содержание .. 54 55 56 57 ..
ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год) - часть 56
Таблица 11.6
Процентные точки выборочного коэффициента корреляции r
P1 - вероятность того, что r < R или -R < r (односторонний критерий),
P2 - вероятность того, что коэффициент корреляцииї r находится в интервале
-R < r < R (двусторонний критерий)
Выборочный коэффициент корреляции r значимо (с надежностью P1 или P2) отлича-
ется от нуля, если его абсолютная величина Ír Í превышает табличное значение R(P,
n)
Вероятность P1 или P2
P1 Æ
95%
97.5%
99%
99.5%
99.75%
99.95%
P2 Æ
90%
95%
98%
99%
99.5%
99.9%
Число степеней
свободы n Ø
Значения R(P,n)
1
0,9877
0,99692
0,999507
0,999877
0,999969
0,999999
2
0,900
0,9500
0,9800
0,99000
0,99500
0,999000
3
0,805
0,878
0,9343
0,9587
0,9740
0,99114
4
0,729
0,811
0,882
0,9172
0,9417
0,9741
5
0,669
0,754
0,833
0,875
0,9056
0,9509
6
0,621
0,707
0,789
0,834
0,870
0,9249
7
0,582
0,666
0,750
0,798
0,836
0,898
8
0,549
0,632
0,715
0,765
0,805
0,872
9
0,521
0,602
0,685
0,735
0,776
0,847
10
0,497
0,576
0,658
0,708
0,750
0,823
11
0,476
0,553
0,634
0,684
0,726
0,801
12
0,457
0,532
0,612
0,661
0,703
0,780
13
0,441
0,514
0,592
0,641
0,683
0,760
14
0,426
0,497
0,574
0,623
0,664
0,742
15
0,412
0,482
0,558
0,606
0,647
0,725
16
0,400
0,468
0,543
0,590
0,631
0,708
17
0,389
0,456
0,529
0,575
0,616
0,693
18
0,378
0,444
0,516
0,561
0,602
0,679
19
0,369
0,433
0,503
0,549
0,589
0,665
20
0,360
0,423
0,492
0,537
0,576
0,652
25
0,323
0,381
0,445
0,487
0,524
0,597
30
0,296
0,349
0,409
0,449
0,484
0,554
35
0,275
0,325
0,381
0,418
0,452
0,519
40
0,257
0,304
0,358
0,393
0,425
0,490
45
0,243
0,288
0,338
0,372
0,403
0,465
50
0,231
0,273
0,322
0,354
0,384
0,443
60
0,211
0,250
0,295
0,325
0,352
0,408
70
0,195
0,232
0,274
0,302
0,327
0,380
80
0,183
0,217
0,257
0,283
0,307
0,357
90
0,173
0,205
0,242
0,267
0,290
0,338
100
0,164
0,195
0,230
0,254
0,276
0,321
#5.3.3. ВАЛИДАЦИЯ АНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДИК ИСПЫТАНИЙ
В статье описываются процедуры, применяемые для валидации методик и испы-
таний (Испытание - это аналитическая методика, описанная в частной статье, в сово-
купности с требованиями к получаемым по ней результатам. Результатом проведения
испытания является ответ на вопрос, соответствует или нет данное лекарственное
средство требованиям частной статьи), включаемых в общую статью Государственной
Фармакопеи Республики Беларусь и аналитическую нормативную документацию на ле-
карственные средства и вспомогательные вещества (частные статьи). Поскольку в ча-
стные статьи включаются различные инструментальные и не инструментальные ис-
пытания (определение подлинности, контроль примесей, количественное определение
и др.), требования к валидации испытания зависят от его типа и применяемого анали-
тического метода.
А. ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ,
ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ВАЛИДАЦИИ АНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДИК
1. Введение
Валидация аналитической методики — это экспериментальное доказательство
того, что методика пригодна для решения предполагаемых задач.
В данном разделе рассматриваются характеристики аналитических методик
(испытаний), подлежащие валидации (далее «валидационные характеристики»).
Валидационные характеристики методик, применяемые для целей иденти-
фикации, контроля примесей и количественного определения, приведены в
Табл. 1.
Таблица 1
Валидационные характеристики, рассматриваемые для различных ис-
пытаний и методик
Типы аналитических методик
Характеристики
Идентификация
Испытания на примеси
Количественное оп-
Растворение, опре-
деление только со-
Количественные
Предельные
держания, активно-
сти
Правильность
-
+
-
+
Точность:
+ +*
-
+
Сходимость Внутрила-
бораторная точность
+
*
Специфичность **
+
+
+
+
Предел обнаружения
-
* * *
+
-
Предел количест-
венного определе-
-
+
-
-
ния
Линейность
-
+
-
+
Диапазон применения
-
+
-
+
«-«
— характеристика обычно не исследуется;
«+» - характеристика обычно исследуется;
«*» — в тех случаях, когда проводится исследование воспроизводимости, исследова-
ние внутрилабораторной точности не требуется;
«**» — недостаток специфичности испытания можно компенсировать другим (други-
ми) дополнительным испытанием (см. п. 4.2);
«***»- может потребоваться в некоторых случаях (например, когда предел определе-
ния и нормируемый предел содержания определяемой примеси близки).
2. Аналитические испытания и методики, подлежащие валидации
В статье рассматривается проведение валидации для таких испытаний:
- испытаний на идентификацию;
- количественных испытаний для определения примесей;
- испытания на предельное содержание примесей;
- количественных испытаний для определения действующего вещества и других
компонентов (например, консервантов) в лекарственных субстанциях и гото-
вых лекарственных средствах.
Все аналитические методики и испытания, входящие в общие статьи Фарма-
копеи и аналитическую нормативную документацию, должны быть валидированы.
Однако для валидации некоторых испытаний, например, таких как «Растворение»
или «Определение размера частиц», могут потребоваться другие валидационные
процедуры, не описанные в общей статье.
КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИСПЫТАНИЙ
Испытания на идентификацию предназначены для подтверждения наличия
анализируемого вещества в образце. Обычно это достигается путем сравнения ка-
ких-либо свойств (например, спектральных характеристик, хроматографического
поведения, химической реакционной способности и т.д.) испытуемого и стандартно-
го образцов.
Испытания, предназначенные для контроля примесей могут быть как количе-
ственными, так и предельными. Назначение обоих испытаний — характеризовать
чистоту образца. Для валидации количественных и предельных испытаний необхо-
димы различные валидационные характеристики.
Количественное определение предназначено для определения анализируе-
мого вещества в образце. Такая же валидационная процедура может быть при-
менена к методике количественного определения, связанной с другим испыта-
нием (например, в испытании «Растворение»).
3.Валидационные характеристики и требования
Набор исследуемых валидационных характеристик зависит от назначения
аналитической методики. Типичные валидационные характеристики:
— правильность;
— точность;
— сходимость;
— внутрилабораторная точность;
— специфичность;
— предел обнаружения;
— предел количественного определения;
— линейность;
— диапазон применения.
Этот список следует рассматривать как типовой для указанных испытаний
(аналитических методик). Как правило, на стадии разработки методики изучается
также валидационная характеристика «робастность».
Повторное проведение валидации может потребоваться в следующих случа-
ях:
—изменение в синтезе лекарственной субстанции;
—изменение в составе готового лекарственного средства;
—изменения в аналитической методике.
Объем проведения повторной валидации определяется спецификой изменений.
Повторная валидация может требоваться и в иных случаях.
4.Словарь
Аналитическая методика (analytical procedure)
—это способ проведения
анализа, т.е. детальное изложение всех операций, необходимых для выполнения
испытания. Она включает в себя описание подготовки испытуемых образцов,
стандартов, реактивов; описание используемого оборудования с указанием па-
раметров; условия получения калибровочных кривых; использование расчетных
формул и т.д.
Специфичность (specificity) — способность однозначно оценивать анализи-
руемое вещество в присутствии других компонентов, которые могут присутствовать
в образце. Это могут быть примеси, продукты разложения, вспомогательные ве-
щества и т.д.
Недостаток специфичности испытания может быть компенсирован другим
(другими) дополнительным испытанием.
Специфичность для различных типов испытаний означает следующее:
Идентификация — доказательство того, что идентифицировано именно ана-
лизируемое вещество.
Испытания на примеси — доказательство того, что каждое испытание на
примеси позволяет однозначно характеризовать содержание примесей в образце
(например, испытания «Сопутствующие примеси», «Тяжелые металлы», «Содержа-
ние остаточных количеств органических растворителей» и др.)
Количественное определение (содержание или активность) — доказательство
того, что методика позволяет точно и правильно установить содержание или актив-
ность именно анализируемого вещества в образце.
Правильность (accuracy, trueness) характеризует степень соответствия между
известным истинным значением или справочной величиной и значением, получен-
ным поданной методике.
Точность (precision) аналитической методики выражает степень близости (или
степень разброса) результатов для серии измерений, выполненных по данной ме-
тодике на различных пробах одного и того же однородного образца. Точность мо-
жет рассматриваться на трех уровнях: сходимость, внутрилабораторная точность и
воспроизводимость.
Точность необходимо изучать на достоверно однородных образцах. Однако,
если однородный образец получить невозможно, то можно использовать его рас-
твор или модельные смеси.
Точность аналитической методики обычно характеризуют отклонением, стан-
дартным отклонением или относительным стандартным отклонением для серии из-
мерений.
Сходимость (repeatability) характеризует точность методики при ее выполнении
в одних и тех же условиях (в частности, одним и тем же аналитиком или группой
аналитиков) в течение небольшого промежутка времени.
Внутрилабораторная точность (intermediateprecision) характеризует влияние
внутрилабораторных вариаций: различные дни, различные аналитики, различное
оборудование и т.п. изменения.
Воспроизводимость (reproducibility) характеризует точность в межлабораторном
эксперименте.
Предел обнаружения для конкретной аналитической методики представляет
собой минимальное количество анализируемого вещества вобразце, которое мо-
жет быть обнаружено (при этом не обязательно должно быть определено точное
значение).
Предел количественного определения для аналитической методики пред-
ставляет собой минимальное количество анализируемого вещества в образце, ко-
торое может быть количественно определено с требуемой правильностью и точ-
ностью. Предел количественного определения является валидационной характе-
ристикой методик количественного определения малых концентраций веществ в
образце и рассматривается в основном при определении примесей и/или про-
дуктов разложения.
Линейность (linearity) — это способность методики (в пределах диапазона
применения) давать величины, прямо пропорциональные концентрации (количе-
ству) анализируемого вещества в образце.
Диапазоном применения (range) аналитической методики является интервал
между минимальной и максимальной концентрациями (количествами) анализи-
руемого вещества в образце (включая эти концентрации), для которого показано,
что аналитическая методика имеет требуемую точность, правильность и линей-
ность.
Робастность (robustness) - это способность аналитической методики не
подвергаться влиянию малых, задаваемых (контролируемых) аналитиком измене-
ний в условиях выполнения методики. Робастность является показателем
надежности методики при ее использовании в указанных условиях.
В. ПРОВЕДЕНИЕ ВАЛИДАЦИИ АНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДИК
1. Введение
Главной задачей валидации аналитической методики является эксперимен-
тальное доказательство того, что данная методика пригодна для достижения
тех целей, для которых она предназначена. В отчет по валидации должны быть
включены все данные, полученные в процессе валидации, и использованные
для расчетов формулы с соответствующим их обсуждением.
Подходы к проведению валидации методик анализа биологических и био-
технологических препаратов могут быть иными, чем указано в данной статье.
При проведении валидации необходимо использовать только стандартные
образцы с известными характеристиками, подтвержденными документально. Не-
обходимая степень их чистоты зависит от задач, которые решаются при их ис-
пользовании.
Последовательность рассмотрения валидационных характеристик отражает
процесс, по которому может разрабатываться и валидироваться аналитическая
методика. Однако целесообразно планировать эксперимент так, чтобы соот-
ветствующие валидационные характеристики изучались одновременно, например:
специфичность, линейность, диапазон применения, правильность и точность.
2. Специфичность
Исследование специфичности проводится при валидации испытаний на
идентификацию, контроль примесей и количественное определение. Способ под-
тверждения специфичности зависит от задач, для решения которых предназна-
чена аналитическая методика.
В тех случаях, когда методика недостаточно специфична, применяют соче-
тание двух или более аналитических методик для достижения необходимого
уровня избирательности.
2.1. Идентификация. Испытания на идентификацию должны обеспечивать
возможность различать соединения близкого строения, которые могут присут-
ствовать в образце совместно с определяемым компонентом. Избирательность
методики может быть подтверждена получением положительных результатов
(возможно, путем сравнения с известным стандартным образцом) для образцов,
содержащих определяемый компонент, и отрицательных результатов, полученных
для образцов, не содержащих его. Для подтверждения отсутствия ложноположи-
тельных результатов испытание на идентификацию может быть проверено для
веществ с близким строением, или сопутствующих анализируемому веществу. Вы-
бор потенциально мешающих проведению испытания веществ должен быть
обоснован.
2.2. Количественное определение и испытания на примеси. При валидации
хроматографических методик для подтверждения специфичности должны исполь-
зоваться характерные хроматограммы с указанием индивидуальных веществ.
Аналогичный подход используют и для других методов разделения.
Для хроматографических методик степень разделения должна быть иссле-
дована для соответствующих концентраций веществ. Для подтверждения специ-
фичности может быть использована степень разделения двух наиболее близко
элюирущихся веществ.
В случае использования неспецифичного метода количественного опреде-
ления необходимо применять дополнительные аналитические методики и под-
тверждать специфичность всего комплекса методик. Например, если количест-
венное определение проводится титриметрическим методом, то его можно допол-
нить соответствующим испытанием на примеси.
Для количественного определения и для испытаний на примеси применяют
одинаковые подходы, описанные ниже.
2.2.1. Образцы примесей имеются. Для метода количественного определения
необходимо подтвердить избирательность определения анализируемого вещест-
ва в присутствии примесей и/или других компонентов образца. Это можно сде-
лать внесением в образец (субстанцию или лекарственное средство) примесей
и/или других компонентов образца в соответствующей концентрации и последую-
щего доказательства того, что это не отразилось на получаемом результате (путем
сравнения результатов, полученных на исходном и загрязненном образцах).
Для испытаний на чистоту подтверждение избирательности проводят путем
загрязнения субстанции или готового лекарственного средства соответствующи-
ми количествами примесей и доказательства разделения этих примесей как
друг от друга, так и от других компонентов образца.
2.2.2. Образцы примесей отсутствуют. В случае, если образцы примесей
или продуктов разложения отсутствуют, подтверждение специфичности проводят
путем сравнения результатов анализа образцов, содержащих примеси или продук-
ты разложения, предлагаемой методикой и другой арбитражной методикой. В ка-
честве последней может быть использована фармакопейная методика или другая
валидированная методика. Этот подход предполагает предварительное загрязне-
ние образца продуктами разложения путем выдерживания его в стрессовых усло-
виях: воздействие света, тепла, влажности, гидролиза, окисления и т.п.
При валидации количественного определения следует сравнить результа-
ты анализов, полученных с использованием валидируемой и арбитражной методик.
При валидации испытания на чистоту следует сравнить результаты опре-
деления примесей, полученные с использованием валидируемой и арбитражной
методик.
Для доказательства того, что пик анализируемого вещества соответствует
только одному компоненту, используют тесты на чистоту пиков, например, с ис-
пользованием диодноматричного детектирования, масс-спектрометрии и др.
3.
Линейность
Линейная зависимость должна быть исследована в пределах диапазона при-
менения аналитической методики. Она может быть подтверждена непосредствен-
но на субстанции (путем разбавления исходного раствора) или, для лекарственных
средств, на модельных смесях с использованием соответствующей процедуры.
По полученным данным строят график зависимости сигнала как функции
концентрации или количества определяемого компонента и визуально оценивают
его линейность. Если линейная зависимость наблюдается, то результаты обраба-
тывают подходящим статистическим методом, например, методом наименьших
квадратов. В некоторых случаях для получения линейности данные следует под-
вергнуть предварительному математическому преобразованию. Должны быть опре-
делены и представлены: коэффициент корреляции, точка пересечения с осью ор-
динат, тангенс угла наклона прямой и остаточная сумма квадратов отклонений, а
также график со всеми экспериментальными данными. Для оценки линейности мо-
гут понадобиться отклонения экспериментальных данных от прямой.
Некоторые аналитические методики, например, иммуноаналитические, не по-
казывают линейности ни при каких математических преобразованиях. В таких слу-
чаях аналитический отклик должен быть описан подходящей функцией концен-
трации анализируемого вещества в образце.
Для подтверждения линейности используют не менее пяти концентраций.
Другие подходы должны быть обоснованы.
4.
Диапазон применения
Диапазон применения методики зависит от ее предназначения и опреде-
ляется при изучении линейности. В пределах диапазона применения методика
должна обеспечивать требуемую линейность, правильность и точность.
Минимальные допустимые диапазоны применения методик:
- Для количественного определения лекарственных субстанций или лекарст-
венных форм - от 80% до 120% от номинального содержания.
- Для однородности дозирования - от 70% до 130% от номинального содер-
жания, если для испытания не требуется более широкий интервал (например, для
дозированных аэрозолей).
- Для испытаний на растворение - ±20% (абсолютных) от нормируемой вели-
чины высвобождения. Например, если при контроле высвобождения пролонги-
рованных лекарственных средств нормируемая величина высвобождения состав-
ляет от 20% за первый час и до 90% за 24 ч, то диапазон применения должен
быть от О% до 110% от номинального содержания.
- Для определения примесей - от концентрации, в которой примесь обычно
обнаруживается, до120% от нормируемого содержания.
Для примесей, обладающих чрезвычайно сильным действием или имеющих
токсический или непредсказуемый фармакологический эффект, предел детекти-
рования/количественного определения должен соответствовать тому уровню кон-
центрации, на котором эти примеси должны контролироваться.
Примечание: при проведении валидации испытания на примеси непосредст-
венно в процессе разработки методики необходимо определить диапазон приме-
нения, внутри которого находится предполагаемый предел нормирования приме-
сей.
В случае, если количественное определение и испытание на примеси вы-
полняются совместно, как одно испытание и используется только стандарт основ-
ного вещества, соответствующий его номинальному содержанию, то диапазон при-
менения должен охватывать диапазон концентрации от нормируемого содержа-
ния примеси до 120% от номинального содержания основного вещества.
5. Правильность
Правильность изучают в пределах диапазона применения аналитической ме-
тодики.
5.1. Количественное определение
5.1.1. Субстанции. Могут использоваться следующие способы определения
правильности:
- применение аналитической методики к образцу с известной степенью чистоты,
например, к стандартному образцу;
- сравнение результатов анализа, полученных с использованием валидируемой
методики и арбитражного метода, правильность и точность которого известны
(использование независимого метода, см. п. 2.2.);
- заключение о правильности можно сделать после того, как установлены точ-
ность, линейность и специфичность.
5.1.2. Готовые лекарственные средства. Могут использоваться следующие
способы определения правильности:
—применение методики к искусственным смесям, к которым были добавлены из-
вестные количества анализируемого вещества;
—в случае, когда невозможно получить образцы всех компонентов лекарственно-
го средства, возможно применение метода добавок или арбитражной методики,
правильность которой доказана (см. п. 2.2.);
—заключение о правильности можно сделать после того, как установлены точ-
ность, линейность и специфичность.
5.2. Примеси (количественное содержание).
Правильность изучают на образцах (субстанции или готового лекарственно-
го средства) с добавленным известным количеством примесей.
Если примеси или продукты разложения недоступны, применяют арбит-
ражный метод (см. п. 2.2.). Если примеси неизвестны, то чувствительность их оп-
ределения может быть принята равной чувствительности определения субстан-
ции. В случае, если чувствительность определения субстанции и примеси сущест-
венно отличается, вводят коэффициент пересчета.
Должен быть указан конкретный способ нормирования содержания приме-
сей, например, в массовых процентах, в процентах по отношению к площади пика
главного компонента или др.
5.3. Представление данных. Правильность оценивают не менее чем для девяти
определений для трех различных концентраций, охватывающих весь диапазон
применения, т.е. три концентрации и три определения для каждой концентрации.
Определения должны включать все стадии методики.
Правильность выражают в процентах найденного значения от введенного
или как разность между средним и истинным значением с учетом соответствующих
доверительных интервалов.
6. Точность. Валидационная характеристика «точность» изучается для методик ко-
личественного определения.
6.1. Сходимость. Сходимость изучают, выполняя:
— не менее девяти определений, охватывающих диапазон применения ме-
тодики (три концентрации/три повтора) или
— не менее шести определений для образцов с содержанием анализируемого
вещества, близким к номинальному.
6.2. Внутрилабораторная точность. Установливают влияние случайных факторов на
точность валидируемой аналитической методики. Типичными исследуемыми факто-
рами являются различные дни, различные аналитики, различное оборудование и т.п.
При изучении влияния различных факторов предпочтительно использовать планиро-
вание эксперимента.
6.3. Воспроизводимость. Воспроизводимость оценивают путем проведения межлабо-
раторных исследований. Воспроизводимость должна быть изучена при включении
методики в Фармакопею.
6.4. Представление данных. При изучении точности должны представляться: стан-
дартное отклонение, относительное стандартное отклонение и доверительный интер-
вал.
7. Предел обнаружения
В зависимости от того, является ли методика инструментальной или не инстру-
ментальной, возможны различные подходы для определения предела обнаружения.
Используются следующие подходы.
7.1. Визуальная оценка. Визуальную оценку используют как для не инструмен-
тальных, так и для инструментальных методов.
Предел обнаружения устанавливают путем анализа образцов с известными
концентрациями анализируемого вещества и оценкой минимального содержания, при
котором анализируемое вещество надежно определяется.
7.2. Соотношение Сигнал/Шум. Этот подход применим только к тем методам, для
которых наблюдается шум базовой линии. Для определения соотношения сигнал/шум
сравнивают величины сигналов, полученные для контрольного опыта и для образцов с
низкими концентрациями анализируемого вещества. На основании полученных дан-
ных устанавливают минимальную концентрацию, для которой величина отношения
сигнал/шум составляет обычно от трех до двух.
7.3. Использование калибровочной прямой и стандартного отклонения аналити-
ческого сигнала. Предел обнаружения (ПО) может быть выражен как:
d
МВ
=
,
¥
(1)
S
где:
δ - стандартное отклонение сигнала,
S - тангенс угла наклона калибровочной прямой.
Значение тангенса угла наклона калибровочной прямой вычисляют из калибро-
вочной прямой для анализируемого вещества. Оценка стандартного отклонения сигна-
ла может быть проведена многими способами, например следующими.
7.3.1. Использование стандартного отклонения сигнала для контрольного
опыта. Измеряют величину аналитического сигнала для необходимого числа образ-
цов, не содержащих анализируемое вещество, и вычисляют стандартное отклонение.
7.3.2. Использование калибровочной прямой. Получают калибровочную прямую
для образцов с содержанием анализируемого вещества, близким к пределу обнаруже-
ния, и вычисляют ее параметры. В качестве стандартного отклонения S в формуле (1)
может быть использовано стандартное отклонение свободного члена линейной зави-
симости.
7.4. Представление данных. Представляют значение предела обнаружения с
указанием способа, использованного для его определения. Если определение преде-
ла обнаружения основывается на отношении сигнал/шум, представляют соответст-
вующие хроматограммs/
Если значение предела обнаружения получено путем вычислений или экстра-
поляции, его оценка должна быть подтверждена анализом необходимого числа образцов
с содержанием анализируемого вещества, близким к пределу обнаружения.
8. Предел количественного определения
Возможно несколько подходов для определения предела количественного опре-
деления, зависящих от того, является ли методика инструментальной или не инстру-
ментальной. Могут быть использованы следующие подходы.
8.1. Визуальная оценка. Визуальную оценку используют как для не инструмен-
тальных, так и для инструментальных методов.
Предел количественного определения устанавливают путем анализа образцов с
известными концентрациями анализируемого вещества и оценкой минимального со-
держания, при котором анализируемое вещество определяется количественно с
требуемой правильностью и точностью.
8.2. Соотношение Сигнал/Шум. Этот подход применим только к тем методам,
для которых наблюдается шум базовой линии (см. 7.2.). Для определения соотно-
шения сигнал/шум сравнивают величины сигналов, полученные для холостого
опыта и для образцов с низкими концентрациями анализируемого вещества. На
основании полученных данных устанавливают минимальную концентрацию, для ко-
торой величина отношения сигнал/шум составляет около 10:1.
8.3. Использование калибровочной прямой и стандартного отклонения сигнала
d
МВ
=10
¥
(2)
S
где:
δ - стандартное отклонение сигнала,
S - тангенс угла наклона калибровочной прямой.
Значение тангенса угла наклона калибровочной прямой может быть опреде-
лено из калибровочной прямой для анализируемого вещества. Оценка стандартного
отклонения сигнала может быть проведена многими способами, например, сле-
дующими.
8.3.1. Использование стандартного отклонения сигнала для контрольного
опыта. Измеряют величину аналитического сигнала для необходимого числа об-
разцов, не содержащих анализируемое вещество, и вычисляют стандартное откло-
нение.
8.3.2. Использования калибровочной прямой. Получают калибровочную прямую
для образцов с содержанием анализируемого вещества, близким к пределу обна-
ружения, и вычисляют ее параметры. В качестве стандартного отклонения δ в фор-
муле (2) может быть использовано стандартное отклонение свободного члена линей-
ной зависимости.
8.4. Представление данных. Представляют значение предела обнаружения с
указанием способа, использованного для его определения. Значение предела оп-
ределения должно быть подтверждено анализом необходимого числа образцов с
содержанием анализируемого вещества, близким к пределу обнаружения.
9. Робастность
Оценку робастности проводят на стадии разработки методики с учетом типа
изучаемой методики. Эта оценка должна доказать надежность результатов анали-
за при небольших изменениях параметров методики.
Если на результаты анализа влияют условия его проведения, то эти условия
должны быть стандартизированы, и в текст методики вносят соответствующие
предостережения.
Типичные примеры изучаемых параметров:
— устойчивость во времени аналитических растворов;
— время экстракции.
В случае жидкостной хроматографии:
— рН подвижной фазы;
— состав подвижной фазы;
— колонки (различные серии и/или поставщики);
— температура;
— скорость подвижной фазы.
В случае газовой хроматографии:
— колонки (различные серии и/или поставщики);
— температура;
— скорость газа-носителя.
10. Проверка пригодности хроматографической системы
Проверка пригодности системы является составной частью многих аналитиче-
ских методик. Этот тест основан на представлении о том, что оборудование, элек-
троника, аналитические операции и анализируемые образцы составляют единую
систему, которую можно исследовать как целое. Параметры, вводимые в тест
«Проверка пригодности хроматографической системы», зависят от используемого
метода анализа и обосновываются исследованиями по робастности.
С. ВАЛИДАЦИЯ АНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДИК - ОСОБЕННОСТИ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
К МЕТОДАМ, ИСПОЛЬЗУЕМЫМ В ФАРМАКОПЕЕ
1. Оптическое вращение (2.2.7)
1 . 1 . Введение. Выбирают растворитель, позволяющий получать макси-
мально возможный угол вращения. Исследуют стабильность угла вращения испы-
туемого раствора в течение не менее 2 ч. При необходимости указывают, что рас-
твор используют свежеприготовленным. В необходимых случаях указывают время
достижения стабильного значения угла вращения.
Там, где возможно, используют D-линию натрия.
1.2. Идентификация. Если испытуемое вещество представляет собой энан-
тиомер, то для идентификации используют удельный показатель оптического вра-
щения.
Если удельный показатель оптического вращения используют только для це-
лей идентификации, то его значение можно не пересчитывать на сухое вещество.
Регламентируемые пределы величины удельного показателя должны учитывать
допустимые пределы количественного содержания анализируемого вещества и
чистоту образцов различного происхождения, которые выдерживают требования
соответствующей монографии.
Если удельный показатель оптического вращения используется также и для
контроля чистоты энантиомеров, то испытание раздела «Идентификация» может
содержать ссылку: выдерживает требования испытания «Удельное оптическое
вращение».
1.3. Испытания. Удельный показатель оптического вращения (в отдельных
случаях угол вращения) может быть использован для подтверждения оптической
чистоты энантиомера. Этот метод менее чувствителен, чем метод жидкостной
хроматографии (ЖХ). В случае, когда измерение удельного оптического вра-
щения предназначено для того, чтобы нормировать содержание одного из энантио-
меров, необходимо показать, что в условиях методики анализируемый энантио-
мер имеет достаточную величину оптического вращения, чтобы быть обнаруженным.
Результат определения представляют в пересчете на сухое вещество. Там, где это
возможно, представляют данные о влиянии потенциальных примесей. Преде-
лы удельного показателя оптического вращения устанавливают с учетом возможно-
го содержания примесей. При отсутствии информации об оптическом вращении
примесей обычно устанавливают пределы отклонения ±5 % от среднего значения,
полученного на образцах, отвечающих всем остальным требованиям частной ста-
тьи. Там, где это возможно, исследуют образцы различного происхождения. По-
лезно также исследовать образцы со сроками годности,близкими к предельному.
Измерение оптического вращения может использоваться для подтверждения
того, что субстанция является рацематом. В таких случаях обычно устанавливают
пределы от (- 0,10)о до (+0,10)о.
1.4. Количественное определение. Оптическое вращение может использо-
ваться для количественного определения субстанции. При этом необходимо ис-
пользовать стандартный образец с известной оптической чистотой.
2. Абсорбционная спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях
спектра (2.2.25)
Должна быть доказана пригодность выбранных условий определения, таких
как используемые растворители и их качество, рН раствора и т. д.
Обычно ультрафиолетовая спектрофотометрия имеет ограниченную специ-
фичность, которую можно повысить использованием первой и второй производной
спектра.
2.1. Идентификация. Ультрафиолетовая спектрофотометрия сама по себе
редко используется для идентификации. Когда этот метод включают в набор испы-
таний для идентификации, необходимо изучить его специфичность путем сравнения
спектров анализируемого вещества со спектрами подобных соединений. Специ-
фичность метода можно повысить, если использовать не абсолютные значения оп-
тических плотностей, а спектральные отношения.
2.2. Испытания на предельное содержание примесей. Если ультрафиолето-
вая спектрофотометрия используется в испытаниях на допустимые пределы содер-
жания примесей, следует показать, что анализируемые примеси дают достаточный
вклад в измеряемую оптическую плотность. При выбранной длине волны должна
быть установлена оптическая плотность, соответствующая нормируемой концен-
трации анализируемой примеси.
2.3. Количественное определение. Если ультрафиолетовая спектрофотомет-
рия используется для количественного определения, то следует оценить влияние
примесей на светопоглощение. При количественном определении не рекомендуется
использовать удельный показатель поглощения. Если удельный показатель по-
глощения все же применяется, то его значение следует устанавливать на основании
межлабораторного исследования, используя серии с известной чистотой. Чистота
этих образцов должна оцениваться с использованием различных методов,
включающих как методы разделения, так и абсолютные методы (не требующие ис-
пользования стандартного образца).
3. Неинструментальные испытания на чистоту и предельное содержание примесей
3.1. Внешний вид раствора (2.2.1 и 2.2.2). Это визуальные испытания, пред-
назначенные для оценки общей чистоты субстанции и основанные на сравнении
окраски (или опалесценции) испытуемого раствора и серии эталонов. Часто неиз-
вестно, какие примеси и в какой концентрации обуславливают окраску или опалес-
ценцию. В этом случае валидация основывается на сопоставлении данных, полу-
ченных для разных серий, представленных производителем (или производителя-
ми). Если примеси известны и доступны, валидацию этого метода проводят пу-
тем сравнения с более совершенным методом.
3.2. Кислотность и щелочность. Это неспецифичное испытание является од-
ной из характеристик чистоты образца и используется для контроля протеолити-
ческих примесей.
3.2.1. Выбор показателя «рН» или «Кислотность/щелочность» для кон-
троля качества субстанций. Для контроля протолитических примесей в субстан-
циях используют два испытания:
- полуколичественное титрование с использованием индикатора или потенцио-
метрического определения точки титрования
- испытание
«Кислот-
ность/щелочность»;
- измерение рН.
Если вещество имеет буферную емкость, преимущественным является из-
мерение рН. В обратном случае рекомендуется титриметрическая методика. Ис-
пытание «Кислотность/щелочность» применяют тогда, если испытуемая субстан-
ция не гидролизуется или нерастворима в воде.
Вопрос выбора испытания «Кислотность/щелочность» или «рН» при разра-
ботке аналитической нормативной документации или монографии на субстанцию
может быть определен на подступе оценки буферных емкостей самой субстанции.
Для оценки буферных емкостей субстанции строят кривую потенциометри-
ческого титрования водного раствора (или, в случае нерастворимых в воде ве-
ществ, - экстракта (водной вытяжки)) необходимой концентрации (от 10 г/л до 50
г/л), используя в качестве титранта 0,01М раствор кислоты хлористоводородной
или 0,01М раствор натрия гидроксида, соответственно. Точка изгиба на кривой
титрования является настоящим рН раствора и для чистой субстанции находится
на изгибе с пределом рН. Ступеней буферной емкости испытуемого раствора яв-
ляется величина суммарного сдвига рН (ΔрН), рассчитанная из кривой титрования
в результате прибавления к 10 мл испытуемого раствора 0,25 мл 0,01М раствора
натрия гидроксида, а затем к другим 10 мл этого же раствора - 0,25 мл 0,01М
раствора кислоты хлористоводородной. Чем больше величина ΔрН, тем мень-
ше буферная емкость раствора.
Величина ΔрН испытуемого раствора определяет выбор метода для регла-
ментации протолитических примесей в соответствии с приведенной схемой
(Табл.2). Классификация субстанций базируется на том, что для большинства ин-
дикаторов переход окраски происходит в пределах 2 единиц рН.
Таблица 2.
Классификация субстанций в соответствии с величиной ΔрН
Класс буферно-
ΔрН
Название предлагаемого испытания
сти
Класс А
ΔрН>4
Испытание
«Кислотность/щелочность» с
двумя соответствующими индикаторами
Класс В
4> ΔрН>2
Испытание
«Кислотность/щелочность» с
одним соответствующим индикатором
Класс С
2>ΔрН>0,2
Прямое измерение рН
Класс D
ΔрН<0,2
Протолитические примеси невозможно
удовлетворительно контролировать. К та-
ким субстанциям относятся вещества, ко-
торые являются солями и состоят из ио-
нов с более чем одной кислотной и/или
основной функциональными группами.
Для их измерение рН может способство-
вать обеспечению обозначенного хране-
ния субстанции, если пределы рН явя-
лются достаточно узкими.
Путем изменения концентрации испытуемого раствора можно изменить
класс буферности, к которому попадает испытуемая субстанция и в соответствии
со схемой, приведенной в Таблице 2. При этом будет изменяться и форма кривой
титрования. При этом, если возможно, не следует выходить за пределы обозна-
ченных выше концентраций. Однако, если вещество очень мало растворимо в во-
де, можно использовать раствор с концентрацией меньше 10-50 г/л.
В некоторых случаях испытание «Кислотность/щелочность» нельзя провес-
ти при помощи индикатора или через окрашивание самого индикатора, или через
разложение самого вещества. В таком случае испытание проводят при помощи
потенциометрического титрования. Если прибавление кислоты или щелочи вызы-
вает равновесие молекулы субстанции, или выпадения осадка, следует, не обра-
щая внимания на буферную емкость, отказаться от проведения испытания «Ки-
слотность/щелочность» на предмет измерения рН.
Растворы готовят с использованием воды, свободной от углерода диокси-
да, Р.
3.3. Испытания на предельное содержание анионов и катионов (2.4.) Пригод-
ность этих испытаний следует доказать путем использования метода добавок
и/или сравнения с другими, более совершенными методами.
Сульфатная зола (2.4.14). Это испытание предназначено для определения
суммы катионов металлов, присутствующих в органических субстанциях, но не
подходит для неорганических солей органических соединений. Обычно предел
не должен превышать 0.1%. Этот метод не требует валидации.
Тяжелые металлы (2.4.8). Применяют различные способы проведения этого
испытания. Обычно предел содержания тяжелых металлов составляет 0,001%
(10 ррm) или 0,002% (20 ррm), но иногда и 0,0005% (5 ррm), что находится вблизи
предела обнаружения.
Для валидации испытания на тяжелые металлы анализируют испытуемый
образец и образец, специально загрязненный свинцом в соответствующей кон-
центрации. Окраска испытуемого образца должна быть меньше, а загрязненного
образца - равной или большей, чем окраска эталона.
Для ряда методик, требующих сжигания образца, существует опасность по-
терь некоторых тяжелых металлов (таких как, например, ртуть и свинец в присут-
ствии хлоридов). В таких случаях, когда это в возможно, контролируют содержа-
ние тяжелых металлов методом атомно-абсорбционной спектрометрии или дру-
гим инструментальным методом.
Если известно, что при синтезе субстанции используется катализатор, на-
пример, палладий, никель или родий, то их содержание целесообразно контро-
лировать колориметрическими или инструментальными методами (например,
атомно-абсорбционная спектрометрия и др.).
Цветные реакции или реакции осаждения. Для отдельных катионов и анионов
описаны предельные испытания, основанные на визуальном сравнении окраски
или опалесценции. При этом необходимо доказать, что:
—окраска или опалесценция для нормируемых концентраций отчетливо видны;
—найденная концентрация добавленного иона одинакова как для испытуемого
раствора, так и для раствора сравнения (как визуально, так и с помощью мето-
дов, основанных на измерении поглощения);
—значения оптической плотности растворов, содержащих 50%, 100% и 150% ана-
лизируемой примеси от нормируемой концентрации, должны значимо разли-
чаться;
—определение примеси на уровне нормируемой концентрации проводят не менее
шести раз и вычисляют стандартное отклонение. Найденная концентрация
должна составлять не менее 80% от введенной, а относительное стандартное
отклонение - не более 20%.
Целесообразно провести сравнение результатов предельного испытания с
результатами количественного определения с использованием независимого ме-
тода, например, атомно-абсорбционной спектрофотометрии для катионов или
ионной хроматографии для анионов. Результаты, полученные двумя методами,
должны быть близки.
4. Атомно-абсорбционная спектрометрия (2.2.23)
Метод атомно-абсорбционной спектрометрии (ААС) применяют для испы-
таний по определению содержания отдельных элементов, присутствующих в об-
разце.
4.1. Специфичность. Специфичность данного метода определяется тем,
что атомы анализируемого элемента поглощают характеристическое излучение от
источника со строго дискретными длинами волн, соответствующими данному
элементу. Однако возможны помехи вследствие как оптических, так и химических
эффектов. Перед началом валидации необходимо выявить помехи такого рода и,
если возможно, снизить их влияние путем использования соответствующих прие-
мов.
Эти помехи могут привести к систематической погрешности при использова-
нии метода прямой калибровки или к изменению чувствительности метода. Основ-
ным источником погрешности в методе ААС являются погрешности, связанные с
процессом калибровки и мешающим влиянием матрицы.
4.2. Градуировка. Использование линейной модели градуировки описано в об-
щей статье 2.2.23 «Атомно-абсорбционная спектрометрия». Для доказательства
применимости линейной регрессионной модели рекомендуется использовать не
менее пяти градуировочных растворов. В некоторых случаях возможно использова-
ние параболической модели градуировки. При этом также используют не менее
пяти градуировочных растворов. Рекомендуется использовать концентрации гра-
дуировочных растворов с равномерным распределением внутри диапазона при-
менения.
Для каждой концентрации рекомендуется выполнять не менее пяти измере-
ний.
Проблемы с калибровкой часто могут быть выявлены визуально. Однако
градуировочные графики сами по себе нельзя использовать как доказательство
пригодности метода калибровки. Калибровочный график представляют в следую-
щем виде:
а) на графике откладывают измеренные оптические плотности как функции
концентраций и строят кривую, описывающую эту градуировочную функцию, вме-
сте с ее доверительными интервалами. Экспериментальные точки должны нахо-
диться в пределах доверительного интервала построенного графика.
б) на графике откладывают остаточные отклонения (разности между измерен-
ными и вычисленными по градуировочному графику оптическими плотностями) как
функции концентрации. Эти разности должны распределяться вокруг оси абсцисс
случайным образом.
В некоторых случаях разброс значений сигнала возрастает с ростом кон-
центрации, что может быть выявлено из графика остаточных отклонений или ста-
тистическими методами. При этом наибольшая точность может быть достигнута
при использовании градуировки с весовыми множителями. Может быть применена
как линейная, так и квадратичная весовая функция.
В случае использования весовой модели строится график взвешенных раз-
ностей (т.е. разностей, умноженных на веса) как функции концентрации следующим
образом:
а) на графике откладывают измеренные оптические плотности как взвешен-
ные функции концентраций и строят кривую, описывающую эту градуировочную
функцию вместе с ее доверительными интервалами.
б) на графике откладывают взвешенные остаточные отклонения (т.е. взве-
шенные разности между измеренными и вычисленными по градуировочному
графику оптическими плотностями) как функции концентрации.
Необходимо показать, что модель достаточно точно описывает экспери-
ментальные данные.
4.3. Эффекты матрицы. Если для получения градуировочной функции ис-
пользуют метод градуировочного графика, то необходимо показать, что чувстви-
тельность для раствора анализируемого образца и градуировочных растворов
одинакова.
Если применяется градуировка в виде прямой линии, различия в чувстви-
тельности могут быть обнаружены путем сравнения наклонов градуировочного
графика, полученного с использованием эталонных растворов, и растворов, полу-
ченных внесением стандартной добавки к испытуемому раствору. Точность оценки
наклонов обеих прямых зависит от числа и распределения точек измерения. По-
этому для построения обоих регрессионных линий рекомендуется использовать
достаточное число точек (не менее пяти) и выбирать концентрации преимущест-
венно на границах диапазона градуировки.
Обоснованием для возможности использования метода градуировочного
графика является незначимость различий наклонов полученных прямых по крите-
рию Стьюдента. Если различия значимы, то используют метод стандартных доба-
вок.
4.4. Предел обнаружения и предел количественного определения (метод, ос-
нованный на стандартном отклонении контрольного опыта - см. 7.3.1 и 8.3.1,
раздел В). Выполняют контрольные опыты, для которых предпочтительно ис-
пользовать растворы «плацебо», содержащие все компоненты образца, за исклю-
чением определяемого. Если такие контрольные опыты выполнить невозможно, то
допустимо использовать холостые растворы, содержащие все реагенты и приго-
товленные так же, как и испытуемый раствор.
5. Разделительные методы
5.1. Хроматографические методы. Различные хроматографические методы
могут использоваться для идентификации, контроля примесей и количественного
определения. Ниже описаны особенности валидации данных методов.
5.1.1. Тонкослойная хроматография (2.2.27)
Специфичность. Для тестов идентификации обычно нельзя добиться спе-
цифичности, используя только тонкослойную хроматографию (ТСХ) саму по себе,
однако достаточная избирательность может быть достигнута при сочетании ТСХ с
другими методами. Если для испытания на допустимые пределы примесей изби-
рательность недостаточна, то используют дополнительное испытание (испыта-
ния) для контроля примеси (примесей), зона которой не была отделена от других
зон. Необходимо доказать избирательность совокупности используемых методик.
Для испытаний идентификации улучшение избирательности может быть дос-
тигнуто при использовании опрыскивания реактивом, который позволяет разли-
чать близкие соединения по цвету.
Стационарная фаза. Необходимо показать, что данное испытание пригодно
для проведения анализа на пластинках одного типа, но различного происхожде-
ния.
Тест
«Проверка пригодности хроматографической системы». Такой тест
обычно проводится для подтверждения разделения двух близко элюирующихся
соединений, одним из которых является анализируемое вещество. Необходимо
доказать, что разделение выбранных соединений гарантирует пригодность сис-
темы для достижения поставленных целей.
Для испытаний на предельное содержание примесей необходимо учитывать
следующее:
Обнаружение. Необходимо избегать использования особых опрыскивающих
реагентов, если в методике не используется стандарт нормируемой примеси.
Предел обнаружения. Если используют количественную инструментальную
методику, для определения предела обнаружения используют подходы, описан-
ные в пункте 7 раздела В. Если используют визуальную методику, то необходимо
показать, что обнаруживается количество, соответствующее указываемому пределу
обнаружения.
Коэффициент пересчета. Если примеси определяемы, то необходимо пока-
зать, что чувствительности определения примеси и основного вещества близ-
ки. Для испытаний на допустимые пределы примесей различия в чувствительно-
стях могут быть показаны путем сравнения пределов обнаружения.
Предел количественного определения, линейность, диапазон и сходимость.
Эти данные необходимо представлять при использовании инструментальной коли-
чественной ТСХ.
5.1.2. Жидкостная хроматография (2.2.29)
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
Специфичность. Для тестов идентификации обычно нельзя добиться специ-
фичности, используя только жидкостную хроматографию саму по себе, однако
достаточная избирательность может быть достигнута при сочетании жидкостной
хроматографии с другими методами. Необходимо представлять данные о време-
ни удерживания, относительном времени удерживания или коэффициенте емко-
сти для основного вещества и близких по строению веществ. Эти данные необхо-
димо представлять для нескольких стационарных фаз одного типа.
ИСПЫТАНИЯ НА ПРЕДЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ПРИМЕСЕЙ
Специфичность. Избирательность разделения. Должно быть показано
разделение известных и возможных примесей с основным веществом и, если
возможно, между собой. Специфичность может быть подтверждена при исполь-
зовании для детектирования масс-спектрометра. Примеси, которые не отделя-
ются от основного вещества, должны контролироваться другим методом. Необхо-
димо представлять данные о времени удерживания, относительном времени
удерживания или коэффициенте емкости для основного вещества и примесей.
Эти данные должны предоставляться для нескольких стационарных фаз одного
типа.
Избирательность детектирующей системы. Выбор детектора и условий де-
тектирования должен быть обоснован. Специфичность может быть подтвержде-
на, например, при использовании для детектирования масс-спектрометра.
Коэффициент пересчета. Если примеси определяемы, то необходимо пока-
зать, что чувствительности определения примеси и основного вещества близ-
ки (при использовании УФ-детектирования - при выбранной длине волны детек-
тирования; это необходимо показать и для других типов детекторов - например,
рефрактометрического или кондуктометрического). Если отношение чувстви-
тельностей известной примеси и основного вещества выходит за пределы 0,8 -
1,2 и если допустимый предел содержания этой примеси больше 0,1%, то необ-
ходимо использовать коэффициент пересчета либо стандарт нормируемой примеси
в варианте внешнего стандарта.
Предел обнаружения или количественного определения. Эти пределы долж-
ны определяться для метода внешнего стандарта при использовании разведений
испытуемой субстанции или при использовании стандарта примеси. Если пик при-
меси выходит в непосредственной близости от пика субстанции (особенно если
непосредственно за ним), то предел обнаружения или количественного определе-
ния должен устанавливаться по этой примеси. Метод, описанный в пункте 7 раздела
В, пригоден для вычисления обоих указанных пределов.
Стабильность. Необходимо представлять данные, подтверждающие срок
годности испытуемого раствора и раствора сравнения. Также должны представ-
ляться данные о стабильности подвижной фазы.
Степень извлечения. При использовании экстракции необходимо изучить сте-
пень извлечения известных и доступных примесей при оптимальных условиях. Не-
обходимо представить данные, подтверждающие, что экстракция обеспечивает
достаточную точность.
Получение производных. Если используют пред-или послеколоночное полу-
чение производных, необходимо установить оптимальные условия реакции (вре-
мя, температура и др.) и исследовать стабильность полученных производных.
Тест «Проверка пригодности хроматографической системы». Как описано
для ТСХ. Использование соотношения сигнал/шум требуется только тогда, когда
предел определения и нормируемый предел содержания примеси близки.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Специфичность. Это желательное, но не основное требование. Если метод не
специфичен, то возможность его использования обеспечивается низким уровнем
содержания примесей, которые контролируются другим испытанием.
Тест «Проверка пригодности хроматографической системы». Как описано
для ТСХ.
5.3.1. Газовая хроматография (2.2.28)
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
Специфичность. Как описано для жидкостной хроматографии.
ИСПЫТАНИЯ НА ПРЕДЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ПРИМЕСЕЙ
Специфичность. Как описано для жидкостной хроматографии.
Коэффициент пересчета. Как описано для жидкостной хроматографии. Долж-
ны представляться коэффициенты пересчета нормируемой примеси относительно
основного вещества. Это особенно важно при использовании селективных детек-
торов, таких как детектор по электронному захвату и т. п.
Пределы обнаружения и количественного определения. Как описано для жид-
костной хроматографии.
Стабильность. Как описано для жидкостной хроматографии.
Получение производных. Как описано для жидкостной хроматографии.
Внутренний стандарт. Необходимо показать, что при выбранных условиях пик
внутреннего стандарта не перекрывается с пиками возможных примесей или ос-
новного вещества.
Степень извлечения. Как описано для жидкостной хроматографии.
содержание .. 54 55 56 57 ..