Спорообразование. Форма спор, способ их образования и прорастания являются
родовыми признаками дрожжей. Поэтому при определении систематического
положения выделенных культур дрожжей их высевают на специальные среды для
спорообразования.
Для получения спор у дрожжей было предложено много разных сред [90]. В
настоящее время для получения спор наиболее распространенным является прием
выращивания дрожжей в течение 1—2 сут на полной среде, а затем пересев их на
среду с ацетатом [63].
Состав полной среды (в г на 1 л воды):
Пептон
10
Дрожжевой экстракт
5
Глюкоза
20
Агар
20
Стерилизацию проводят в течение 30 мин при давлении 0,08 МПа.
Состав среды с ацетатом (в г на 1 л воды):
Ацетат натрия
10
Хлористый калий 5
Агар
20
Стерилизацию ведут в течение 30 мин при давлении ОД МПа.
Усвоение сахаров. Изучение усвоения различных сахаров необходимо для
определения видовой принадлежности дрожжей.
Готовят дрожжевой отвар (200 г прессованных хлебопекарных дрожжей в 1 л
водопроводной воды) или полную жидкую среду без глюкозы и агара (пептон — 10
г, дрожжевой экстракт — 5 г, вода — 1л). Среду фильтруют, разливают по
склянкам, в каждую из них добавляют по 2% одного из сахаров (глюкозы,
галактозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, рафинозы) и стерилизуют либо 3 дня
подряд в кипятильнике Коха, либо в автоклаве при давлении 0,05 МПа в течение
20—30 мин.
Опыты по усвоению различных сахаров ставят в трубках Дун-242 бара (рис. 54),
в которые стерильно разливают приготовленную
питательную среду с разными сахарами и засевают изучаемыми культурами
дрожжей. После перемешивания содержимого трубок их ставят таким образом,
чтобы закрытое колено было направлено вверх, а открытое было в наклонном
положении. Трубки помещают в термостат, ежедневно просматривают, их
содержимое перемешивают и отмечают по выделению углекислоты и скоплению ее в
закрытом колене трубок усвоение сахара.
Бродильная и спиртообразующая способность. У выделенных чистых
культур винных дрожжей обычно в первую очередь определяется бродильная
способность (скорость и полнота сбраживания 18—20% сахара в виноградном
сусле).
Опыты по брожению ставят в колбах, закрытых пробками. Для выхода углекислоты
и предотвращения испарения бродящего сусла в пробке делают отверстие и
вставляют в него специальный бродильный затвор, а при его отсутствии —
стеклянную трубку с верхним концом, оттянутым в капилляр, или стеклянную
трубку с ватным тампоном, на верхний конец которой надевают резиновый
клапан. Для изготовления клапанов берут резиновый шланг такого же диаметра,
как стеклянная трубка, разрезают на отрезки длиной 5 см, делают на каждом
лезвием острой бритвы прорезь длиной около 1 см, надевают каждый на
стеклянную трубку, а верхний конец закрывают стеклянной бусинкой или
коротким отрезком стеклянной палочки. Углекислота, выделяющаяся при
брожении, будет выходить через прорезь в клапане.
В колбы наливают виноградное сусло на 2/3 их объема, закрывают колбы ватными
пробками и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром в течение 30 мин.
Когда сусло остынет, в него вносят разводки испытуемых культур дрожжей в
одинаковом количестве и одного возраста. Колбы закрывают пробками с
бродильными затворами, капиллярами или клапанами, взвешивают на технических
весах и ставят в термостат при температуре 25—28°С. Ежедневно колбы
взвешивают и по убыли в массе, которая соответствует количеству выделившейся
углекислоты, судят о скорости сбраживания сахара в сусле разными расами
дрожжей. Опыты с каждой культурой нужно ставить не менее чем в двух
повторностях. Конец брожения определяют по отсутствию изменения в массе
колб. По общему количеству выделившейся к концу брожения углекислоты
ориентировочно можно судить о полноте сбраживания сахара сусла.
Чтобы отобрать сильные культуры, обладающие наибольшей спиртообразующей
способностью, сбраживают сусло с содержанием сахаров 29—30%.
Спиртообразующую способность определяют по максимальному количеству спирта,
которое могут образовать расы при сбраживании высокосахаристого сусла. По
окончании брожения определяют содержание спирта. При изучении большого
количества культур и необходимости определения содержания спирта во многих
образцах удобно пользоваться флотационным методом определения спирта [202].
По точности он не уступает пикнометрическому, к его преимуществам относятся
быстрота определения и потребность малых количеств анализируемой жидкости.
Спиртовыносливость.
В большинстве случаев расы, обладающие высокой спиртообразующей
способностью, являются и спиртовыносливыми. Под спиртовыносливостью следует
понимать способность рас проявлять жизнедеятельность при высоких
концентрациях спирта в среде.
Для определения спиртовыносливости рас дрожжей готовят разводки исследуемых
рас на пастеризованном вине, содержащем 10—11% об. спирта и 2% глюкозы при
температуре 25°С. Через 5 сут разводку каждой расы дрожжей вносят в
количестве 1% в пропастеризованное вино, содержащее 15% об. спирта и 2%
глюкозы. Вино выдерживают при температуре 25°С и отмечают, на какие сутки в
нем размножились дрожжи и оно начало забраживать. Опыты удобно ставить в
пенициллиновых склянках, закрытых резиновыми пробками. Наиболее
спиртовыносливыми являются расы дрожжей, ранее других размножившиеся в вине
с 15% об. спирта, наименее спиртовыносливые расы в таком вине не
размножаются.
Холодо- и
термостойкость. Брожение сусла при температурах ниже 10°С и выше 30°С
часто заканчивается недобродом, т. е. неполным сбраживанием сахаров
виноградного сусла. Недоброды дают некондиционный виноматериал, склонный к
заболеваниям. Чтобы избежать этого, для сбраживания сусла при низких и
высоких температурах целесообразно применять холодо- и термовыносливые расы
дрожжей.
Для отбора холодовыносливых культур изучают бродильную способность (скорость
и полноту сбраживания 18—20% сахаров в виноградном сусле) при температуре
7°С и отбирают те расы, которые начинают размножаться и сбраживают сусло
быстрее и полнее других.
Для отбора термовыносливых культур изучают бродильную способность при
температуре 35°С и отбирают те расы дрожжей, которые начинают размножаться и
сбраживают сусло быстрее и полнее других при этой температуре.
Методика постановки опытов и контроль за ходом брожения описаны в разделе
«Определение бродильной и спиртообразующей способности». Целесообразно при
отборе новых холодо- и термовыносливых рас дрожжей в качестве контроля брать
музейные расы, обладающие этими свойствами.
Сульфитостойкость. Для сравнительного изучения сульфито-стойкости
различных культур дрожжей их нужно подвергнуть действию одинаковой дозы
свободной SO2. Сульфитостойкие расы можно отбирать по скорости забраживания
виноградного сусла, содержащего 100 мг/л свободной SO2 в момент внесения в
сусло разводок изучаемых культур.
Вначале проводят пробную сульфитацию сусла разными дозами SO2 и выбирают
такую, при которой через час после внесения S02 в сусло в нем будет
содержаться около 100 мг/л свободной сернистой кислоты. Сразу после
сульфитации содержание ее быстро уменьшается, так как она вступает в
соединение с составными частями сусла (сахарами, альдегидами и др.)> а
спустя 1—2 ч ее количество уже заметно не меняется. Затем сульфи-тируют
сусло выбранной дозой S02 в склянке вместимостью 2 л с нижним тубусом,
склянку закрывают, сусло перемешивают и оставляют на час.
За это время в стерильные небольшого объема склянки, размеченные до
стерилизации по 20 мл, вносят по 0,2 мл двухсуточных разводок исследуемых
рас дрожжей. Каждую культуру вносят в три склянки, т. е. опыты ставят в трех
повторностях.
Через час после сульфитации сусло из 2-литровой. склянки разливают через
нижний тубус по 20 мл в склянки быстро, но осторожно, чтобы оно не
разбрызгивалось. Для предотвращения улетучивания S02 склянки закрывают
резиновыми пробками, обработанными спиртом, и затем ставят в термостат при
температуре 27°С. При такой постановке опыта все культуры дрожжей
подвергаются действию одинаковой дозы свободной S02. Ежедневно в течение 10
дней опытные склянки просматривают и отбирают сульфитостойкие расы дрожжей
по скорости размножения и забраживания сусла.
Быстрее и проще можно определять сульфитостойкость по скорости размножения
штаммов дрожжей на сульфитирован-ном виноградном сусло-агаре в чашках Петри
[207]. Виноградное сусло перед розливом в чашки Петри смешивают с равным
количеством 3%-ного водного агара. В связи с невозможностью определять
содержание сернистой кислоты в сусло-агаре для подбора дозы сульфитации
виноградное сусло в нескольких контрольных порциях смешивают с таким же
количеством водопроводной воды (вместо 3%-ного водного агара). Разбавленное
сусло в склянках сульфитируют несколькими дозами крепкого водного раствора
сернистой кислоты для того, чтобы можно было выбрать дозу сульфитации, при
которой через час после внесения S02 в сусле, а также в сусло-агаре будет
содержаться около 100 мг/л свободной сернистой кислоты. Содержание свободной
сернистой кислоты определяют йодометрическим методом.
Штаммы исследуемых дрожжей предварительно выращивают в течение 2 сут в
виноградном сусле при температуре 27°С, а затем уколом иглы наносят на
поверхность сульфитированного сусло-агара в количестве 25 штаммов на чашку.
Кончик иглы при этом погружают в разводки исследуемых культур примерно на 1
см. Чашки с посевами помещают в термостат и выдерживают при температуре
27°С. Ежедневно в течение недели просматривают чашки и отбирают
сульфитостойкие штаммы, колонии которых вырастают раньше.
Первичный отбор проводится при содержании свободной сернистой кислоты 100
мг/л, а затем наиболее сульфитостойкие штаммы отбирают при содержании ее 150
мг/л.
Кислотовыносливость. В годы, неблагоприятные для вызревания
винограда, отдельные его партии могут поступать на переработку при величине
pH сусла 2,5—2,9. Имеются наблюдения, что не все расы дрожжей могут
полностью сбродить сахар в сусле с такой низкой кислотностью. Чтобы получить
полностью вы-броженные высококислотные виноматериалы, рекомендуется
применять кислотовыносливые расы дрожжей.
Для отбора кислотовыносливых культур необходимо определять их бродильную
способность в сусле с величиной pH 2,6 и содержанием сахаров 18% при
температуре 25°—27°С. При отсутствии в лаборатории сусла с такими кондициями
его можно получить подкислением 10%-ным раствором винной кислоты и
разбавлением водой обычного сусла с более высокой концентрацией сахаров и
меньшей кислотностью. Отбирают те расы дрожжей, которые начинают
размножаться и сбраживают сусло быстрее и полнее других. В конце брожения
необходимо определить остаточные сахара, чтобы убедиться в полном
выбраживании их в сусле с pH 2,6 отобранной культурой.
Ранее был предложен метод отбора кислотовыносливых рас дрожжей, основанный
на нефелометрическом определении интенсивности роста культур, выращиваемых в
тонком слое виноградного сусла с величиной pH 2,5—2,7 [127]. Однако этот
метод позволяет отбирать культуры, образующие биомассу с большим количеством
сухих веществ, которая зависит не только от числа клеток, но и от их
размеров, формы, различной проницаемости плазмы и т. д. Как показали
проведенные нами исследования, культуры, образующие биомассу с большим
количеством сухих веществ, могут быть слабобродящими и менее
кислотовыносливыми, чем культуры с биомассой, содержащей меньше сухих
веществ [201]. Поэтому отбирать кислотовыносливые расы дрожжей этим методом
нельзя, а нужно отбирать их по бродильной способности в сусле с pH 2,6.
Определение фенотипов киллер, нейтральный, чувствительный. При
описании различий между расами винных дрожжей сообщалось о том, что все
дрожжи-сахаромицеты принадлежат к одному из трех фенотипов: убийца (киллер
К), нейтральный (N) или чувствительный (5).
Применение рас дрожжей определенных фенотипов (К, N или 5) позволяет
проконтролировать, в какой степени чистая культура, внесенная в нестерильное
виноградное сусло, овладела средой. Для этого необходимо определить
процентное содержание дрожжей фенотипов К, N, S в спонтанно сбраживаемом
сусле (контроль) и в отстоенном сусле, забродившем при внесении в него
разводки чистой культуры дрожжей определенного фенотипа.
Металлургия определения фенотипов К, N, S состоит в следующем. В чашки Петри
разливают 1,5%-ный виноградный сусло-агар за 2—3 сут до использования, чтобы
он слегка подсох и затем хорошо впитывал нанесенные на него дрожжевые
суспензии. Для предотвращения гидролиза агара его 3%-ный водный раствор
стерилизуют отдельно от виноградного сусла и смешивают при температуре
60—70°С в равных количествах. Для лучшей контрастности зон, подавления роста
чувствительных культур в расплавленную среду можно добавлять перед розливом
в чашки Петри стерильный 0,5%-ный водный раствор метиленового синего в
количестве 1 мл на 200 мл среды.
Отдельную колонию штамма дрожжей, фенотип которого необходимо определить,
изолируют иглой с плотной питательной среды и примерно в равном соотношении
переносят на внутреннюю стенку пробирки с 0,5 мл стерильной водопроводной
воды и уколом — на чашку Петри с газоном культуры фенотипа S.
На одну чашку можно нанести в определенной последовательности до 30 уколов
исследуемых штаммов (рис. 55).
Стерильно готовят водные суспензии тех же колоний в пробирках с 0,5 мл
водопроводной воды и на других чашках Петри с виноградным сусло-агаром (без
газона штамма фенотипа S) делают петлей газоны исследуемых штаммов дрожжей
диаметром около 1,5 см. На них в центр наносят уколом штамм фенотипа К,
предварительно выращенный на виноградном сусло-агаре. На одну чашку можно
нанести газоны десяти исследуемых штаммов в той же последовательности, что и
на газоне штамма фенотипа S (рис. 56), Через 2 сут инкубации чашек Петри с
посевами при температуре 25—28°С определяют фенотипы штаммов. Если вокруг
колоний образовались зоны на газоне чувствительного штамма, то штаммы
идентифицируются как киллеры. Штаммы, на газонах которых киллер образует
зоны, являются чувствительными, остальные — нейтральные.
В качестве тестеров (индикаторных культур) можно использовать расы Берегово
4—7 (киллер) и Кахури 7 (чувствительная) вида Sacch. vini, имеющиеся в
коллекции культур Всесоюзного научно-исследовательского института виноделия
и виноградарства «Магарач».