Для определения количества микроорганизмов в 1 мл жидкости производят
подсчет их под микроскопом в счетной камере (Тома-Цейса, Горяева, Бюркера
или Предтеченского). Счетная камера имеет вид толстого предметного стекла, в
центре которого находится стеклянная пластинка с выгравированной на ней
сеткой (или 2 сетки на разделенной пополам пластинке). Справа и слева от
центральной пластинки находятся 2 другие стеклянные пластинки с уровнем на
0,1 мм выше.
После тщательного перемешивания исследуемой жидкости
берут каплю ее сухой стеклянной палочкой или петлей, наносят на сетку
счетной камеры, накрывают покровным стеклом размером 18X18 мм толщиной
0,25—0,35 мм и притирают покровное стекло к боковым пластинкам камеры.
Притирают покровное стекло для того, чтобы высота слоя исследуемой жидкости
в камере была 0,1 мм. Затем счетную камеру кладут на столик микроскопа и
находят в его поле зрения сетку. Легче ее находить под малым увеличением
(10X8). Затем, не двигая счетную камеру, делают увеличение в 400 раз (окуляр
ЮХобъектив 40). При таком увеличении в поле зрения микроскопа помещается
1 большой квадрат, состоящий из 16 маленьких квадратов или не разделенный на
маленькие квадраты.
Подсчитывают все клетки микроорганизмов, находящиеся внутри большого
квадрата, а также на пограничных линиях, если клетки большей половиной
находятся в данном квадрате. Клетки, большая половина которых находится в
другом квадрате, не подсчитываются. Если клетки пересекаются пограничной
линией пополам, то клетки считают только на двух смежных сторонах квадратов,
например, на левой и нижней.
В каждом препарате подсчитывают клетки в пяти больших квадратах, например,
по углам и в центре сетки. В слишком густых суспензиях считать
микроорганизмы трудно, поэтому их следует разбавлять водой и пользоваться
такими разведениями при которых количество клеток в одном большом квадрате
будет не более 30.
Для того чтобы результат подсчета был достоверен, необходимо сосчитать не
менее 600 микроорганизмов. Количество препаратов, в которых нужно подсчитать
микроорганизмы, будет зависеть от количества клеток в них. Так, если в пяти
больших квадратах одного препарата содержится около 150 клеток, то нужно
приготовить 4 препарата, чтобы общее количество сосчитанных клеток было
около 600 [108].
Объем одного большого квадрата во всех счетных камерах равен 7250 мм3,
соответственно объем 5 квадратов равен 5/250 или
7б0 мм3.
Чтобы определить количество клеток в 1 мл (в 1000 мм3) исследуемого
субстрата нужно среднюю сумму количества клеток, в пяти больших квадратах
умножить на 50 000.
Число микроорганизмов в 1 мл исследуемого субстрата (х) удобно определять по
формуле
х = а * 50000 *b,
где а — средняя сумма количества подсчитанных клеток в пяти больших
квадратах;
b — разведение исходной суспензии микроорганизмов;
50000 — коэффициент пересчета объема пяти больших квадратов на 1 мл.
Для подсчета общего количества клеток культур дрожжей,, образующих
конгломераты, рекомендуется в исследуемую пробу добавлять равное количество
10%-ной серной кислоты и тщательно ее перемешивать для разъединения
скоплений клеток. Подсчитывая результаты, следует учитывать разбавление
вдвое раствором серной кислоты.
При дифференцированном подсчете почкующихся, живых и мертвых клеток дрожжей
на сетку помещают каплю исследуемой дрожжевой суспензии, добавляют каплю
водного раствора метиленовой синей (1 : 10 000), перемешивают, накрывают
покровным стеклом, притирают его. Через 5 мин после приготовления препарата
подсчитывают отдельно количество почкующихся, живых и мертвых клеток.
Подсчитывая результаты, следует учитывать разбавление вдвое метиленовой
синей.