ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ СВОЙСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ Главная     Книги по виноделию     Микробиология виноделия Н. И. Бурьян Л. В. Тюрина

 поиск по сайту     

 

 

 

 

содержание   ..  60  61  62  63  64  65  66  67  68 

 

 

ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ СВОЙСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ

Дрожжи


Спорообразование. Форма спор, способ их образования и прорастания являются родовыми признаками дрожжей. Поэтому при определении систематического положения выделенных культур дрожжей их высевают на специальные среды для спорообразования.

 

 

 

 

Для получения спор у дрожжей было предложено много разных сред [90]. В настоящее время для получения спор наиболее распространенным является прием выращивания дрожжей в течение 1—2 сут на полной среде, а затем пересев их на среду с ацетатом [63].
 

 


Состав полной среды (в г на 1 л воды):

Пептон                                   10
Дрожжевой экстракт               5

Глюкоза                                 20
Агар                                          20

Стерилизацию проводят в течение 30 мин при давлении 0,08 МПа.
 

 


Состав среды с ацетатом (в г на 1 л воды):

Ацетат натрия            10
Хлористый калий       5
Агар                            20
 

 


Стерилизацию ведут в течение 30 мин при давлении ОД МПа.

Усвоение сахаров. Изучение усвоения различных сахаров необходимо для определения видовой принадлежности дрожжей.

Готовят дрожжевой отвар (200 г прессованных хлебопекарных дрожжей в 1 л водопроводной воды) или полную жидкую среду без глюкозы и агара (пептон — 10 г, дрожжевой экстракт — 5 г, вода — 1л). Среду фильтруют, разливают по склянкам, в каждую из них добавляют по 2% одного из сахаров (глюкозы, галактозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, рафинозы) и стерилизуют либо 3 дня подряд в кипятильнике Коха, либо в автоклаве при давлении 0,05 МПа в течение 20—30 мин.

Опыты по усвоению различных сахаров ставят в трубках Дун-242 бара (рис. 54), в которые стерильно разливают приготовленную

 

питательную среду с разными сахарами и засевают изучаемыми культурами дрожжей. После перемешивания содержимого трубок их ставят таким образом, чтобы закрытое колено было направлено вверх, а открытое было в наклонном положении. Трубки помещают в термостат, ежедневно просматривают, их содержимое перемешивают и отмечают по выделению углекислоты и скоплению ее в закрытом колене трубок усвоение сахара.

 

 

 

Бродильная и спиртообразующая способность. У выделенных чистых культур винных дрожжей обычно в первую очередь определяется бродильная способность (скорость и полнота сбраживания 18—20% сахара в виноградном сусле).

Опыты по брожению ставят в колбах, закрытых пробками. Для выхода углекислоты и предотвращения испарения бродящего сусла в пробке делают отверстие и вставляют в него специальный бродильный затвор, а при его отсутствии — стеклянную трубку с верхним концом, оттянутым в капилляр, или стеклянную трубку с ватным тампоном, на верхний конец которой надевают резиновый клапан. Для изготовления клапанов берут резиновый шланг такого же диаметра, как стеклянная трубка, разрезают на отрезки длиной 5 см, делают на каждом лезвием острой бритвы прорезь длиной около 1 см, надевают каждый на стеклянную трубку, а верхний конец закрывают стеклянной бусинкой или коротким отрезком стеклянной палочки. Углекислота, выделяющаяся при брожении, будет выходить через прорезь в клапане.

В колбы наливают виноградное сусло на 2/3 их объема, закрывают колбы ватными пробками и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром в течение 30 мин. Когда сусло остынет, в него вносят разводки испытуемых культур дрожжей в одинаковом количестве и одного возраста. Колбы закрывают пробками с бродильными затворами, капиллярами или клапанами, взвешивают на технических весах и ставят в термостат при температуре 25—28°С. Ежедневно колбы взвешивают и по убыли в массе, которая соответствует количеству выделившейся углекислоты, судят о скорости сбраживания сахара в сусле разными расами дрожжей. Опыты с каждой культурой нужно ставить не менее чем в двух повторностях. Конец брожения определяют по отсутствию изменения в массе колб. По общему количеству выделившейся к концу брожения углекислоты ориентировочно можно судить о полноте сбраживания сахара сусла.

Чтобы отобрать сильные культуры, обладающие наибольшей спиртообразующей способностью, сбраживают сусло с содержанием сахаров 29—30%. Спиртообразующую способность определяют по максимальному количеству спирта, которое могут образовать расы при сбраживании высокосахаристого сусла. По окончании брожения определяют содержание спирта. При изучении большого количества культур и необходимости определения содержания спирта во многих образцах удобно пользоваться флотационным методом определения спирта [202]. По точности он не уступает пикнометрическому, к его преимуществам относятся быстрота определения и потребность малых количеств анализируемой жидкости.
 

 

Спиртовыносливость. В большинстве случаев расы, обладающие высокой спиртообразующей способностью, являются и спиртовыносливыми. Под спиртовыносливостью следует понимать способность рас проявлять жизнедеятельность при высоких концентрациях спирта в среде.

Для определения спиртовыносливости рас дрожжей готовят разводки исследуемых рас на пастеризованном вине, содержащем 10—11% об. спирта и 2% глюкозы при температуре 25°С. Через 5 сут разводку каждой расы дрожжей вносят в количестве 1% в пропастеризованное вино, содержащее 15% об. спирта и 2% глюкозы. Вино выдерживают при температуре 25°С и отмечают, на какие сутки в нем размножились дрожжи и оно начало забраживать. Опыты удобно ставить в пенициллиновых склянках, закрытых резиновыми пробками. Наиболее спиртовыносливыми являются расы дрожжей, ранее других размножившиеся в вине с 15% об. спирта, наименее спиртовыносливые расы в таком вине не размножаются.

 

 

Холодо- и термостойкость. Брожение сусла при температурах ниже 10°С и выше 30°С часто заканчивается недобродом, т. е. неполным сбраживанием сахаров виноградного сусла. Недоброды дают некондиционный виноматериал, склонный к заболеваниям. Чтобы избежать этого, для сбраживания сусла при низких и высоких температурах целесообразно применять холодо- и термовыносливые расы дрожжей.

Для отбора холодовыносливых культур изучают бродильную способность (скорость и полноту сбраживания 18—20% сахаров в виноградном сусле) при температуре 7°С и отбирают те расы, которые начинают размножаться и сбраживают сусло быстрее и полнее других.

Для отбора термовыносливых культур изучают бродильную способность при температуре 35°С и отбирают те расы дрожжей, которые начинают размножаться и сбраживают сусло быстрее и полнее других при этой температуре.

Методика постановки опытов и контроль за ходом брожения описаны в разделе «Определение бродильной и спиртообразующей способности». Целесообразно при отборе новых холодо- и термовыносливых рас дрожжей в качестве контроля брать музейные расы, обладающие этими свойствами.
 

 

 

Сульфитостойкость. Для сравнительного изучения сульфито-стойкости различных культур дрожжей их нужно подвергнуть действию одинаковой дозы свободной SO2. Сульфитостойкие расы можно отбирать по скорости забраживания виноградного сусла, содержащего 100 мг/л свободной SO2 в момент внесения в сусло разводок изучаемых культур.

 

 

Вначале проводят пробную сульфитацию сусла разными дозами SO2 и выбирают такую, при которой через час после внесения S02 в сусло в нем будет содержаться около 100 мг/л свободной сернистой кислоты. Сразу после сульфитации содержание ее быстро уменьшается, так как она вступает в соединение с составными частями сусла (сахарами, альдегидами и др.)> а спустя 1—2 ч ее количество уже заметно не меняется. Затем сульфи-тируют сусло выбранной дозой S02 в склянке вместимостью 2 л с нижним тубусом, склянку закрывают, сусло перемешивают и оставляют на час.

За это время в стерильные небольшого объема склянки, размеченные до стерилизации по 20 мл, вносят по 0,2 мл двухсуточных разводок исследуемых рас дрожжей. Каждую культуру вносят в три склянки, т. е. опыты ставят в трех повторностях.

Через час после сульфитации сусло из 2-литровой. склянки разливают через нижний тубус по 20 мл в склянки быстро, но осторожно, чтобы оно не разбрызгивалось. Для предотвращения улетучивания S02 склянки закрывают резиновыми пробками, обработанными спиртом, и затем ставят в термостат при температуре 27°С. При такой постановке опыта все культуры дрожжей подвергаются действию одинаковой дозы свободной S02. Ежедневно в течение 10 дней опытные склянки просматривают и отбирают сульфитостойкие расы дрожжей по скорости размножения и забраживания сусла.

Быстрее и проще можно определять сульфитостойкость по скорости размножения штаммов дрожжей на сульфитирован-ном виноградном сусло-агаре в чашках Петри [207]. Виноградное сусло перед розливом в чашки Петри смешивают с равным количеством 3%-ного водного агара. В связи с невозможностью определять содержание сернистой кислоты в сусло-агаре для подбора дозы сульфитации виноградное сусло в нескольких контрольных порциях смешивают с таким же количеством водопроводной воды (вместо 3%-ного водного агара). Разбавленное сусло в склянках сульфитируют несколькими дозами крепкого водного раствора сернистой кислоты для того, чтобы можно было выбрать дозу сульфитации, при которой через час после внесения S02 в сусле, а также в сусло-агаре будет содержаться около 100 мг/л свободной сернистой кислоты. Содержание свободной сернистой кислоты определяют йодометрическим методом.

Штаммы исследуемых дрожжей предварительно выращивают в течение 2 сут в виноградном сусле при температуре 27°С, а затем уколом иглы наносят на поверхность сульфитированного сусло-агара в количестве 25 штаммов на чашку. Кончик иглы при этом погружают в разводки исследуемых культур примерно на 1 см. Чашки с посевами помещают в термостат и выдерживают при температуре 27°С. Ежедневно в течение недели просматривают чашки и отбирают сульфитостойкие штаммы, колонии которых вырастают раньше.

Первичный отбор проводится при содержании свободной сернистой кислоты 100 мг/л, а затем наиболее сульфитостойкие штаммы отбирают при содержании ее 150 мг/л.
 

 

 

 

Кислотовыносливость. В годы, неблагоприятные для вызревания винограда, отдельные его партии могут поступать на переработку при величине pH сусла 2,5—2,9. Имеются наблюдения, что не все расы дрожжей могут полностью сбродить сахар в сусле с такой низкой кислотностью. Чтобы получить полностью вы-броженные высококислотные виноматериалы, рекомендуется применять кислотовыносливые расы дрожжей.

Для отбора кислотовыносливых культур необходимо определять их бродильную способность в сусле с величиной pH 2,6 и содержанием сахаров 18% при температуре 25°—27°С. При отсутствии в лаборатории сусла с такими кондициями его можно получить подкислением 10%-ным раствором винной кислоты и разбавлением водой обычного сусла с более высокой концентрацией сахаров и меньшей кислотностью. Отбирают те расы дрожжей, которые начинают размножаться и сбраживают сусло быстрее и полнее других. В конце брожения необходимо определить остаточные сахара, чтобы убедиться в полном выбраживании их в сусле с pH 2,6 отобранной культурой.

Ранее был предложен метод отбора кислотовыносливых рас дрожжей, основанный на нефелометрическом определении интенсивности роста культур, выращиваемых в тонком слое виноградного сусла с величиной pH 2,5—2,7 [127]. Однако этот метод позволяет отбирать культуры, образующие биомассу с большим количеством сухих веществ, которая зависит не только от числа клеток, но и от их размеров, формы, различной проницаемости плазмы и т. д. Как показали проведенные нами исследования, культуры, образующие биомассу с большим количеством сухих веществ, могут быть слабобродящими и менее кислотовыносливыми, чем культуры с биомассой, содержащей меньше сухих веществ [201]. Поэтому отбирать кислотовыносливые расы дрожжей этим методом нельзя, а нужно отбирать их по бродильной способности в сусле с pH 2,6.

 

 

 

Определение фенотипов киллер, нейтральный, чувствительный. При описании различий между расами винных дрожжей сообщалось о том, что все дрожжи-сахаромицеты принадлежат к одному из трех фенотипов: убийца (киллер К), нейтральный (N) или чувствительный (5).

Применение рас дрожжей определенных фенотипов (К, N или 5) позволяет проконтролировать, в какой степени чистая культура, внесенная в нестерильное виноградное сусло, овладела средой. Для этого необходимо определить процентное содержание дрожжей фенотипов К, N, S в спонтанно сбраживаемом сусле (контроль) и в отстоенном сусле, забродившем при внесении в него разводки чистой культуры дрожжей определенного фенотипа.

 

 

 

 

 

Металлургия определения фенотипов К, N, S состоит в следующем. В чашки Петри разливают 1,5%-ный виноградный сусло-агар за 2—3 сут до использования, чтобы он слегка подсох и затем хорошо впитывал нанесенные на него дрожжевые суспензии. Для предотвращения гидролиза агара его 3%-ный водный раствор стерилизуют отдельно от виноградного сусла и смешивают при температуре 60—70°С в равных количествах. Для лучшей контрастности зон, подавления роста чувствительных культур в расплавленную среду можно добавлять перед розливом в чашки Петри стерильный 0,5%-ный водный раствор метиленового синего в количестве 1 мл на 200 мл среды.

Отдельную колонию штамма дрожжей, фенотип которого необходимо определить, изолируют иглой с плотной питательной среды и примерно в равном соотношении переносят на внутреннюю стенку пробирки с 0,5 мл стерильной водопроводной воды и уколом — на чашку Петри с газоном культуры фенотипа S.

На одну чашку можно нанести в определенной последовательности до 30 уколов исследуемых штаммов (рис. 55).

Стерильно готовят водные суспензии тех же колоний в пробирках с 0,5 мл водопроводной воды и на других чашках Петри с виноградным сусло-агаром (без газона штамма фенотипа S) делают петлей газоны исследуемых штаммов дрожжей диаметром около 1,5 см. На них в центр наносят уколом штамм фенотипа К, предварительно выращенный на виноградном сусло-агаре. На одну чашку можно нанести газоны десяти исследуемых штаммов в той же последовательности, что и на газоне штамма фенотипа S (рис. 56), Через 2 сут инкубации чашек Петри с посевами при температуре 25—28°С определяют фенотипы штаммов. Если вокруг колоний образовались зоны на газоне чувствительного штамма, то штаммы идентифицируются как киллеры. Штаммы, на газонах которых киллер образует зоны, являются чувствительными, остальные — нейтральные.

В качестве тестеров (индикаторных культур) можно использовать расы Берегово 4—7 (киллер) и Кахури 7 (чувствительная) вида Sacch. vini, имеющиеся в коллекции культур Всесоюзного научно-исследовательского института виноделия и виноградарства «Магарач».