ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Главная     Книги по виноделию     Микробиология виноделия Н. И. Бурьян Л. В. Тюрина

 поиск по сайту     

 

 

 

 

содержание   ..  50  51  52  53  54  55  56  57  58  59  60  ..

 

 

 

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Синтетические среды. В эту группу питательных сред входят среды, имеющие определенный состав, т. е. их основные составные части известны.

Для микробиологического исследования дрожжей используют среду Ридер. В состав среды входят следующие соли (в г на 1 л воды):


Сернокислый аммоний                                                   3

Сернокислый магний                                                    0,7

Азотнокислый кальций                                                    0,4

Хлористый натрий                                                         0,5

Фосфорнокислый калий однозамещенный               1

Фосфорнокислый калий двузамещенный                     0,1

 


Начальная величина pH среды 6,6. Из состава среды может быть исключен азотнокислый кальций, который не используется дрожжами. Для опытов по размножению в среду добавляется 2% сахара, для опытов по брожению — 5—10%.

Полная синтетическая среда содержит кристаллические витамины в следующих концентрациях (в мкг на 1 мл):

 


Инозит                                                                   5,0

Биотин                                                                0,0001

Пантотеновая кислота                                        0,25

Тиамин                                                            1,0

Пиридоксин                                                   0,25

Никотиновая кислота                                  0,5

 

 

Состав синтетических сред для размножения уксуснокислых и молочнокислых бактерий очень сложный [73]. Рекомендуются полусинтетические среды.

Для уксуснокислых бактерий с набором веществ (в г на 1 л дистиллированной воды):

В среду добавляют 250 мл томатного сока, pH среды 4,8.
 

 

Натуральные питательные среды. Для выращивания дрожжей, уксуснокислых и молочнокислых бактерий готовят различные питательные среды, состав которых точно не известен.

Виноградное сусло. Сусло помещают в колбу и нагревают до кипения в кипятильнике Коха. После охлаждения его отфильтровывают от выпавших белковых веществ через бумажный складчатый фильтр и разливают в пробирки по 5 мл, стараясь не смочить горлышка. Среду используют для выращивания дрожжей.

Солодовое сусло. Неохмеленное пивное сусло фильтруют через бумажный фильтр для удаления осадка белковых веществ. Содержание сухих веществ (в % СВ) определяют сахарометром. Путем разведения водопроводной водой готовят сусло с различным содержанием сухих веществ: для выращивания грибов 3—4%, дрожжей 6—8, молочнокислых бактерий 2—5%.

Дрожжевая вода. 70—100 г свежих прессованных или 7—10 г сухих дрожжей разбалтывают в 1 л дистиллированной воды и кипятят 30 мин. После отстаивания на холоде в высоком цилиндре жидкость декантируют и фильтруют. К фильтрату добавляют 1 л воды, еще раз кипятят 30 мин и вновь фильтруют.
 

Для лучшего осветления жидкости можно прибавить до кипячения взбитый с водой яичный белок. В дрожжевую воду вносят необходимые вещества (углеводы, соли), доводят pH среды до нужного значения и стерилизуют. Среда используется для выращивания дрожжей [131].

Вино с сахаром. В белое сухое вино добавляют 8—10% сахара. После его растворения среду фильтруют и разливают по пробиркам. Среда используется для посева дрожжей и уксуснокислых бактерий.

Вино с суслом. Среда состоит из виноградного сусла — ]/з объема, сухого вина — Уз и водопроводной воды — !/з объема. Среду фильтруют и разливают в пробирки. Среда рекомендуется для посева уксуснокислых бактерий.

Виноградное сусло разбавленное. Сусло разбавляют водой до содержания сахара 5%, добавляют 1% автолизата дрожжей и доводят pH до 5—6 добавлением 1 н. раствора щелочи. Среда рекомендуется для выращивания молочнокислых бактерий.

Дрожжевой автолизат. К 1 кг прессованных дрожжей прибавляют 1 л водопроводной воды, прокипяченной и охлажденной до 60°С, смешивают в гомогенную массу и ставят в термостат при температуре 48—50°С. Для предотвращения инфицирования к дрожжевой суспензии добавляют толуол (несколько капель до появления ясного его запаха). Дрожжевую массу помещают в сосуды с запасом пространства, учитывая расширение толуола. Во время перемешивания (1—2 раза в день) сосуд открывают. Через 48—72 ч автолиз дрожжей заканчивается, дрожжевая масса разжижается. Затем массу нагревают в автоклаве при давлении 0,02 МПа 30 мин, по остывании фильтруют до полной прозрачности (лучше через бумажную мезгу на воронке Бюхнера). Прозрачный фильтрат содержит около 0,9% азота.

Осадок разводят в 600 мл воды и вновь фильтруют. Фильтраты объединяют. В смеси содержание общего азота становится равным 0,6—0,8%. При необходимости автолизат нейтрализуют до pH 6,8—7,0, разливают в пробирки или склянки и стерилизуют 15 мин при давлении 0,05 МПа.

Автолизат дрожжей особенно богат парааминобензойной кислотой, пантотеновой кислотой и пиридоксином. Его удобно добавлять как источник витаминов в небольшом количестве к синтетическим средам.

Полученный автолизат разбавляют водой (1: 10) с добавлением 1—2% сахара.

Для приготовления автолизата можно использовать осадочные винные дрожжи. Для этого их освобождают от вина, несколько раз промывают холодной водой, которую после осаждения дрожжей декантируют. Из отмытых дрожжей готовят автолизат так же, как описано выше.
 

Среда из автолизата дрожжей применяется для посева молочнокислых бактерий.

Капустная среда. 200 г измельченной капусты помещают в кастрюлю, заливают 1 л воды и кипятят в течение 10 мин, затем отжимают через двойной слой марли, полученную жидкость фильтруют и в 2 раза разводят водой. К отвару добавляют 2% глюкозы и 1% пептона.

Можно использовать сухую капусту (измельченную капусту следует сушить в тени при температуре 20—35°С при притоке свежего воздуха). Для приготовления питательной среды 6—8 г сухой капусты кипятят в 1 л воды. Среду разливают в пробирки высоким слоем, по 8—10 мл. Среда используется для накопления и выделения молочнокислых бактерий.
 

 

 

Элективные питательные среды. Эти среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы родственных микроорганизмов и менее пригодны или совсем не пригодны для развития других.

Во все описанные жидкие питательные среды, предназначенные для высева молочнокислых бактерий из сусла и вина, перед посевом вводят этиловый спирт из расчета содержания в среде 14% об, (0,95 мл спирта на 5 мл среды). При таком содержании спирта размножаются преимущественно молочнокислые бактерии,

В питательной среде, содержащей 20 ед./мл мономицина, при высеве пробы исследуемого вина развиваются уксуснокислые бактерии. В присутствии этого антибиотика молочнокислые бактерии не размножаются.

Для преимущественного развития дрожжей и подавления сопутствующих бактерий в среду рекомендуется вводить антибиотик неомицин в количестве 20 ед./мл среды или совместно пенициллин и стрептомицин (50—100 ед. каждого на 1 мл среды).

Для подавления роста плесневых грибов, которые интенсивно растут на сусле и сусло-агаре, рекомендуется добавлять 4% об. спирта или 0,2% пропионовокислого натрия.

При необходимости получения изолированной культуры пленчатых дрожжей в среду добавляют йодуксусную кислоту в количестве 0,1—0,2%.
 

 

Дифференциально-диагностические среды. Эти среды позволяют быстро отличить одни виды микроорганизмов от других. Готовят их часто с введением специальных красителей — индикаторов.

Для предварительного ориентировочного определения уксуснокислых бактерий и дифференциации их от молочнокислых делают рассев культуры на дрожжевую воду с добавлением в нее

5—10% глюкозы, 10% желатина или 1% агара и 1% углекислого цинка. Молочнокислые бактерии к вредному действию цинка очень чувствительны, тогда как уксуснокислые бактерии растут на этой среде хорошо [131].
 

Для раздельного определения уксуснокислых и молочнокислых бактерий служит жидкая или плотная питательная среда 1 с pH 7, состоящая из дрожжевой воды с добавлением 10% дрожжевого автолизата и смешанного индикатора 1 : 1 (бромкрезол красный и бромкрезол зеленый, 0,1%-ные растворы в смеси воды со спиртом). Молочнокислые бактерии образуют молочную и уксусную кислоты, в результате чего реакция среды становится кислой и цвет индикатора меняется от синего через желто-зеленый до желтого. При развитии уксуснокислых бактерий образуется аммиак, который подщелачивает среду и изменяет ее цвет с синего на фиолетовый.