40—45°С и засевают 2—3 каплями активной культуры. Затем на поверхность полужидкой среды осторожно по стенкам пробирки наливают охлажденный до 45°С водный 2%-ный агар, который при остывании образует пробку высотой 1—1,5 см. Через 2—4 сут культивирования в термостате гетероферментативные бактерии образуют углекислый газ, что визуально определяется по разрыву агаровой пробки. Гомоферментативные бактерии газа не образуют. Наблюдения ведут в течение 14 сут.

 

Использование углеводов и спиртов. Способность молочнокислых бактерий усваивать в качестве питательных веществ фруктозу, глюкозу, пентозы, глицерин определяют по изменение красного цвета среды в желтый. Среда Виттенбари имеет следующий состав в 1 л водопроводной воды: мясной экстракт — 5 г; пептон — 5 г; дрожжевой автолизат — 50 мл или дрожжевой экстракт — 5 г; твин-80 — 0,5 мл; индикатор — бромкрезоловый пурпурный (1,4 мл 1,6%-ного спиртового раствора на 1 л среды, pH 6,8—7,0). Углеводы и спирты добавляют в виде стерильных растворов в дистиллированной воде в таком объеме, чтобы окончательная концентрация составляла 0,5%.

Наблюдения за изменением индикатора проводят в течение 10 сут при температуре 30°С.

Слизеобразование из сахарозы. Бактерии рода Leuconostoc могут образовывать слизь на среде АТБ и на среде Виттенбари с добавлением 5% сахарозы [73].
 

Образование СО2 из яблочной и лимонной кислот. Это свойство молочнокислых бактерий определяют, пользуясь средой МРС с 0,5% глюкозы. К ней добавляют раствор яблочной или лимонной кислоты, нейтрализованной КОН до pH 5,5. Окончательная концентрация каждой кислоты —2 г на 100 мл среды. Среду разливают по 10 мл и стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 30 мин. После засева среды сверху наносят слой (1— 1,5 см) стерильного расплавленного вазелина.

Образование СО2 из цитрата определяют по методу Джибсона и Абд-эль-Малека, используемому для оценки принадлежности бактерий к гомо- или гетероферментативному типу [73].
 

Использование лимонной, яблочной и винной кислот.

Это свойство изучают на среде, содержащей в 1 л 400 мл водопроводной воды, 500 мл мясной воды, 100 мл томатного сока, 10 г пептона и 2% изучаемого субстрата. pH среды 4,5—5,0. Стерильную среду разливают по 4—5 мл в пробирки, засевают двумя каплями активной культуры молочнокислых бактерий и термо-статируют при 30°С. Об использовании бактериями кислот судят по данным периодического хроматографического анализа (контролем служит среда без кислот), проводимого следующим образом.

Реактивы: 1. Растворитель — н-бутиловый спирт, муравьиная кислота 85%-ная, вода (4: 1 :5). Смесь взбалтывают 10—15 мин в делительной воронке или колбе и оставляют на сутки для расслаивания. Верхний слой используют для хроматографирования.

2. Проявитель — 0,05%-ный раствор бромфенолового синего в спирте-ректификате концентрацией 96% об. На каждые 250 мл проявителя добавляют

2 мл 0,1 н. раствора NaOH.

Для приготовления свидетелей — чистых растворов винной, яблочной и янтарной кислот — по 30 мг кислоты растворяют в 5 мл спирта. Для приготовления раствора молочной кислоты 1—2 капли 50%-ной молочной кислоты растворяют в 5 мл спирта.

Используются хроматографическая бумага № 1—ленинградская или фильтровальная, эксикатор (диаметром 20 см и больше) и капилляры для нанесения капель.

Из бумаги вырезают круг по диаметру эксикатора. На бумаге описывают круг диаметром 2 см, на котором отмечают точки на расстоянии 1,5 см одна от другой. В отмеченные точки (положив под круг бумаги что-нибудь твердое) наносят капиллярами вина и растворы свидетелей. Размер пятна на бумаге должен быть не более 3 мм. Каждую последующую каплю наносят после высыхания предыдущей. Свидетели наносятся 5—б раз, исследуемое вино 7—8. После подсушивания в центр круга вставляют фитилек из хроматографической бумаги и круг помещают в эксикатор, где находится чашка Петри с растворителем. Свободный конец фитилька помещают в растворитель, эксикатор герметически закрывают крышкой. Когда растворитель пройдет по радиусу расстояние 7—8 см от центра, разделение считают законченным. Обычно это происходит за 50—60 мин. Затем бумагу извлекают, высушивают в вытяжном шкафу до исчезновения запаха муравьиной кислоты и опрыскивают раствором проявителя из пульверизатора. Кислоты располагаются по радиусу в следующем порядке: винная, яблочная, янтарная и молочная.

Для идентификации пятен кислот на бумаге отмеряют циркулем расстояние по радиусу от точки нанесения капли до начала пятна. Полученное расстояние сравнивают с расстоянием, пройденным свидетелем. Идентичные кислоты проходят одинаковое расстояние.