содержание   ..  60  61  62  63  64  65  66  67  68 

ПОДСЧЕТ ЖИВЫХ КЛЕТОК МЕТОДОМ ПОСЕВА

Для определения небольшого количества живых клеток, которые нельзя подсчитать в счетной камере, и для более точного определения большого количества живых микроорганизмов в исследуемом материале пользуются методом посева и культивирования. Для этого делают посев исследуемого субстрата на плотную питательную среду в чашки Петри и подсчитывают количество выросших колоний.

При небольшом количестве живых микроорганизмов в анализируемой пробе делают посев без разведений, а при большом их количестве делают разведения с таким расчетом, чтобы на чашке вырастали отдельные колонии и можно было их подсчитать.

Для разведений готовят пробирки со стерильной водопроводной водой по 4,5 мл в каждой (разливают стерильной пипеткой в стерильные пробирки около пламени). Затем стерильной пипеткой берут 0,5 мл исследуемой жидкости и вносят в пробирку № 1 с 4,5 мл стерильной воды. Получают разведение в 10 раз •(или 1-е). Другой стерильной пипеткой перемешивают содержимое пробирки № 1, отбирают из нее 0,5 мл и вносят в пробирку № 2 с 4,5 мл стерильной воды — получают разведение в 100 раз (или 2-е). Таким же образом, каждый раз беря новые стерильные пипетки, делают разведения в 1000 раз (3-е), в 10000 (4-е) и т. д.

Для посева берут стерильные чашки Петри (с заранее разлитой плотной питательной средой, благоприятной для размножения исследуемых микроорганизмов), надписывают на дне чашек номер разведения, берут новую стерильную пипетку и в чашку с № 4 вносят 0,1 мл из 4-го разведения, этой же пипеткой берут затем 0,1 мл из 3-го разведения и вносят в чашку с № 3, этой же пипеткой берут 0,1 мл из 2-го разведения и вносят в чашку № 2 и т. д.

Для равномерного распределения клеток на всей поверхности агара посевной материал растирают стерильным шпателем, начиная с большего разведения. Чашки с посевами переворачивают вверх дном и помещают в термостат с температурой 25—28°С. Через 5—7 сут подсчитывают выросшие колонии. Для подсчета лучшими разведениями следует считать те, которые дали на агаре от 50 до 200 колоний. При большем числе колоний

дно чашки Петри расчерчивают чернилами или восковым карандашом на несколько одинаковых секторов, считают число колоний в 2—3 секторах и среднее число, найденное для одного сектора, умножают на количество секторов.

Для определения количества живых микроорганизмов в 1 мл исследуемой жидкости умножают число сосчитанных колоний на разведение и на 10, так как для посева на чашки бралось 0,1 мл. Например, на чашке выросло 120 колоний в 3-м разведении. Это означает, что в 1 мл исходного субстрата было 120Х X 1000Х 10=1 200 000 живых клеток микробов.