ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год)

Таблица 3.2.3.-4.

Оценка неисключенной погрешности

Источник вариа-

Степени сво-

Сумма квадратов

ций

боды

Блоки (строки)^(*)

n-1

hd(R +...+R

)

block =

Столбцы^(**)

n-1

hd(C +...+C

)

col

Полная рандо-

= SS

- SS

мизация

hd(n-1)

res

tot

treat

Неисключенная

Рандомизиро-

= SS

- SS

(hd-1)(n-1)

res

tot

treat

block

погрешность^(***)

ванный блок

= SS

- SS

Латинский

res

tot

treat

block

(hd-2)(n-1)

квадрат

Общая вариа-

nhd-1

)

tot

ция

^(*) Не рассчитывается для схемы полной рандомизации.

^(**)Рассчитывается только для схемы Латинских квадратов.

(***)

Зависит от схемы количественного определения.

3.2.4 ИССЛЕДОВАНИЯ ДОСТОВЕРНОСТИ

Результаты количественного определения считаются «статистически значимы-

ми», если выполняются следующие условия:

1) проведенные вычисления свидетельствуют о значимости линейной регрессии, т. е.

рассчитанная вероятность меньше 0,05. Если это условие не выполняется, вычис-

лить доверительный интервал с вероятностью 95% не представляется возможным;

2) проведенные вычисления свидетельствуют, что непараллельность незначима, т. е.

рассчитанная вероятность ≥0,05. Это означает, что условие 5А (Раздел 3.1) выпол-

няется.

3) Проведенные вычисления свидетельствуют, что нелинейность незначима, т.е. рас-

считанная вероятность ≥0,05. Это означает, что условие 4А (Раздел 3.1) выполня-

ется.

Существенное отклонение от параллельности при многократных количественных

определениях может быть обусловлено тем, что угловой коэффициент зависимости

«ln(доза-эффект)» для одного из препаратов, включенных в исследование, отличается

от аналогичного значения для других препаратов. В этом случае допускается не при-

знавать несостоятельность всего анализа, а исключить результаты, имеющие отноше-

ние к этому препарату, и повторить статистический анализ заново.

После того, как установлена статистическая значимость, могут быть рассчитаны

оценки активности препаратов и границы доверительных интервалов при помощи при-

веденных в следующем разделе методов.

3.2.5 ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ И ГРАНИЦ ДОВЕРИТЕЛЬНЫХ ИНТЕРВАЛОВ

Если обозначить через I натуральный логарифм отношения между ближайшими

значениями доз любого из препаратов, то общий для всех прямых угловой коэффици-

ент (b) в случае количественного определения, которое включает d доз для каждого

препарата, вычисляется по формуле:

+...)

b = L

(3.2.5.-1)

Inh

Логарифм отношения активности испытуемого препарата, например Т, вычисля-

ют по формуле:

-P

(3.2.5.-2)

Рассчитанная активность представляет собой оценку «истинной активности» ка-

ждого из испытуемых препаратов. Границы доверительного интервала могут быть рас-

считаны, как антилогарифм выражения:

-1)(CMT

2V)

(3.2.5.-3)

где:

reg

-s

reg

b2dn

Значение t может быть найдено из Таблицы 8.2. при р=0,05 и числе степеней

свободы, равному числу степеней свободы неисключенной (остаточной) погрешности.

Оценка активности (R_T) и соответствующий доверительный интервал вычисляют путем

умножения результатов на величину A_T после антилогарифмирования. Если выяснит-

ся, что активности исходных растворов, приготовленных исходя из предполагаемой и

принятой активностей, не равны между собой, следует ввести поправочный коэффици-

ент (см. примеры 5.1.2 и 5.1.3).

3.2.6 ПРОПУЩЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

В случае сбалансированного количественного определения существует вероят-

ность случайной потери одного или нескольких результатов, абсолютно не связанных с

процедурой количественного определения, например, вследствие смерти животного.

Если будет доказано, что смерть животного никоим образом не связана с составом

введенного препарата, возможность выполнения точных расчетов остается, но форму-

лы значительно усложняются и могут быть представлены только в рамках общих ли-

нейных моделей (см. Раздел 7.1). Тем не менее, существует приблизительный метод в

котором простота сбалансированного плана сохраняется путем замены потерянного

результата рассчитанным значением. Потерю информации, которая при этом имеет

место, сохраняют следующим образом: число степеней свободы для общей суммы

квадратов и для неисключенной (остаточной) погрешности уменьшают на число поте-

рянных результатов, а для вычисления отсутствующих значений используют одну из

приведенных ниже формул. Следует иметь ввиду, что этот метод является приблизи-

тельным, и предпочтения следует отдавать точным расчетам.

Если потеряно более одного результата, могут быть использованы эти же фор-

мулы. В этом случае для всех потерянных значений, кроме одного, проводят грубые

оценки. Для этого значения вычисляют при помощи соответствующей формулы с уче-

том всех данных, включая сделанные предположения. Эти рассчитанные значения

включают в общий массив данных и аналогичным образом проводят вычисление зна-

чений для первой из грубых оценок. После вычисления всех потерянных значений по-

вторяют весь цикл сначала, используя более точные приближения или рассчитанные

значения для каждого результата, для которого применялась формула. Такой цикл вы-

числений повторяют до тех пор, пока два последовательных цикла не дадут те же са-

мые значения. Обычно сходимость достигается очень быстро.

При условии, что число замененных результатов невелико по отношению к об-

щему числу данных в эксперименте (например, меньше 5%), приближения, предпола-

гаемые при этих заменах и уменьшение степеней свободы на число потерянных дан-

ных, замененных таким образом, обычно являются удовлетворительными. Полученные

результаты следует интерпретировать с большой осторожностью, особенно если име-

ются пропущенные результаты в одном исследовании или блоке. В случае неясностей,

либо непредвиденных ситуациях следует проконсультироваться со специалистом по

биостатистике. Категорически недопустима замена пропущенных результатов в случае

испытаний без повторений.

Схема полной рандомизации

В данном случае пропущенное значение может быть заменено средним арифме-

тическим всех других результатов в пределах одной группы.

Схема рандомизированных блоков

Потерянный результат заменяют величиной y’, рассчитанной по формуле:

nB'+kT' G '

(3.2.6.-1)

1)(k

)

где B'

- сумма результатов для блока, содержащего потерянное значение, T' - соот-

ветствующее общее количество препаратов, G' - сумма всех результатов, полученных

при количественном определении.

Схема латинских квадратов

Пропущенное значение y’ рассчитывают по формуле:

k(B'+C'+T' )

(3.2.6.-2)

1)(k

)

где:

и C' - суммы результатов, соответственно, в строках и столбцах, содержащих поте-

рянные данные. В данном случае k=n.

Перекрестная схема

Если при использовании перекрестной схемы результат был случайно потерян,

следует обратиться к пособию по статистике (например, к руководству D.J.Finney, см.

Раздел 10), поскольку применение той или иной формулы зависит от конкретной ком-

бинации исследований.

3.3. МОДЕЛЬ УГЛОВЫХ КОЭФФИЦИЕНТОВ

3.3.1 ВВЕДЕНИЕ

Данная модель может применяться, например, для некоторых микробиологиче-

ских количественных определений, в которых независимая переменная представляет

собой концентрацию эссенциального фактора роста для микроорганизмов в среде ни-

же оптимальной для роста концентрации. На Рисунке 3.3.1.-1. показана модель угло-

вых коэффициентов.

Рисунок 3.3.1.-1. Модель угловых коэффициентов для количественного определения

2¥3+1. Оценка предполагаемой активности испытуемого препарата завышена по

отношению к истинной.

По горизонтальной оси абсцисс откладываются значения доз, начало оси коор-

динат соответствует нулевой дозе; значения доз возрастают слева направо. По верти-

кальной оси ординат откладываются полученные эффекты. Индивидуальный резуль-

тат каждого исследования показан в виде черной точки. Две линии представляют собой

зависимости доза - эффект, рассчитанные для стандартного и испытуемого препара-

тов, исходя из предположения, что они пересекаются друг с другом в точке, соответст-

вующей нулевой дозе. В отличие от модели параллельных линий, значения доз не

представляются в виде логарифмов.

Так же, как и в случае количественных определений, основанных на модели па-

раллельных линий, важно, чтобы предполагаемая активность была как можно ближе к

истинной и, если возможно, желательно приготовить разведения испытуемого и стан-

дартного препаратов с одинаковыми активностями. Чем точнее будет предполагаемая

активность, тем ближе линии будут располагаться одна к одной. Отношение угловых

коэффициентов представляет собой отношение «истинного» значения активности ис-

пытуемого препарата к его предполагаемой активности. Если угол наклона линии ис-

пытуемого препарата больше угла наклона линии стандартного препарата, это означа-

ет, что активность была занижена и при расчетах оцененная активность будет выше

предполагаемой активности. Аналогично, если угол наклона линии испытуемого препа-

рата меньше угла наклона линии стандартного препарата, то активность была завы-

шена, и расчеты покажут, что оцененная активность будет ниже предполагаемой.

В ходе эксперимента, все результаты следует проверить на выполнение условий

1, 2 и 3, приведенных в Разделе 3.1. Процедура проведения дисперсионного анализа

описана в Разделе 3.3.3, таким образом, он предполагает возможность проверки вы-

полнения условий 4В и 5В, приведенных в Разделе 3.1.

3.3.2 ПЛАН КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Использование методов статистического анализа, приведенных в данном разде-

ле, накладывает на количественные определения следующие ограничения:

a) как стандартный, так и испытуемый препараты должны анализироваться при одина-

ковом числе равновеликих разведений;

b) возможно наличие дополнительной группы экспериментальных объектов, которым

не вводят препарат (плацебо группа);

c) во всех группах должно быть одинаковое число экспериментальных объектов.

Как уже было отмечено в Разделе 3.1.3, планы количественных определений,

которые не отвечают требованиям этих ограничений, могут быть также корректными и

обоснованными. Однако, описанные здесь простые методы статистического анализа, в

данном случае неприменимы, и следует либо обратиться за помощью к специалисту,

либо использовать соответствующее программное обеспечение.

Обычно предпочтительным является использование плана исследования с дву-

мя дозами каждого препарата и одной плацебо группой. Так называемая «(2h+1) то-

чечная схема с общей нулевой точкой», которая обеспечивает очень высокую точность

наряду с возможностью проверки достоверности ограничений, упомянутых выше. Од-

нако, не всегда может допускаться линейность зависимостей вплоть до нулевой дозы.

Если допускается небольшая потеря точности, можно использовать план, который не

предполагает проведение плацебо исследования. В этом случае предпочтительно ис-

пользовать по три дозы каждого препарата, «(3h) точечная схема с общей нулевой точ-

кой». Эти дозы назначаются следующим образом:

1) стандартный препарат вводится в максимальной дозе, которая должна быть близка

к наивысшей дозе, воспроизводящей средний эффект на линейном отрезке зави-

симости «доза - эффект», но не превышать ее;

2) Две другие дозы равномерно распределяются в промежутке между максимальной и

нулевой дозами;

3) Испытуемый препарат вводится в соответствующих дозах, определенных исходя из

предполагаемой активности вещества.

Возможно использование схем полной рандомизации, рандомизированных бло-

ков или латинских квадратов, описанные в Разделе 3.2.2. Так же, как и для модели па-

раллельных линий, использование любой из этих схем требует корректировки ошибки

суммы квадратов. Ниже описана схема анализа в случае, если со стандартным препа-

ратом сравнивается один или несколько испытуемых препаратов.

3.3.3 ДИСПЕРСИОННЫЙ АНАЛИЗ

3.3.3.1

(hd+1)-схема

Результаты проверяют согласно требованиям, описанным в Разделе 3.1 и, если

необходимо, проводят их преобразование. Затем для каждого эксперимента и каждого

препарата вычисляют среднее значение, как описано в Таблице 3.3.3.1-I. Дополни-

тельно рассчитывают среднее значение для плацебо исследований (В).

В Таблицах 3.3.3.1.-1 - 3.3.3.1.-3 приведен расчет суммы квадратов для диспер-

сионного анализа. Сумма квадратов, обусловленная нелинейностью, может быть рас-

считана только в том случае, если в план количественного определения было включе-

но, по крайней мере, по три дозы каждого из препаратов. Неисключенную (остаточную)

погрешность находят путем вычитания вариации, предусмотренной планом экспери-

мента, из общей вариации для результата исследования (Таблица 3.3.3.1.-IV).

Далее дисперсионный анализ завершают следующим образом: каждую сумму

квадратов отклонений делят на соответствующее число степеней свободы для вычис-

ления дисперсии (среднего квадрата отклонений). Затем оценивают значимость отно-

шения дисперсии (среднего квадрата отклонений) для каждой переменной к неисклю-

ченной (остаточной) погрешности (s²) (F-отношение). Для этого можно воспользоваться

Таблицей

8.1 или соответствующей подпрограммой компьютерного программного

обеспечения.

Таблица 3.3.3.1.-1.

Формулы для d-дозовых количественных определений с использованием модели уг-

ловых коэффициентов для каждого препарата и плацебо испытания.

Стандартный препа-

1-й испытуемы пре-

2-й испытуемый

рат

парат

препарат

(S)

(T)

(U, и т.д.)

Среднее значение для

S₁

T₁

U₁

минимальной дозы

Среднее значение для

S₂

T₂

U₂

второй дозы

…

Среднее значение для

T_d

U_d

максимальной дозы

Суммарный результат

+..

=T +

+ ...+T

= ...

для препарата

Линейное произведение

=1S

+ 2S

+ ...+ dS

=1T +2T +...+dT

= ...

Точка пересечения

= (4d + 2)P

-6L

= (4d + 2)P

-6L

a_U =

Угловой коэффициент

= 2L

-(d

+1)P

= 2L

-(d

+1)P

b_U =

Значения для групп

+ ...+S

+ ...+T

GU =

Нелинейность(*)

J_U =

-d

^(*)не рассчитывается для двухдозовых количественных определений

Таблица 3.3.3.1.-2.

Дополнительные формулы для проведения дисперсионного анализа

nhd

+...)

H_B

= n

H_I

² -

h(d

-d)

Таблица 3.3.3.1.-3.

Формулы для расчета сумм квадратов и степеней свободы

Источник вариаций

Степени свободы

Сумма квадратов

(f)

Регрессия

reg

= SS

treat

- SS

blank

- SS

int

- SS

lin

Плацебо исследования

(B a)

blank

Точка пересечения

h-1

+...)-

h(d

-d)

)

int

Нелинейность^(*)

h(d-2)

n(J

+ ...)

lin

Группы

n(B2 +G

+...) - K

treat

^(*) Не рассчитывается для двухдозовых количественных определений

Таблица 3.3.3.1.-4.

Оценка неисключенной (остаточной) погрешности

Источник

Степени сво-

Сумма квадратов

вариаций

боды

Блоки (строки)^(*)

n-1

hd(R

+ ...+

R_n)

-K

block

Столбцы^(**)

n-1

SS =hd(C

+ ...+C2 ) - K

col

Полная рандо-

= SS

- SS

мизация

(hd+1)(n-1)

res

tot

treat

Неисключенная

Рандомизиро-

hd(n-1)

= SS

- SS

res

tot

treat

block

погрешность^(***)

ванный блок

Латинский

(hd-1)(n-1)

= SS

- SS

res

tot

treat

block

col

квадрат

Общая

nhd+n-1

)

tot

вариация

^(*) Не рассчитывается для схемы полной рандомизации.

^(**)Рассчитывается только для схемы Латинских квадратов.

(***)

Зависит от схемы количественного определения.

R - значения эффекта по строкам

С - значения эффекта по столбцам

3.3.3.2

(hd)-схема

Для этой схемы используются, в основном, те же самые формулы, что и для

(hd+1)-схемы, за исключением некоторых небольших различий:

переменная В исключается из всех формул.

n( PS+PT+...)

Значение К рассчитывается как

SS_blank исключается из дисперсионного анализа.

Число степеней свободы для вариаций, обусловленных группами равно hd-1.

Число степеней свободы для неисключенной (остаточной) погрешности и общей

вариации рассчитывают, как описано для модели параллельных линий (см. Таб-

лицу 3.2.3.-IV).

Обоснованность (достоверность) количественного определения, активность и гра-

ницы доверительного интервала определяют, как описано в Разделах 3.3.4 и 3.3.5.

3.3.4 ИССЛЕДОВАНИЯ ДОСТОВЕРНОСТИ

Результаты количественного определения считаются «статистически значимы-

ми», если результаты, полученные при дисперсионном анализе, удовлетворяют сле-

дующим условиям:

1) Вариация, обусловленная плацебо в (hd+1)-схеме, не является статистически зна-

чимой, т.е. рассчитанная вероятность ≥0.05. Это означает, что результаты, полу-

ченные при плацебо исследовании, не существенно отличаются от общей точки

пересечения и линейная зависимость сохраняется вплоть до нулевой дозы.

2) Вариация, связанная с точкой пересечения, не является значимой, т.е. рассчитанная

вероятность ≥0.05. Это означает, что выполняется условие 5В, Раздел 3.1.

3) В количественном определении, которое включает, по крайней мере, по три дозы

для каждого из препаратов, вариация, обусловленная нелинейностью, не является

значимой, т.е. рассчитанная вероятность ≥0.05. Это означает, что выполняется ус-

ловие 4В, Раздел 3.1.

Статистически значимая вариация, обусловленная проведением плацебо иссле-

дования, свидетельствует о том, что предположение о линейности не подтверждается

для диапазона доз возле нулевой точки. Если это отклонение носит скорее системати-

ческий, чем случайный характер, наиболее подходящей является (hd)-схема. При этом

любые результаты, связанные с плацебо исследованиями, должны быть исключены.

Если все выполненные исследования свидетельствуют о достоверности (обос-

нованности) количественного определения, активность и границы доверительного ин-

тервала рассчитываются, как описано в Разделе 3.3.5.

3.3.5 ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ И ГРАНИЦ ДОВЕРИТЕЛЬНОГО ИНТЕРВАЛА

3.3.5.1

(hd+1)-схема

Общая точка пересечения а’ для препаратов может быть вычислена по форму-

ле:

(2d

+1)B

+(2d

-3 )ha

a'=

(3.3.5.1.-1)

h( 2d

угловой коэффициент для стандартного препарата и, аналогично, для каждого из дру-

гих препаратов, рассчитывают по формуле:

-3d(d

+1)a'

(3.3.5.1.-2)

3d2

Отношение активностей для каждого из препаратов, теперь может быть рассчи-

тано следующим образом:

(3.3.5.1.-3)

Для определения рассчитанной активности R_T, полученное значение нужно

умножить на предполагаемую активность А_Т испытуемого препарата. Если интервал

между дозами стандартного и испытуемого препаратов не был одинаковым, активность

следует умножить на величину I_S/I_T. Обратите внимание, что в отличие от модели

параллельных линий, антилогарифмы при этом не вычисляются.

Доверительный интервал для переменнойR^'T вычисляется по формуле:

CRT K

-1)(CR

+1)+K'(K'-2CR'

)

(3.3.5.1.-4)

где:

' 2

-s

= (C -1)V

V₁ и V₂ связаны с дисперсией и ковариацией числителя и знаменателяR^'T . Их

рассчитывают по формулам:

V₁

(3.3.5.1.-5)

n( 2d

) Ëd(d

)

2(2d

+1)+

hd(d

-1

)¯

3d(d

)

(3.3.5.1.-6)

(3d

+1)(d

+2)+hd(d

-1

)

Доверительный интервал умножается на величину А_Т и, если необходимо, на

величину I_S/I_T.

3.3.5.2

(hd)-схема

Для этой схемы используются те же формулы, что и для (hd+1)-схемы за исклю-

чением следующих изменений:

а’ = a

(3.3.5.2.-1)

V₁

(3.3.5.2.-2)

n(2d

) Ë d(d

)

h( d

-1

)¯

3d(d

)

(3.3.5.2.-3)

(3d

+1)+h(d

-1

)

4. ТЕСТЫ С АЛЬТЕРНАТИВНЫМ ТИПОМ ЭФФЕКТА

4.1. ВВЕДЕНИЕ

В ряде случаев невозможно или слишком трудоемко количественно оценить

эффект для каждого экспериментального объекта. В то же время, такие результаты,

как смерть или симптомы гипогликемии, могут либо наступить, либо не возникать у ка-

ждого из экспериментальных объектов, и общий итог будет зависеть от количества

объектов, для которых такой результат наступил. Такой тип исследования называется

количественным определением с альтернативными (дискретными) результатами или

количественным определением типа «все или ничего».

Ситуация при этом в целом очень похожа на описанную в Разделе 3.1, но вместо

n различных результатов для каждой группы, записывают одно значение, т.е. процент

объектов в каждой испытуемой группе, у которых проявился эффект. Если эти резуль-

таты представить в виде графика зависимости доли прореагировавших объектов от ло-

гарифма дозы, получим не линейную, а сигмоидную кривую (s-образной формы). Для

анализа сигмоидной кривой «доза-эффект» применяют математическую функцию, опи-

сывающую данную кривую. Обычно используют кумулятивную функцию нормального

распределения (характеристическую кривую). Эта функция имеет преимущества с тео-

ретической точки зрения и, очевидно, является предпочтительной, если результат от-

ражает толерантность экспериментальных объектов. Если результаты связаны с про-

цессами роста, предпочтительной является логистическая функция распределения,

хотя различие в результатах, полученных при использовании этих двух функций, как

правило, незначительно.

Максимальная достоверность оценки угловых коэффициентов и расположения

кривых может быть достигнута только при использовании итерационных процедур.

Существует множество таких процедур, которые приводят к одинаковым результатам,

но отличаются по эффективности вследствие разной скорости конвергенции. Одним из

наиболее быстрых методов является метод прямой оптимизации функции максималь-

ной правдоподобности (см. Раздел 7.1). Этот метод можно легко реализовать при по-

мощи компьютерного программного обеспечения, имеющего соответствующую встро-

енную подпрограмму.

К сожалению, большинство этих процедур не дают оценки границ доверительно-

го интервала, а методики их вычисления слишком сложны для рассмотрения в данном

разделе. Методика, приведенная ниже, не является самой быстрой, но достаточно

проста по сравнению с другими методиками. Эта методика может применяться для ко-

личественных определений, в которых дин или более испытуемых препаратов сравни-

ваются со стандартным препаратом. Кроме этого, должны выполняться следующие ус-

ловия:

1) Зависимость между логарифмом дозы и полученным результатом должна быть

представлена в виде кумулятивной кривой нормального распределения (харак-

теристическая кривая);

2) Кривые для стандартного и испытуемого препаратов должны быть параллельны,

т.е. иметь одинаковую форму, и могут различаться только расположением по оси

абсцисс;

3) Теоретически, не должно наблюдаться эффекта от введения чрезвычайно малой

дозы, и невозможно отсутствие эффекта от введения чрезвычайно большой до-

зы.

4.2. МЕТОД ПРОБИТ-АНАЛИЗА

Сигмоидную кривую можно преобразовать в прямую линию путем замены каждо-

го эффекта (т.е. доли объектов у которых появился эффект) в группе соответствующи-

ми значениями нормального эквивалентного отклонения от среднего эффекта. Эти

значения, часто называемые «нормиты»⁴, теоретически находятся в интервале от +•

до -•. Ранее было принято к каждому «нормиту» прибавлять число 5, таким образом,

получали так называемые «пробиты»⁵. Это облегчало проведение расчетов вручную,

потому что в этом случае исключались отрицательные результаты. С появлением ком-

пьютеров необходимость в прибавлении 5 отпала. Поэтому метод, описываемый ниже,

правильнее было бы назвать «метод нормит-анализа». Однако, поскольку термин «ме-

тод пробит-анализа» широко распространен и используется в литературе, он сохраня-

ется в данной статье исходя из исторических соображений.

На первый взгляд кажется, что после линеаризации результатов следует приме-

нять метод параллельных линий, описанный в Разделе 3.2. Однако, это не так, по-

скольку для каждой дозы не выполняется условие однородности дисперсий. Дисперсия

минимальна, если нормит равен нулю и возрастает, как для позитивных, так и для не-

гативных значений нормита. Следовательно, необходимо придать больший вес значе-

ниям в средней части кривой, и меньший ее крайним частям. Ниже приведено описа-

ние такого метода, а также процедура дисперсионного анализа, оценка активности и

границ доверительного интервала.

4.2.1 ПОДГОТОВКА РАБОЧИХ ТАБЛИЦ РЕЗУЛЬТАТОВ

В таблицу 4.2.1.-1 заносятся данные по столбцам, номера которых обозначают

следующее:

(1) Доза (D) стандартного или испытуемого препарата;

(2) Число n объектов, подвергшихся исследованию;

(3) Число r объектов у которых получен позитивный эффект в ходе исследования;

(4) Логарифм х дозы;

(5) Доля позитивных эффектов p=r/n в группе;

Далее начинается первый цикл

(6) Столбец Y при первой итерации заполняют нулями;

(7)

Соответствующие значения Ф=Ф(Y) функции кумулятивного стандартного

(характеристической кривой) распределения (см. также Таблицу 8.4);

Значения, заносимые в столбцы (8)-(10) вычисляют по формулам:

-Y2

(8)

= e

(4.2.1.-1)

(9)

(4.2.1.-2)

(10)

(4.2.1.-3)

F- F

Значенияw

, заносимые в столбцы с (11) по (15) можно

легко вычислить при помощи данных, находящихся в столбцах (4), (9) и (10), затем вы-

числяют сумму (Σ)этих значений для каждого из препаратов.

⁴ от англ. «normality unit»

⁵ от англ. «probability unit»

Таблица 4.2.1.-1.

Первая рабочая таблица

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

wx²

wy²

wxy

S =

и т.д.

Таблица 4.2.1.-2.

Вторая рабочая таблица

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

Swx

Swy

Swx²

Swy²

Swxy

S_xx

S_xy

Syy

и т.д.

S =

Полученные результаты суммирования переносят из Таблицы 4.2.1.-1 в столбцы

(1)-(6) таблицы

4.2.1.-2, значения, заносимые в остальные стобцы, вычисляют

следующим оразом:

(

)

(7)

(4.2.1.-4)

(

)(

)

(8)

wxy

(4.2.1.-5)

(

)

(9)

(4.2.1.-6)

(10)

(4.2.1.-7)

Âw

(11)

(4.2.1.-8)

Âw

Теперь можно вычислить общий угловой коэффициент b спрямленной характе-

ристической кривой:

(4.2.1.-9)

ÂSxx

Точку пересечения а с осью ординат определяют одинаково как для

стандартного, так и для испытуемого препаратов:

a=y -bx

(4.2.1.-10)

Значения, приведенные в столбце (6) первой рабочей таблицы, теперь заменяют

на значения Y=a+bx, и повторяют цикл вычислений до тех пор, пока разница между

двумя последовательными циклами не станет достаточной маленькой (например, мак-

симальная разница Y между двумя соседними циклами будет меньше 10^-8).

4.2.2 ИССЛЕДОВАНИЯ ДОСТОВЕРНОСТИ

Перед тем, как начать вычисление активностей и границ доверительных интер-

валов следует оценить достоверность (обоснованность) количественного определения.

Если для каждого из препаратов было проведено по три исследования, то отклонение

от линейности может быть рассчитано следующим образом: к Таблице 4.2.1.-2 добав-

ляют тринадцатый столбец и заполняют значениями

(4.2.2.-1)

Суммарное значение данных этого столбца является мерой отклонения от ли-

нейности и приблизительно подчиняется c²-распределению со степенями свободы

равными N-2h. Значимость этой величины можно оценить при помощи Таблицы 8.3 или

соответствующей подпрограммы компьютерног программного обеспечения. Если при

уровне вероятности 0,05 рассчитанная величина является значимой, количественное

определение следует отклонить (см. Раздел 4.2.4).

Если не выявлено зачимого отклонения от линейной регрессии, проверяют отклонение

от паралельности при уровне значимости 0,05, для чего рассчитывают значение при

числе степеней свободы, равном h-1.

(

)

(4.2.2.-2)

4.2.3 ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ И ГРАНИЦ ДОВЕРИТЕЛЬНОГО ИНТЕРВАЛА

Если нет никаких признаков значительного отклонения от линейности и парал-

лельности, вычисляют натуральный логарифм отношения активностейM^'T по форму-

ле:

-a

M^'

(4.2.3.-1)

Вычисляют антилогарифм этого значения. Далее приняв значения t=1,96 и s=1, рас-

считывают границы доверительного интервала как антилогарифм значения:

CMT - (C -1)( x

-x

)±

(C -1)(V

+C(MT x

)

(4.2.3.-2)

где :

, а

-s

4.2.4 НЕДЕЙСТВИТЕЛЬНЫЕ КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если отклонения от линейности, описанные в Разделе 4.2.2, являются статисти-

чески значимыми, результаты количественного определения обычно признают несо-

стоятельными. Если существуют основания для сохранения количественного опреде-

ления, формулы существенно изменяются. Величину t берут равной t-значению

(р=0.05) с тем же числом степеней свободы, которое использовалось при проверке ли-

нейности. Значение s² берут равным значению c², деленному на то же число степеней

свободы (обычно это значение больше 1).

Испытание на параллельность также несколько видоизменяется. Значение c²

для непараллельности делят на соответствующее число степеней свободы. Получен-

ное значение делится на рассчитанное выше значение s², для определения F-

отношения с h-1 и N-2h степенями свободы, которое оценивают обычным способом при

уровне значимости 0,05.

4.3. МЕТОД ЛОГИТ-АНАЛИЗА

Как отмечалось в Разделе 4.1 в некоторых случаях метод логит-анализа является

наиболее приемлемым. Название метода происходит от названия функции логит-

преобразования, которая является обратной функции логистического распределения.

Процедура в этом случае аналогична той, которая описана для метода пробит-

анализа, за исключением того, что видоизменяются две формулы для расчета значе-

ний Ф и Z.

(4.3.-1)

-Y

(4.3.-2)

-Y

(1+

)

4.4. ДРУГИЕ ФОРМЫ КРИВОЙ

Для анализа количественных результатов тестов, предусмотренных Фармакопеей,

почти всегда приемлемыми являются методы пробит- и логит-анализа. Однако, если

форма кривой зависимости «ln(доза)-эффект» отличается от форм этих двух кривых,

следует взять другую зависимость - Φ. Z в этом случае берется как первая производ-

ная от Φ.

Например, если выявляется, что кривая несимметрична, приемлемым может быть рас-

пределение Гомпертца (Gompertz) (метод гомпит-анализа). В этом случае

-eY

-e

=1-e

, а

4.5. МЕДИАННАЯ ЭФФЕКТИВНАЯ ДОЗА

Для некоторых типов количественных определений необходимо определить ме-

дианную эффективную дозу, т.е. дозу, позитивный эффект на которую дают 50% объ-

ектов (ЕД₅₀). Для определения этой дозы можно применить метод пробит-анализа, но

поскольку при этом нет необходимости сравнивать эту дозу со стандартным препара-

том, формулы несколько отличаются.

Примечание: стандартный препарат может эпизодически применяться при ис-

пользовании данного метода с целью проверки достоверности количественного опре-

деления. Обычно результаты количественного определения считаются достоверными,

если рассчитанное значение ЕД₅₀ для стандартного препарата достаточно близко к

принятому значению ЕД₅₀. Значение термина «достаточно близко» в данном контексте

зависит от требований, предъявляемых в конкретной монографии на лекарственный

препарат.

Подготовка рабочих таблиц результатов, полученных для испытуемых препара-

тов, и, при необходимости, для стандартного, описана в Разделе 4.2.1. Проверка ли-

нейности описана в Разделе 4.2.2. Проверка параллельности для данного типа количе-

ственного определения не требуется. Значение ЕД₅₀ для испытуемого препарата Т (и

аналогично для других тестируемых образцов) рассчитывается, как описано в Разделе

4.2.3, при этом изменяются формулы 4.2.3.-1 и 4.2.3.-2.

-a

(4.5.-1)

CMT - (C -1)x

(C -1)(V

Sxx +C(M

)

(4.5.-2)

где :

⁼ Âw

а значение С остается без изменений.

5. ПРИМЕРЫ

В данном разделе приведены примеры, иллюстрирующие применение вышеопи-

санных формул. Примеры подбирались, главным образом, с целью проиллюстриро-

вать статистические методы обработки результатов. Их выбор в каждом случае не оз-

начает преимущество того или иного метода количественного определения перед аль-

тернативными методами, которые допускаются конкретной частной статьей. Для того,

чтобы сделать примеры подходящими для проверки достоверности работы компью-

терных программ, в них приводится большее количество десятичных знаков, чем это

обычно необходимо на практике. Следует также отметить, что существуют и альтерна-

тивные эквивалентные методики расчетов. Результаты, полученные при использова-

нии этих методик, должны быть точно такими же, как и те, которые приводятся в дан-

ных примерах.

5.1. МОДЕЛЬ ПАРАЛЛЕЛЬНЫХ ЛИНИЙ.

5.1.1 ДВУХДОЗОВОЕ МНОГОКРАТНОЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ИС-

ПОЛЬЗОВАНИЕМ СХЕМЫ ПОЛНОЙ РАНДОМИЗАЦИИ.

Количественное определение активности кортикотропина путем подкожной инъек-

ции у крыс.

Стандартный препарат вводили в дозах от 0,25 до 1,0 ЕД на 100 г массы тела.

Предполагалось, что оба испытуемых препарата имели активность 1 ЕД/мг и вводи-

лись в тех же количествах, что и стандартный. Значения эффектов и средние значения

приведены в Таблице 5.1.1.-1.

Таблица 5.1.1.-1.

Измеряемый эффект y - масса аскорбиновой кислоты (мг) на 100 г надпочечника.

PS = 580,4

L_S = -41,8

PT = 567,9

L_T = -39,95

PU = 532,2

L_U = -16,1

H_P =

H_L = ¹²⁰ =20

Далее проводят дисперсионный анализ по формулам, приведенным в Таблицах 3.2.3.-

3 и 3.2.3.-4. Результаты приведены в Таблице 5.1.1.-2.

Таблица 5.1.1.-2.

Дисперсионный анализ

Дисперсия

F-

Сумма квадратов

Вероят

Источник вариации

Степени свободы

(средний квад-

отноше-

отклонений

ность

рат отклонения)

ние

Препараты

6256,6

3128,3

Линейная регрессия

63 830,8

83,38

0,000

Непараллельность

8218,2

4109,1

5,37

0,007

Группы

78 305,7

Неисключенная по-

41 340,9

765,57

грешность

Общая вариация

119 646,6

Анализ подтвердил высокую значимость линейной регрессии. Отклонение от па-

раллельности для препарата U по сравнению со стандартным препаратом, которое

ожидалось на основании анализа графического представления результатов, тем не

менее также оказалось значимым (р = 0,0075). По этой причине препарат U исключают

и анализ повторяют только для препарата Т и стандартного препарата.

Таблица 5.1.1.-3.

Дисперсионный анализ без препарата U.

Дисперсия

F-

Сумма квадратов

Вероят-

Источник вариации

Степени свободы

(средний квад-

отноше-

отклонений

ность

рат отклонений)

ние

Препараты

390,6

Регрессия линейная

66 830,6

90,5

0,000

Непараллельность

34,2

0,05

0,831

Группы

67 255,5

Неисключенная по-

26 587,3

738,54

грешность

Общая вариация

93 842,8

Анализ, проведенный без препарата U, свидетельствует о соответствии услови-

ям как линейности регрессии, так и параллельности, что позволяет перейти к расчету

активности. Используя формулы, приведенные в Разделе 3.2.5, получаем следующие

результаты:

Общий угловой коэффициент:

20(-41,8

,95

)

= -58,970

In4

Натуральный логарифм отношения активностей:

567,9

-58

M^'

¥(-58

,970

)

6683

2 =

66830,6

-738,54

¥2,028

6683

0,9609

(-58,970)

¥2

¥10

Натуральный логарифм доверительных интервалов:

1,0476

¥0,1060

0,0476

¥(1,0476

¥0,1060

¥0,9609)

0,1110

±0,3034

Вычислив антилогарифм, мы найдем отношение активностей, равное 1,11, при

95% доверительном интервале от 0,82 до 1,51.

Умножение на предполагаемую активность препарата Т, дает рассчитанную ак-

тивность 1,11 ЕД/мг при 95% доверительном интервале от 0,82 до 1,51 ЕД/мг.

5.1.2 ТРЕХДОЗОВОЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

СХЕМЫ ЛАТИНСКИХ КВАДРАТОВ.

Количественное определение антибиотика методом диффузии в агар, используя

прямоугольный планшет.

Стандартный препарат имел установленную активность, равную 4855 МЕ/мг.

Предполагаемая активность испытуемого препарата принималась равной 5600 МЕ/мг.

Исходные растворы готовились следующим образом: 25,2 мг стандартного препарата

растворяли в 24,5 мл растворителя и 21,4 мг испытуемого препарата растворяли в

23,95 мл растворителя. Для анализа исходные растворы сначала разводили в соотно-

шении 1/20, а затем, используя степень разведения 1,5.

Латинские квадраты строились при помощи метода, описанного в Разделе 8.6

(см. Таблицу 5.1.2.-I). Результаты, полученные в ходе данного количественного опре-

деления, приведены в Таблице 5.1.2.-II (зоны ингибирования роста в мм ¥10). Средние

значения для групп приведены в Таблице 5.1.2.-III. Графическое представление дан-

ных (см. Рисунок 5.1.2.-I) не дает поводов сомневаться в нормальности распределения

и однородности дисперсий.

Используя формулы, приведенные в Таблицах 3.2.3.-I и 3.2.3.-II, получаем сле-

дующие результаты:

PS = 529,667

L_S = 35,833

PT = 526,333

L_T = 39,333

H_P =

= 2

H_L = ⁷² = 3

Далее проводят дисперсионный анализ по формулам, приведенным в Таблицах

3.2.3.-3 и 3.2.3.-4. Результаты приведены в Таблице 5.1.2.-4.

Анализ показывает значительные различия между строками. Это означает, что

использование схемы Латинских квадратов обеспечивает в данном случае более вы-

сокую точность по сравнению со схемой полной рандомизации. Высокая значимость

регрессии, а также отсутствие значимого отклонения индивидуальных линий регрессии

от параллельности и линейности, подтверждают, что результаты количественного оп-

ределения пригодны для расчета активности.

Таблица 5.1.2.-1.

Расположение препаратов в планшете

S₁

T₁

T₂

S₃

S₂

T₃

T₁

T₃

S₁

S₂

T₂

S₃

T₂

S₃

S₂

S₁

T₃

T₁

S₃

S₂

T₃

T₁

S₁

T₂

S₂

T₂

S₃

T₃

T₁

S₁

T₃

S₁

T₁

T₂

S₃

S₂

Таблица 5.1.2.-2.

Измеренные зоны ингибирования роста в мм ¥10

Среднее

по строкам

161

160

178

187

171

194

175,2 = R₁

151

192

150

172

170

192

171,2 = R₂

162

195

174

161

193

151

172,7 = R₃

194

184

199

160

163

171

178,5 = R₄

176

181

201

202

154

151

177,5 = R₅

193

166

161

186

198

182

181,0 = R₆

Среднее

172,8

179,7

177,2

178,0

174,8

173,5

= C₁

= C₂

= C₃

= C₄

= C₅

= C₆

Таблица 5.1.2.-3.

Средние значения

Стандартный препарат S

Испытуемый препарат T

S₁

S₂

S₃

T₁

T₂

T₃

Среднее

158,67

176,50

194,50

156,17

174,67

195,50

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год) - часть 51