содержание .. 50 51 52 53 ..
ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год) - часть 52
Общий угловой коэффициент:
3
¥(35,833
+
39
,333
)
b
=
= 46,346
In(1,5 )
¥
6
¥
2
Натуральный логарифм отношения активностей:
526,333
-52
,
M'
=
=
-0,023974
T
3
¥4
,
847
,
C
=
,
2 =
8475,0417
-
20,7667
¥2,086
8475,0417
V
=
=
0,2192
2
46,346
¥3¥6
Натуральный логарифм доверительных интервалов:
2
1,0108
¥(-0,0240)±
0,0108
¥(-0,0240)
+
2
¥0,2192
=
-0,02423
±
0,06878
Вычислив антилогарифм, мы найдем отношение активностей, равное 0,9763 при
95% доверительном интервале от 0,9112 до 1,0456.
Поскольку разведения, приготовленные исходя из предполагаемой активности, не бы-
ли точно равноактивными, следует ввести поправочный коэффициент
4855
¥
2
,
=
,
5600
¥
2
,
Перемножая данный коэффициент и предполагаемую активность препарата
5600 МЕ/мг, получаем рассчитанную активность 5456 МЕ/мг при 95% доверительном
интервале от 5092 до 5843 МЕ/мг.
5.1.3 ЧЕТЫРЕХДОЗОВАЯ СХЕМА РАНДОМИЗИРОВАННЫХ БЛОКОВ
Количественное определение антибиотика турбидиметрическим методом
Данное количественное определение проводят с целью установления активно-
сти антибиотика в международных единицах на флакон. Стандартный препарат имел
установленную активность 670 МЕ/мг. Предполагаемая активность испытуемого пре-
парата принималась равной 20 000 ЕД/флакон. Исходя из этих данных исходные рас-
творы готовились следующим образом: 16,7 мг стандартного препарата растворяли в
25 мл растворителя, а содержимое одного флакона испытуемого препарата растворя-
ли в 40 мл растворителя. Для анализа исходные растворы сначала разводили в соот-
ношении 1/40, а затем, используя степень разведения 1,5. Пробирки размещали в во-
дяной бане в соответствии со схемой рандомизированного блока (см. Раздел 8.5). По-
лученные результаты приведены в Таблице 5.1.3.-1.
Анализ Рисунка 5.1.3.-1 не дает оснований сомневаться в справедливости пред-
положения о нормальности распределения данных и однородности дисперсий. Стан-
дартное отклонение S3 несколько велико, но не является причиной для беспокойства.
Используя формулы, приведенные в Таблицах 3.2.3.-1 и 3.2.3.-2, получаем следующие
результаты:
PS = 719,4
LS = -229,1
PT = 687,6
LT = -222
5
HP =
= 1,25
HL = 60 = 1
4
60
Далее проводим дисперсионный анализ по формулам, приведенным в Таблицах
3.2.3.-3 и 3.2.3.-4. Полученные результаты приведены в Таблице 5.1.3.-2.
Таблица 5.1.3.-1.
Показатель оптического поглощения суспензий (¥1000)
Стандартный препарат S
Испытуемый препарат T
Блок
S1
S2
S3
S4
T1
T2
T3
T4
Среднее
1
252
207
168
113
242
206
146
115
181,1
2
249
201
187
107
236
197
153
102
179,0
3
247
193
162
111
246
197
148
104
176,0
4
250
207
155
108
231
191
159
106
175,9
5
235
207
140
98
232
186
146
95
167,4
Среднее
246,6
203,0
162,4
107,4
237,4
195,4
150,4
104,4
Рисунок 5.1.3.-1.
Таблица 5.1.3.-2.
Дисперсионный анализ
Источник вариации
Степени свободы
Сумма квадратов
Дисперсия
F-
Вероятность
отклонений
(средний квад-
отноше-
рат отклонения)
ние
Препараты
1
632,025
632,025
Регрессия линейная
1
101 745,6
101 745,6
1887,1
0,000
Непараллельность
1
25,205
25,205
0,467
0,500
Нелинейность
4
259,14
64,785
1,202
0,332
Группы
7
102 662
Блоки
4
876,75
219,188
4,065
0,010
Неисключенная по-
28
1509,65
53,916
грешность
Общая вариация
39
105 048,4
Следует отметить значительное различие между блоками. Это означает, что
применение схемы рандомизированных блоков позволяет добиться более высокой
точности оценки. Высокая значимость регрессии, а также отсутствие значимого откло-
нения от параллельности и линейности подтверждают, что результаты количественно-
го определения пригодны для расчета активности.
Используя формулы, приведенные в Разделе 3.2.5, получаем следующие ре-
зультаты:
Общий угловой коэффициент:
1¥(-229,
-
222
)
b
=
= -111,255
In(1,5 )
¥
5
¥
2
Натуральный логарифм отношения активностей:
687,6
-71
,
M'
=
=
0,071457
T
4
¥(-111,
255
)
10174
,
C
=
=1,00223
2
101745,6
-53,916
¥2,048
10174
,
V
=
=
0,4110
2
(-111,255 )
¥4
¥5
Натуральный логарифм доверительных интервалов:
2
1,00223
¥0,0715
±
0,00223
¥0,0715
+
2
¥0,4110
=
0,07162
±
0,04293
Вычислив антилогарифм, мы найдем отношение активностей, равное 1,0741 при
95% доверительном интервале от 1,0291 до 1,1214.
Поскольку разведения, приготовленные исходя из предполагаемой активности,
не были точно равноактивными, следует ввести поправочный коэффициент
670¥1
,
=
,
20000
¥1/ 40
Перемножая данный коэффициент и предполагаемую активность препарата
20000 МЕ/флакон, получаем рассчитанную активность 19228 МЕ/флакон при 95% до-
верительном интервале от 18423 до 20075 МЕ/флакон.
5.1.4 ПЯТИДОЗОВОЕ МНОГОКРАТНОЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ИС-
ПОЛЬЗОВАНИЕМ СХЕМЫ ПОЛНОЙ РАНДОМИЗАЦИИ
Количественное определение in vitro активности трех вакцин против Гепатита В
по сравнению со стандартным препаратом
Для каждой из вакцин подготавливали по три независимые серии разведений,
каждая из которых состоит из пяти двукратных разведений. После определенных под-
готовительных операций, предусмотренных процедурой количественного определения,
измеряли оптические плотности растворов. Результаты приведены в Таблице 5.1.4.-1.
Таблица 5.1.4.-1.
Оптические плотности растворов вакцин
Разведение
Стандартный препарат S
Испытуемый препарат T
1:16 000
0,043
0,045
0,051
0,097
0,097
0,094
1:8000
0,093
0,099
0,082
0,167
0,157
0,178
1:4000
0,159
0,154
0,166
0,327
0,355
0,345
1:2000
0,283
0,295
0,362
0,501
0,665
0,576
1:1000
0,514
0,531
0,545
1,140
1,386
1,051
Разведение
Испытуемый препарат U
Испытуемый препарат V
1:16 000
0,086
0,071
0,073
0,082
0,082
0,086
1:8000
0,127
0,146
0,133
0,145
0,144
0,173
1:4000
0,277
0,268
0,269
0,318
0,306
0,316
1:2000
0,586
0,489
0,546
0,552
0,551
0,624
1:1000
0,957
0,866
1,045
1,037
1,039
1,068
Как известно, натуральные логарифмы оптических плотностей раствора имеют
линейную зависимость от логарифмов доз растворенного вещества. Средние резуль-
таты логарифмического преобразования оптических плотностей приведены в Таблице
5.1.4.-2. Графическое представление результатов не выявило каких-либо необычных
закономерностей расположения данных.
Таблица 5.1.4.-2.
Средние значения натуральных логарифмов оптических плотностей растворов
вакцины
S1
− 3,075
T1
− 2,344
U1
− 2,572
V1
− 2,485
S2
− 2,396
T2
− 1,789
U2
− 2,002
V2
− 1,874
S3
− 1,835
T3
− 1,073
U3
− 1,305
V3
− 1,161
S4
− 1,166
T4
− 0,550
U4
− 0,618
V4
− 0,554
S5
− 0,635
T5
0,169
U5
− 0,048
V5
0,047
Рисунок 5.1.4.-1.
Используя формулы, приведенные в Таблицах 3.2.3.-1 и 3.2.3.-2, получаем сле-
дующие результаты:
PS = -9,108
LS = 6,109
PT = -5,586
LT = 6,264
PU = -6,544
LU = 6,431
PV = -6,027
LV = 6,384
36
HP =
3 = 0,6
HL =
= 0,3
5
120
Далее проводим дисперсионный анализ по формулам, приведенным в Таблицах
3.2.3.-3 и 3.2.3.-4. Полученные результаты приведены в Таблице 5.1.4.-3.
Таблица 5.1.4.-3.
Дисперсионный анализ
Дисперсия
F-
Сумма квадратов
Источник вариации
Степени свободы
(средний квад-
отноше-
Вероятность
отклонений
рат отклонений)
ние
Препараты
3
4,475
1,492
Регрессия линейная
1
47,58
47,58
7126
0,000
Непараллельность
3
0,0187
0,006
0,933
0,434
Нелинейность
12
0,0742
0,006
0,926
0,531
Группы
19
52,152
Неисключенная по-
40
0,267
0,0067
грешность
Общая вариация
59
52,42
Высокая значимость регрессии, а также отсутствие значимого отклонения от па-
раллельности и линейности подтверждают, что результаты данного количественного
определения пригодны для расчета активности.
Используя формулы, приведенные в Разделе 3.2.5, получаем следующие ре-
зультаты:
Общий угловой коэффициент:
0,3
¥(6,109
+6,264
+6,431
+
6
,384
)
b
=
=
,
In2
¥
3
¥
4
Натуральный логарифм отношения активностей:
-5,586
-(-9
,
)
M'
=
=
,
T
5¥0,90848
4
,
C
=
,
2 =
47,58
-
0,0067
¥2,021
4
,
V
=
=
3,8436
2
0,9085
¥5
¥3
Натуральный логарифм доверительных интервалов:
2
1,00057
¥0,7752
±
0,00057
¥(1,00057
¥0,7752
+
2
¥3,8436)
=
0,756
±
0,0689
Вычислив антилогарифм, мы найдем отношение активностей вакцин, равное
2,171 при 95% доверительном интервале от 2,027 до 2,327.
Все образцы имеют установленную активность 20 мкг протеина/мл и, следовательно,
найденная активность испытуемого препарата Т равна 43,4 мкг протеина/мл при 95%
доверительном интервале от 40,5 до 46,5 мкг протеина/мл.
Аналогичным образом вычисляют активность и доверительные интервалы для других
испытуемых препаратов. Полученные результаты приведены в Таблице 5.1.4.-4.
Таблица 5.1.4.-4.
Окончательные результаты оценки активностей испытуемых вакцин (мкг протеи-
на/мл) и 95% доверительные интервалы
Нижняя граница
Оценка
Верхняя граница
Вакцина T
40,5
43,4
46,5
Вакцина U
32,9
35,2
37,6
Вакцина V
36,8
39,4
42,2
5.1.5 ДВОЙНАЯ ПЕРЕКРЕСТНАЯ СХЕМА
Количественное определение активности инсулина путем подкожной инъекции у
кроликов
Стандартный препарат вводился в дозах 1 и 2 ЕД/мл. Эквивалентные дозы ис-
пытуемого препарата назначались исходя из предполагаемой активности 40 ЕД/мл.
Кроликам подкожно вводили 0,5 мл соответствующих растворов в соответствии со
схемой, приведенной в Таблице 5.1.5.-1. полученные результаты приведены в таблице
5.1.5.-2. Высокое значение дисперсии свидетельствует о наличии статистически зна-
чимых различий между кроликами и необходимости использовать перекрестную схему
исследования.
Таблица 5.1.5.-1.
Планирование исследования
Группа кроликов
1
2
3
4
День 1
S1
S2
T1
T2
День 2
T2
T1
S2
S1
Таблица 5.1.5.-2.
Эффект y: сумма результатов содержания глюкозы в крови (мг/100 мл) через 1 час и
2,5 часа
Группа 1
Группа 2
Группа 3
Группа 4
S1
T2
S2
T1
T1
S2
T2
S1
112
104
65
72
105
91
118
144
126
112
116
160
83
67
119
149
62
58
73
72
125
67
42
51
86
63
47
93
56
45
64
107
52
53
88
113
92
84
93
117
110
113
63
71
101
56
73
128
116
91
50
65
66
55
39
87
101
68
55
100
91
68
31
71
Среднее
95,6
82,8
69,6
93,3
89,9
66,6
72,4
106,8
Рисунок 5.1.5.-1.
Для рассматриваемой схемы количественного определения применение диспер-
сионного анализа является более сложным, чем рассмотренных ранее схем, потому
что компонента вариации, обусловленная параллельностью, не является независимой
от компонента, обусловленного различием между кроликами. Поэтому проверка па-
раллельности линий регрессий дополнительно требует второй поправочный коэффи-
циент для ошибки среднего квадрата отклонений (дисперсии), который вычисляется
путем вычитания компонента параллельности и пар «взаимодействующих» компонен-
тов из компонента, связанного с различием между кроликами.
За счет повторений в каждой из групп, в дисперсионном анализе присутствуют три па-
ры «взаимодействующих» компонентов:
Дни ¥ препарат; дни ¥ регрессия; дни ¥ параллельность.
Эти коэффициенты характеризуют тенденцию компонентов (препараты, регрес-
сия и параллельность) изменяться в серии «изо дня в день». Таким образом, соответ-
ствующие F-отношения обеспечивают проверку этих компонентов оценки достоверно-
сти количественного определения. Если статистическая значимость полученных оце-
нок F-отношений является высокой, следует с большой осторожностью интерпретиро-
вать результаты количественного определения и, если это возможно, следует повто-
рить количественное определение активности инсулина.
Дисперсионный анализ проводится с использованием формул, приведенных в
Таблицах 3.2.3.-1. - 3.2.3.-3., отдельно как для каждого дня, так и для объединенного
набора данных. Используя формулы, приведенные в Таблицах 3.2.3.-1. и 3.2.3.-2, по-
лучаем следующие результаты:
День 1:
PS = 165,25
LS = -13
PT = 162,25
LT = -8,75
8
96
HP
=
=
4
HL
=
=16
2
6
День 2:
PS = 173,38
LS = -20,06
PT = 176,00
LT = -5,25
8
96
HP
=
=
4
HL
=
=16
2
6
Объединенные данные: PS = 196,31
LS = -16,53
PT = 169,13
LT = -7,00
16
192
HP
=
=
8
HL
=
=
32
2
6
Используя формулы, приведенные в Таблице 3.2.3.-3, получаем следующие ре-
зультаты:
День 1
День 2
Объединенные данные
SSprep = 18,000
SSprep = 13,781
SSprep = 0,141
SSreg = 3784,5
SSreg = 5125,8
SSreg = 8859,5
SSpar = 144,5
SSpar = 1755,3
SSpar = 1453,5
Коэффициенты взаимодействия рассчитывают как:
«День1+День2-
Объединенные данные».
SSdays¥prep = 31,64
SSdays¥reg = 50,77
SSdays¥par = 446,27
Дополнительно, рассчитывают сумму квадратов отклонений вследствие вариа-
ции в серии «изо-дня-в-день»:
1
2
2
SS
N(D +D
) K
=
47
,
days =
1
2
2
и сумму квадратов отклонений вследствие вариаций в блоках (различие между кроли-
ками):
2
SS
=
2
B K
=
3979
,
block
Â
i
где Bi - среднее значение в пересчете на одного кролика.
Далее проводят дисперсионный анализ, результаты которого приведены в Таб-
лице 5.1.5.-3.
Таблица 5.1.5.-3.
Дисперсионный анализ
F-
Степени сво-
Сумма квад-
Средний
Вероят-
Источник вариации
отно-
боды
ратов
квадрат
ность
шение
Непараллельность
1
1453,5
1453,5
1,064
0,311
Дни × Препарат
1
31,6
31,6
0,023
0,880
Дни × Регрессия
1
50,8
50,8
0,037
0,849
Неисключенная
погрешность между
28
38 258,8
1366,4
группами кроликов
Кролики
31
39 794,7
1283,7
Препараты
1
0,14
0,14
0,001
0,975
Регрессия
1
8859,5
8859,5
64,532
0,000
Дни
1
478,5
478,5
3,485
0,072
Дни × непараллельн
1
446,3
446,3
3,251
0,082
ость.
Неисключенная по-
28
3844,1
137,3
грешность в преде-
лах группы кроликов
Итого
63
53 423,2
Дисперсионный анализ подтверждает, что полученные данные удовлетворяют
необходимым условиям обоснованности оценки активности инсулина: высокая стати-
стическая значимость линейной регрессии, отсутствие статистически значимых откло-
нений от параллельности и незначимые все три коэффициента взаимодействия.
Используя формулы, приведенные в Разделе 3.2.5, получаем следующие ре-
зультаты:
Общий угловой коэффициент:
32
¥(-16,53
-7
)
b
=
= -33,95
In2
¥
16
¥
2
Натуральный логарифм отношения активностей:
169,13
-16
,
M'
=
=
0,00276
T
2
¥(-33
,95
)
885
,
C
=
,
2 =
8859,5
-137,3
¥2,048
885
,
V
=
=
0,2402
2
(-33,95)
¥2
¥16
Натуральный логарифм доверительного интервала:
2
1,0695
¥0,00276
±
0,0695
¥(1,0695
¥0,00276
+
2
¥0,2402)
=
0,00295
±
,
Вычислив антилогарифм, мы найдем отношение активностей, равное 1,003 при
95% доверительном интервале от 0,835 до 1,204.
Умножив на AT = 40, получим активность 40,1 единиц на миллилитр при 95% до-
верительном интервале от 33,4 до 48,2 единиц на миллилитр.
5.2. МОДЕЛЬ УГЛОВЫХ КОЭФФИЦИЕНТОВ
5.2.1
(0,3,3) СХЕМА ПОЛНОЙ РАНДОМИЗАЦИИ
Количественное определение активности фактора VIII
Предположим, в лаборатории выполняют количественное определение активно-
сти фактора VIII в концентратах по образованию окрашенного продукта. Предположим
также, что лаборатория не имеет опыта в проведении количественного определения
подобного рода, но тем не менее попыталась выполнить эту процедуру. Готовят по три
эквивалентных разведения для стандартного и испытуемого препаратов. Дополни-
тельно готовят препарат «плацебо», хотя и не ожидается наличия линейной зависимо-
сти эффекта от дозы в области малых доз. Число повторений для каждого из разведе-
ний равно восьми, что несколько больше, чем требуется при выполнении ежедневных
количественных определений.
Графическое представление данных показывает, что зависимость результата от
дозы действительно не линейна в области малых доз. На этом основании результаты,
полученные при анализе препарата «плацебо», не будут использоваться при расчетах
( в дальнейшем для подтверждения данного решения, безусловно нужно будет провес-
ти повторные определения с препаратом «плацебо»). Используя формулы, приведен-
ные в Таблицах 3.3.3.1-1 и 3.3.3.1.-2, получаем следующие результаты:
PS = 0,6524
PT = 0,5651
LS = 1,4693
LT = 1,2656
aS = 0,318
at = 0,318
bS = 0,329
bT = 0,271
GS = 0,1554
GT = 0,1156
JS = 4,17¥10-8
JT = 2,84¥10-6
и
HI = 0,09524
a’ = 0,05298
K = 1,9764
Далее выполняют дисперсионный анализ по формулам, приведенным в Табли-
цах 3.3.3.1.-3 и 3.3.3.1.-4.
Высокая значимость регрессии и отсутствие значимых отклонений от линейности и
точки пересечения оси ординат, дают основание для расчета активности.
Угловой коэффициент стандартного препарата
6
¥1,469
-
36
¥0,0530
b'
=
=
0,0822
S
84
Угловой коэффициент испытуемого препарата
6
¥1.266
-36
¥0,0530
b'
=
=
0,0677
T
84
По формуле 3.3.5.1.-3 получаем
0,0677
R =
=
0,823
0,0822
0,08222
C
=
=
,
2
-6
2
0,0822
-
3,86×10
¥2,018
¥0,0357
'
K
=
0,000083
¥0,75
=
0,000062
а 95% доверительный интервал равен
0823 ±
0,000083
¥1,678 + 0,000062
¥(-1,646) = 0,823
±
0,006
Таким образом, полученная активность равна 0,823 с 95% доверительным ин-
тервалом от 0,817 до 0,0826.
Таблица 5.2.1.-1.
Показатели оптической плотности
Плацебо
Стандартный препарат S
Испытуемый препарат T
(в МЕ/мл)
(в МЕ/мл)
Концен-
B
S1
S2
S3
T1
T2
T3
трация
0,01
0,02
0,03
0,01
0,02
0,03
0,022
0,133
0,215
0,299
0,120
0,188
0,254
0,024
0,133
0,215
0,299
0.119
0,188
0,253
0,024
0,131
0,216
0,299
0,118
0,190
0,255
0,026
0,136
0,218
0,297
0,120
0,190
0,258
0,023
0,137
0,220
0,297
0,120
0,190
0,257
0,022
0,136
0,220
0,305
0,121
0,191
0,257
0,022
0,138
0,219
0,299
0,121
0,191
0,255
0,023
0,137
0,218
0,302
0,121
0,190
0,254
Среднее
0,0235
0,1351
0,2176
0,2996
0,1200
0,1898
0,2554
Рисунок 5.2.1.-1.
Таблица 5.2.1.-2.
Дисперсионный анализ
Дисперсия
Сумма квадратов
Источник вариации
Степени свободы
(средний квад-
F-отношение
Вероятнос
отклонений
рат отклонения)
Линейная регрессия
2
0,1917
0,0958
24 850
0,000
Точки пересечения
1
3¥10−9
3¥10−9
7¥10−4
0,978
Нелинейность
2
2¥10−5
1¥10−5
2,984
0,061
Группы
5
0,1917
Неисключенная
42
1,62¥10−4
3,86¥10−6
погрешность
Итого
47
0,1919
5.2.2
(0,4,4,4) СХЕМА ПОЛНОЙ РАНДОМИЗАЦИИ
Количественное определение активности вакцины против гриппа in vitro
Содержание антигена гемаглютинина (НА) в двух вакцинах против гриппа опре-
деляли методом радиальной иммунодиффузии. На этикетках обеих вакцин была ука-
зана активность 15 мкг НА на одну дозу, что эквивалентно содержанию 30 мкг НА/мл.
Стандартный препарат имел установленную активность 39 мкг НА/мл.
Исследовали четыре концентрации стандартной и испытуемой вакцин, рассчи-
танных исходя из предполагаемых и обозначенных на этикетке активностей; в каждом
случае число повторений равно двум. После установления равновесия между внутрен-
ним и внешним реагентами, измерялась площадь кольцевых зон осадка. Результаты
приведены в Таблице 5.2.2.-1.
Графическое представление данных не выявило никаких необычных особенно-
стей расположения данных.
Используя формулы, приведенные в Таблицах 3.3.3.1-1 и 3.3.3.1.-2, получаем
следующие результаты:
PS = 108,2
PT = 103,85
PU = 85,8
LS = 301,1
LT = 292,1
LU = 234,1
aS = 141,0
aT = 116,7
aU = 139,8
bS = 61,2
bT = 64,95
bU = 39,2
GS = 3114,3
GT = 2909,4
GU = 1917,3
JS = 0,223
JT = 2,227
JU = 0,083
и
HI = 0,0093
a’ = 11,04
K = 14785,8
Далее выполняют дисперсионный анализ по формулам, приведенным в Табли-
цах 3.3.3.1.-3 и 3.3.3.1.-4. Результаты представлены в Таблице 5.2.2.-2.
Высокая значимость регрессии и отсутствие значимых отклонений от линейности
и точки пересечения позволяют рассчитать активность.
Угловой коэффициент стандартного препарата
6
¥301,-60
¥1
,
b'
=
=
6,356
S
180
Угловой коэффициент испытуемой вакцины Т
6
¥292,-60
¥1
,
b'
=
=
6,056
T
180
Угловой коэффициент испытуемой вакцины U
6
¥234,
-60
¥1
,
b'
=
=
,
U
180
В результате получаем следующие отношения активностей 6,056/6,356=0,953 для вак-
цины Т и 4.123/6.356=0,649 для вакцины U.
6,3562
C
=
=
,
2
2
6,356
-1,068
¥2,179
¥0,0444
'
K
=
0,0056
¥0,625
=
0,0035
Доверительные интервалы вычисляют по формуле 3.3.5.1.-4.
Для вакцины Т
0,955 ±
0,0056
¥1,913 + 0,0035
¥(-1,913) = 0,955
±
0,063
Для вакцины U
0,649 ±
0,0056
¥1,423 + 0,0035
¥(-1,301) = 0,649
±
0,058
Содержание НА в 1 мл вакцины находят путем умножения отношения активно-
стей и доверительных интервалов на предполагаемую активность 30 мкг/мл. Результа-
ты приведены в Таблице 5.2.2.-3.
Таблица 5.2.2.-1.
Площадь зоны осадка (мм2)
Концентра-
Стандартный препарат
Испытуемый препарат
Испытуемый препарат
ция
S
T
U
( мкг/мл)
I
II
I
II
I
II
7,5
18,0
18,0
15,1
16,8
15,4
15,7
15,0
22,8
24,5
23,1
24,2
20,2
18,6
22,5
30,4
30,4
28,9
27,4
24,2
23,1
30,0
35,7
36,6
34,4
37,8
27,4
27,0
Рисунок 5.2.2.-1.
Таблица 5.2.2.-2.
Дисперсионный анализ
Дисперсия
Сумма
F-
Степени
(средний
Вероят-
Источник вариации
квадратов
отно-
свободы
квадрат
ность
отклонений
шение
отклонения)
Линейная регрессия
3
1087,7
362,6
339,5
0,000
Точки пересечения
2
3,474
1,737
1,626
0,237
Нелинейность
6
5,066
0,844
0,791
0,594
Группы
11
1096,2
Неисключенная по-
12
12,815
1,068
грешность
Общая вариация
23
1109,0
Таблица 5.2.2.-3.
Оценка содержания НА (мкг/доза)
Нижняя граница
Оценка
Верхняя граница
Вакцина T
13,4
14,3
15,3
Вакцина U
8,9
9,7
10,6
5.3. АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ЭФФЕКТЫ
5.3.1 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПРОБИТ-АНАЛИЗА ПРИ СРАВНЕНИИ ИСПЫТУЕ-
МОГО ПРЕПАРАТА СО СТАНДАРТНЫМ
Количественное определение вакцины против дифтерии in vitro
Выполняли количественное определение вакцины против дифтерии (предпола-
гаемая активность 140 МЕ/флакон) по отношению к стандартному препарату (установ-
ленная активность 132 МЕ/флакон). На основании этих данных готовили эквивалент-
ные дозы и вводили случайным образом группам морских свинок. Через определенный
период времени после введения, это вызывало гибель животных вследствие пораже-
ния дифтерийным токсином. Подсчитывали число выживших свинок. Полученные ре-
зультаты приведены в Таблице 5.3.1.-1.
Затем эти результаты переносили в первую рабочую таблицу, остальные ее
столбцы заполняют в соответствии с рекомендациями, приведенными в Разделе 4.2.1.
В Таблице 5.3.1.-2. приведены результаты первого цикла процедуры итерационного
анализа.
Далее суммируют данные последних шести столбцов для каждого из препаратов
и результаты заносят во вторую рабочую таблицу (см. Таблицу 5.3.1.-3). Остальные
столбцы заполняют данными, полученными при использовании формул 4.2.1.-4. -
4.2.1.-10. В результате получают значение общего углового коэффициента b, равное
1,655.
Далее значения Y первой рабочей таблицы заменяют значениями a+bx и выпол-
няют второй цикл (см. Таблицу 5.3.1.-4).
Циклы повторяют до тех пор, пока разница между результатами двух последова-
тельных циклов не станет достаточно маленькой. В результате получают вторую рабо-
чую Таблицу 5.3.1.-5.
Проверку линейности проводят как описано в Разделе 4.2.2. Значение c2 для 4
степеней свободы равно 0,851+1,070=1,921, чему соответствует значение p=0,750, ко-
торое не является статистически значимым.
Поскольку отклонение от линейности не является статистически значимым, про-
верку отклонения от параллельности можно выполнить, как описано в том же разделе.
Значение c2 для 1 степени свободы равно
2
1
,
(16,71
+
17,27
)
-
=
0,001
,
5,89
чему соответствует значение p=0,974, которое также не является статистически
значимым.
Таблица 5.3.1.-1.
Исходные данные для количественного определения
Стандартный препарат (S)
Испытуемый препарат (T)
Установленная активность
Предполагаемая активность
132 МЕ/флакон
140 МЕ/флакон
Доза
Число зара-
Число выжив-
Доза
Число зара-
Число выжив-
(МЕ/мл)
женных жи-
ших
(МЕ/мл)
женных жи-
ших
вотных
вотных
1,0
12
0
1,0
11
0
1,6
12
3
1,6
12
4
2,5
12
6
2,5
11
8
4,0
11
10
4,0
11
10
Теперь натуральный логарифм отношения активностей может быть рассчитан,
как описано в Разделе 4.2.3.
-1,721
-(-2
,050
)
M'
=
=
,
T
2,401
Далее
2
2,401
¥5,893
C
=
=
,
2
2
2
2,401
¥5,893
-1
¥
,
1
1
V =
+
=
,
1
,
1
,
Натуральный логарифм доверительного интервала:
2
0,155
-
0,013
±
0,127(0,649
+1,127
¥0,036
)
=0,142
±
0,288
Вычислив антилогарифм и умножив полученное значение на предполагаемую
активность 40 МЕ/флакон, получим оценку активности 160,6 МЕ/флакон и 95% довери-
тельный интервал от 121,0 до 215,2 МЕ/флакон.
Таблица 5.3.1.-2.
Первая рабочая таблица для первого цикла итерации
Вак-
Доза
n
r
x
p
Y
Φ
Z
y
w
wx
wy
wx2
wy2
wx
цина
S
1,0
12
0
0,000
0,000
0
0,5
0,399
− 1,253
7,64
0,00
− 9,57
0,00
12,00
0,0
1,6
12
3
0,470
0,250
0
0,5
0,399
− 0,627
7,64
3,59
− 4,79
1,69
3,00
− 2,
2,5
12
6
0,916
0,500
0
0,5
0,399
0,000
7,64
7,00
0,00
6,41
0,00
0,0
4,0
11
10
1,386
0,909
0
0,5
0,399
1,025
7,00
9,71
7,18
13,46
7,36
9,9
T
1,0
11
0
0,000
0,000
0
0,5
0,399
− 1,253
7,00
0,00
− 8,78
0,00
11,00
0,0
1,6
12
4
0,470
0,333
0
0,5
0,399
− 0,418
7,64
3,59
− 3,19
1,69
1,33
− 1,
2,5
11
8
0,916
0,727
0
0,5
0,399
0,570
7,00
6,42
3,99
5,88
2,27
3,6
4,0
11
10
1,386
0,909
0
0,5
0,399
1,025
7,00
9,71
7,18
13,46
7,36
9,9
Таблица 5.3.1.-3.
Вторая рабочая таблица для первого цикла итерации
Вакцина
Sw
Swx
Swy
Swx2
Swy2
Swxy
Sxx
Sxy
Syy
x
y
a
S
29,92
20,30
− 7,18
21,56
22,36
7,70
7,79
12,58
20,64
0,68
− 0,24
− 1,36
T
28,65
19,72
− 0,80
21,03
21,97
12,11
7,46
12,66
21,95
0,69
− 0,03
− 1,17
Таблица 5.3.1.-4.
Первая рабочая таблица для второго цикла итерации
Вак-
Доза
n
r
x
p
Y
Φ
Z
y
w
wx
wy
wx2
wy2
w
цина
S
1.0
12
0
0.000
0.000
−1.36
0.086
0.158
−1.911
3.77
0.00
− 7.21
0.00
13.79
0
1.6
12
3
0.470
0.250
− 0.58
0.279
0.336
− 0.672
6.74
3.17
− 4.53
1.49
3.04
−
2.5
12
6
0.916
0.500
0.15
0.561
0.394
− 0.001
7.57
6.94
− 0.01
6.36
0.00
−
4.0
11
10
1.386
0.909
0.93
0.824
0.258
1.260
5.07
7.03
6.39
9.75
8.05
8
T
1.0
11
0
0.000
0.000
− 1.17
0.122
0.202
− 1.769
4.20
0.00
− 7.43
0.00
13.14
0
1.6
12
4
0.470
0.333
− 0.39
0.349
0.370
− 0.430
7.23
3.40
− 3.11
1.60
1.34
−
2.5
11
8
0.916
0.727
0.35
0.637
0.375
0.591
6.70
6.14
3.96
5.62
2.34
3
4.0
11
10
1.386
0.909
1.13
0.870
0.211
1.311
4.35
6.03
5.70
8.36
7.48
7
Таблица 5.3.1.-5.
Вторая рабочая таблица после достаточного количества циклов итерации
Вакцин
Sw
Swx
Swy
Swx2
Swy2
Swxy
Sxx
Sxy
Syy
x
y
a
а
S
18,37
14,80
− 2,14
14,85
17,81
5,28
2,93
7,00
17,56
0,81
− 0,12
− 2,05
T
17,96
12,64
− 0,55
11,86
18,35
6,76
2,96
7,15
18,34
0,70
− 0,03
− 1,72
Рисунок 5.3.1.-1.
5.3.2 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ЛОГИТ-АНАЛИЗА И ДРУГИХ АНАЛОГИЧНЫХ МЕ-
ТОДОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРИ СРАВНЕНИИ ИСПЫТУЕ-
МОГО ПРЕПАРАТА СО СТАНДАРТНЫМ ПРЕПАРАТОМ
Результаты будут описаны для случая, в котором метод логит-анализа и другие
«классические» методы данного типа используют данные, предоставленные в Разделе
5.3.1. В данной конкретной ситуации приведенный материал следует рассматривать
как упражнения, а не в качестве альтернативного методу пробит-анализа. Другая фор-
ма кривой может быть принята только в том случае, если необходимость замены под-
тверждается экспериментальными данными или теоретическими расчетами.
Таблица 5.3.2.-1.
Результаты, полученные при использовании альтернативных методов анализа
Логит
Гомпит
Угловой(*)
Y
Φ
1
e
1
1
-
e-
1 sinY
+
Y
1
+
e-
2
2
Y
Y
Z
Y-e
1
e-
e
cos
Y
Y
2
(1+
e-
)
2
Угловой коэффици-
4.101
2.590
1.717
ент b
c2 (линейность)
2.15
3.56
1.50
c2 (параллельность)
0.0066
0.168
0.0010
Активность
162.9
158.3
155.8
Нижняя граница
121.1
118.7
122.6
Верхняя граница
221.1
213.3
200.7
Ï
1
Ф
=
0
и
Z
=
0,
приY
<
-
p
Ô
(*)
2
Ì
1
Ô
Ф
=1
и
Z
=
0,
приY
>
p
Ó
2
5.3.3 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭД50 ВЕЩЕСТВА, ИСПОЛЬЗУЯ МЕТОД ПРОБИТ-АНАЛИЗА
Количественное определение in vivo вакцины против полиомиелита, применяемой
орально
Для количественного определения ЕД50 вакцины против полиомиелита было ис-
следовано 10 различных разведений 50 мкл исходной вакцины на чашках Элиса по 8
повторений в каждом случае. Полученные результаты приведены в Таблице 5.3.3.-1.
Таблица 5.3.3.-1.
Разведения (10¥ мкл исходной вакцины)
− 3,5
− 4,0
− 4,5
− 5,0
− 5,5
− 6,0
−6,5
−7,0
−7,5
−8,0
+
+
+
+
−
−
−
−
−
−
+
+
+
+
−
−
−
−
−
−
+
+
−
−
−
−
−
−
−
−
+
+
+
+
−
−
−
−
−
−
+
+
+
−
−
−
−
−
−
−
+
+
+
+
+
−
−
−
−
−
+
+
+
+
+
−
+
−
−
−
+
+
+
+
−
+
−
−
−
−
Полученные результаты заносят в первую рабочую таблицу, а остальные ее
столбцы заполняют как описано в Разделе 4.2.1. В Таблице 5.3.3.-2 приведены резуль-
таты первого цикла процедуры итерации, описанной в данном разделе.
Таблица 5.3.3.-2.
Первая рабочая таблица для первого цикла
Вакци-
Доза
n
r
x
p
Y
Φ
Z
y
w
wx
wy
wx2
wy2
wxy
на
T
10−3,5
8
0
− 8,06
0,000
0,00
0,5
0,399
− 1,253
5,09
− 41,04
− 6,38
330,8
8,00
51,4
10−4,0
8
0
− 9,21
0,000
0,00
0,5
0,399
− 1,253
5,09
− 46,91
− 6,38
432,0
8,00
58,8
10−4,5
8
1
− 10,36
0,125
0,00
0,5
0,399
− 0,940
5,09
− 52,77
− 4,79
546,8
4,50
49,6
10−5,0
8
2
− 11,51
0,250
0,00
0,5
0,399
− 0,627
5,09
− 58,63
− 3,19
675,1
2,00
36,7
10−5,5
8
6
− 12,66
0,750
0,00
0,5
0,399
0,627
5,09
− 64,50
3,19
816,8
2,00
− 40,4
10−6,0
8
7
− 13,82
0,875
0,00
0,5
0,399
0,940
5,09
− 70,36
4,79
972,1
4,50
− 66,1
10−6,5
8
7
− 14,97
0,875
0,00
0,5
0,399
0,940
5,09
− 76,23
4,79
1140,8
4,50
− 71,7
10−7,0
8
8
− 16,12
1,000
0,00
0,5
0,399
1,253
5,09
− 82,09
6,38
1323,1
8,00
− 102,
10−7,5
8
8
− 17,27
1,000
0,00
0,5
0,399
1,253
5,09
− 87,95
6,38
1518,9
8,00
− 110,
10−8,0
8
8
− 18,42
1,000
0,00
0,5
0,399
1,253
5,09
− 93,82
6,38
1728,2
8,00
− 117,
Затем данные оставшихся шести столбцов суммируют для каждого из препара-
тов и результаты заносят во вторую рабочую таблицу (см. Таблицу 5.3.3.-3). Осталь-
ные столбцы заполняют данными, рассчитанными по формулам 4.2.1.-4 - 4.2.1.-10. В
результате получают общий угловой коэффициент b, равный -0,295.
Таблица 5.3.3.-3.
Вторая рабочая таблица для первого цикла
Вакци-
Σw
Σwx
Σwy
Σwx2
Σwy2
Σwxy
Sxx
Sxy
Syy
a
на
T
50.93
− 674.3
11.17
9484.6
57.50
− 312.32
556.92
− 164.43
55.05
− 13.24
0.219
− 3.690
Далее значения Y первой рабочей таблицы заменяют на значения a+bx и вы-
полняют второй цикл итерации. Циклы повторяют до тех пор, пока разница между ре-
зультатами двух последовательных циклов не станет достаточно маленькой. В резуль-
тате получают вторую рабочую Таблицу 5.3.3.-4.
Таблица 5.3.3.-4.
Вторая рабочая таблица после проведения достаточного числа циклов
Вакци
Sw
Swx
Swy
Swx2
Swy2
Swxy
Sxx
Sxy
Syy
x
y
a
на
T
19,39
− 238,2
0,11
2981,1
26,05
− 37,45
55,88
− 36,11
26,05
− 12,28
0,006
− 7,9
Проверку линейности проводят как описано в Разделе 4.2.2. Значение c2 для 8
степеней свободы равно 2.711, чему соответствует значение p=0,951, которое не явля-
ется статистически значимым.
Теперь оценка отношения активностей может быть получена, как описано в Раз-
деле 4.5.
-(-7,931)
M'
=
=
-1
,
T
-0,646
Далее
2
(-0,646)
¥5
,
C
=
=
,
2
2
2
(-0,646)
¥55,883
-1
¥
,
1
V =
=
0,052
1
,
Натуральный логарифм доверительного интервала
2
-14,692
-(-2,420)
±
0,197
¥(2,882
+1,197
¥0,009
=
-12,272
±
0,754
Эта оценка все еще выражена в виде натурального логарифма разведений. Для
того, чтобы выразить активность в ln(ЕД50)/мл, результаты преобразуют в
'
Ê1000ˆ
-M
+lnÁ
˜
T
Ë
50
¯
Поскольку активность такого типа вакцин обычно выражают с использованием
десятичного логарифма log10(ЕД50)/мл, полученный результат следует разделить на
ln(10). В результате получим оценку активности 6.36 log10(ЕД50)/мл при 95% довери-
тельном интервале 6.30-6.96log10(ЕД50)/мл.
Рисунок 5.3.3.-1.
6 ОБЪЕДИНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
6.1. ВВЕДЕНИЕ
С целью удовлетворения требованиям Фармакопеи, часто необходимо повторе-
ние независимых количественных определений и объединение полученных результа-
тов. В связи с этим возникает вопрос, в каких случаях возможно объединение резуль-
татов и каким образом это осуществляется.
Два количественных определения могут быть рассмотрены как действительно
независимые, если выполнение любого из них не влияет на вероятности появления
содержание .. 50 51 52 53 ..