ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год)

выполняемого следующим образом: инокулируют объединенный образец амнио-

тических жидкостей общим объемом 5 мл в аллантоисную и амниотическую по-

лости яиц SPF. Объемы введения - по 0,5 мл. Контрольные яйца выдерживают

испытание, если ни в одном случае не обнаруживаются признаки присутствия ге-

магглютинирующих агентов.

Вирусы птичьего лейкоза. Используют образец объединенных амниоти-

ческих жидкостей контрольных яиц общим объемом 10 мл. Проводят усиление пу-

тем пяти пассажей на клеточных культурах куриных эмбрионов, не содержащих

вирусов лейкоза; испытание на птичий лейкоз выполняют с использованием кле-

ток, полученных в пятом пассаже. Контрольные яйца выдерживают испытание,

если не обнаруживается признаков присутствия вирусов лейкоза.

Другие посторонние агенты. Образцы объединенных амниотических жид-

костей контрольных яиц по 5 мл прививают на человеческие и обезьяньи клеточ-

ные культуры. Клеточные культуры наблюдают в течение 14 дней. Контрольные

яйца выдерживают испытание, если не обнаруживается признаков присутствия

посторонних агентов. Результаты испытания считают достоверными, если не ме-

нее 80% привитых культур выживают до окончания периода наблюдения.

2.6.17. ИСПЫТАНИЕ НА АНТИКОМПЛЕМЕНТАРНУЮ АК-

ТИВНОСТЬ ИММУНОГЛОБУЛИНА

Для определения антикомплементарной активности (АКА) иммуноглобулина

определенное количество испытуемого материала (10 мг иммуноглобулина) под-

вергают инкубации с определенным количеством комплемента морских свинок (20

СН₅₀), после чего титруют остаток комплемента; антикомплементарная активность

выражается как поглощение комплемента, в процентах к контрольному образцу

комплемента, принимаемому за 100%.

За гемолитическую единицу активности комплемента (СН₅₀) принимают та-

кое его количество, которое в данных реакционных условиях приводит к лизису

2,5¥108 из общего количества 5

¥10⁸ оптимальным образом сенсибилизированных

эритроцитов.

Основной раствор магния и кальция. 1,103 г хлорида кальция R и 5,083 г

хлорида магния R растворяют в воде и разбавляют до 25 мл тем же растворите-

лем.

Основной буферный раствор барбитала. 207,5 г хлорида натрия R и 25,48

г барбитала натриевой соли R растворяют в 4000 мл воды R и доводят значение

рН до 7,3 1М хлористоводородной кислотой. Добавляют 12,5 мл основного рас-

твора кальция и магния и разбавляют водой R до 5000 мл. Фильтруют через мем-

бранный фильтр (размер пор 0,22 мкм). Хранят при 4⁰С в стеклянных контейне-

рах.

Раствор желатина. 12,5 г желатина растворяют приблизительно в 800 мл

воды R и нагревают на водяной бане до кипения. Охлаждают до 20⁰С и разбавля-

ют до 10 л водой R. Фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,22 мкм).

Хранят при 4⁰С. Использованию подлежат только прозрачные растворы.

Раствор цитрата. 8,0 г цитрата натрия R, 4,2 г хлорида натрия R и 20,5

г глюкозы R растворяют в 750 мл воды R. Доводят значение рН до 6,1 раствором

лимонной кислоты R концентрацией 100 г/л и разбавляют водой R до 1000 мл.

Буферный раствор желатина и барбитала. 4 объема раствора желатина

добавляют к 1 объему основного буферного раствора барбитала и перемешива-

ют. При необходимости доводят значение рН до 7,3, используя 1 М раствор гид-

роксида натрия или 1 М хлористоводородную кислоту. Хранят при 4⁰С. Еже-

дневно готовят свежие растворы.

Стабилизированная овечья кровь. Смешивают равные объемы овечьей

крови и раствора цитрата и перемешивают. Хранят при 4⁰С не менее 7 и не более

28 дней. (Стабилизированная овечья кровь и эритроциты овцы доступны в раз-

личных коммерческих источниках).

Гемолизин. Антисыворотку против красных кровяных телец овцы готовят с

использованием кроликов. (Такие антисыворотки доступны в различных коммер-

ческих источниках).

Комплемент морских свинок. Готовят пул сыворотки из крови не менее 10

морских свинок. Сыворотку отделяют от свернувшейся крови центрифугировани-

ем при температуре около 4⁰С. Сыворотку хранят в небольших количествах при

температуре ниже -70⁰.

МЕТОД

Приготовление стандартизированной 5% суспензии эритроцитов ов-

цы. Эритроциты овцы отделяют центрифугированием соответствующего объема

стабилизированной овечьей крови, промывают не менее трех раз буферным рас-

твором желатина и барбитала и готовят в том же растворе суспензию с содержа-

нием клеток 5 объемных процентов. Плотность клеток в суспензии определяют

следующим образом: 0,2 мл добавляют к 2,8 мл воды R и центрифугируют лизи-

рованный раствор 5 минут при 1000 g; плотность клеток соответствует требовани-

ям, если оптическая плотность (2.2.25) супернатанта при 541 нм составляет

0,62±0,01. Плотность клеток корректируют добавлением буферного раствора же-

латина и барбитала в соответствии с формулой:

0,62

где :

окончательный объем после коррекции,

исходный объем,

оптическая плотность исходной суспензии при 541 нм.

Суспензия после коррекции содержит около 1¥109 клеток в миллилитре.

Титрование гемолизина

Готовят разведения гемолизина в соответствии с Таблицей 2.6.17.-1.

Таблица 2.6.17.-1

Требуемое разве-

Готовят с использованием

дение гемолизина

Буферный раствор желатина и бар-

Гемолизин

битала

Объем

Разведение (1 : …)

Объем (мл)

(мл)

7,5

0,65

неразбавленный

0,1

0,90

неразбавленный

0,1

1,80

7,5

0,2

100

1,80

0,2

150

1,00

1,0

200

1,00

100

1,0

300

1,00

150

1,0

400

1,00

200

1,0

600

1,00

300

1,0

800

1,00

400

1,0

1200

1,00

600

1,0

1600

1,00

800

1,0

2400

1,00

1200

1,0

3200*

1,00

1600

1,0

4800*

1,00

2400

1,0

*1,0 мл смеси отбрасывают

К каждой пробирке из серии разведении гемолизина, начиная с разведения

1:75, добавляют по 1,0 мл 5% суспензии эритроцитов овцы и перемешивают. Ин-

кубируют при 37⁰С в течение 30 минут.

По 0,2 мл каждой из этих инкубированных смесей переносят в новые про-

бирки и добавляют по 1,10 мл буферного раствора желатина и барбитала и по 0,2

мл разбавленного комплемента морских свинок (например, в разведении 1:150).

Эти операции выполняют дважды.

В качестве контрольного образца негемолизированных клеток готовят три

пробирки, содержащие по 1,4 мл буферного раствора желатина и барбитала и 0,1

мл 5% суспензии эритроцитов овцы.

В качестве полностью гемолизированного контрольного образца готовят три

пробирки, содержащие по 1,4 мл воды R и 0,1 мл 5% суспензии эритроцитов овцы.

Все пробирки инкубируют при 37⁰С в течение 60 минут и центрифугируют 5

минут при 1000 g. Измеряют оптическую плотность (2.2.25) супернатантов при 541

нм и вычисляют для каждой из пробирок степень гемолиза, в процентах, по фор-

муле:

A -

¥100,

-A

где :

А_а

оптическая плотность в пробирках с разведениями гемолизина,

Аb

средняя оптическая плотность в трех пробирках с полным гемолизом,

А₁

средняя оптическая плотность в трех пробирках без гемолиза.

На миллиметровой бумаге строят график зависимости степени гемолиза в

процентах (по оси ординат) от обратного значения соответствующего разведения

гемолизина (по оси абсцисс). Определяют из графика оптимальное разведение

гемолизина. Выбирают разведение таким образом, чтобы дальнейшее увеличе-

ние количества гемолизина не приводило бы к существенному изменению степени

гемолиза. Это разведение принимают за одну минимальную гемолитическую еди-

ницу (1 МГЕ) в 1,0 мл. Оптимальное гемолитическое разведение гемолизина для

приготовления сенсибилизированных эритроцитов овцы составляет 2 МГЕ/мл.

Результат титрования гемолизина считают достоверным при условии, что

максимальная степень гемолиза составляет от 50 до 70%. Если максимальная

степень гемолиза не находится в этих пределах, титрование повторяют с исполь-

зованием более или менее разбавленного раствора комплемента.

Приготовление оптимизированных сенсибилизированных эритроци-

тов (гемолитической системы).

Готовят подходящий объем разбавленного гемолизина с содержанием 2

МГЕ/мл и равный объем стандартизированной 5% суспензии эритроцитов овцы.

Добавляют разведение гемолизина к стандартизированной суспензии клеток и пе-

ремешивают. Инкубируют при 37⁰С в течение 15 минут, после чего хранят при

температуре от 2⁰С до 8⁰С и используют в течение 6 часов.

Титрование комплемента

Готовят подходящее разведение комплемента (например, 1:250) с исполь-

зованием буферного раствора желатина и барбитала и выполняют титрование в

двух повторностях в соответствии с Таблицей 2.6.17.-2.

Таблица 2.6.17.-2.

Номер пробирки

Объем разведения компле-

Объем буферного раство-

мента (например, 1:250), в мл

ра желатина и барбитала, в

мл

0,1

1,2

0,2

1,1

0,3

1,0

0,4

0,9

0,5

0,8

0,6

0,7

0,6

0,8

0,5

0,9

0,4

1,0

0,3

1,1

0,2

1,2

0,1

Три пробирки в

1,3

качестве контро-

ля - гемолиз 0%

Три пробирки со

1,3 мл воды

100% гемолизом

К содержимому каждой пробирки добавляют по 0,2 мл сенсибилизирован-

ных эритроцитов овцы, хорошо перемешивают и инкубируют при 37⁰С в течение

60 минут. Пробирки охлаждают на ледяной бане и центрифугируют 5 минут при

1000 g. Измеряют оптическую плотность супернатанта при 541 нм и вычисляют

степень гемолиза (Y) по формуле:

Ab -

где :

Аc

оптическая плотность в пробирках 1-12,

Аb

средняя оптическая плотность в пробирках со 100% гемолизом,

А₁

средняя оптическая плотность в контролях с 0% гемолизом.

На миллиметровой бумаге с логарифмическим масштабом по обеим осям

строят график со значениями Y/(1-Y) на оси абсцисс и количеством разведенного

комплемента на оси ординат. Строят наилучшую прямую, соответствующую нане-

сенным точкам и определяют ординату для дозы комплемента, приводящей к 50%

гемолизу, т.е. Y/(1-Y) = 1,0. Вычисляют активность, в гемолитических единицах

(СН₅₀/мл) по формуле:

где :

С_d

обратное значение разведения комплемента,

С_а

объем, в мл, разведенного комплемента, приводящий к 50%

гемолизу,

масштабный множитель для учета количества эритроцитов.

Испытание на антикомплементарную активность

Готовят разведение комплемента, содержащее 100 СН₅₀/мл, путем разбав-

ления титрованного комплемента морских свинок буферным раствором желатина

и барбитала. При необходимости, доводят значение рН испытуемого иммуногло-

булина до 7. Для иммуноглобулина с содержанием 50 мг/мл готовят следующие

смеси для инкубации:

Таблица 2.6.17.-3

Испытуемый об-

Контроль комплемента

разец иммуногло-

(2 образца)

булина

Иммуноглобулин (50 мг/мл)

0,2 мл

Буферный раствор желатина и барби-

0,6 мл

0,8 мл

тала

Комплемент

0,2 мл

Проводят испытание испытуемого образца иммуноглобулина и готовят по-

ложительный и отрицательный контроли АКА с использованием стандартного об-

разца человеческого иммуноглобулина BRP, в соответствии с указаниями на ли-

стке-вкладыше, сопровождающем стандартный препарат. Если концентрация им-

муноглобулина отличается от 50 мг/мл, используют большие либо меньшие объ-

емы образца и буферного раствора желатина и барбитала; например, при концен-

трации иммуноглобулина 30 мг/мл, к 0,33 мл его раствора добавляют 0,47 мл бу-

ферного раствора желатина и барбитала с получением 0,8 мл. Пробирки укупори-

вают и инкубируют при 37⁰С в течение 60 минут. По 0,2 мл каждой из инкубиро-

ванных смесей добавляют к 9,8 мл буферного раствора желатина и барбитала

для разбавления комплемента. Вышеописанную операцию титрования компле-

мента проводят для каждой из пробирок, определяя остаточную активность ком-

племента

(Таблица

2.6.17.-2). Антикомплементарную активность испытуемого

препарата вычисляют относительно контроля комплемента, принимаемого за

100%, по формуле:

-b

× 100,

где :

средняя активность комплемента, в СН₅₀/мл, в контролях

комплемента,

активность комплемента, в СН₅₀/мл, в испытуемом образце.

Результаты испытания считают достоверными, если

антикомплементарные активности, определенные для АКА-

отрицательного и АКА-положительного контролей находятся в пределах, указан-

ных в листке-вкладыше, сопровождающем стандартный образец,

активность комплемента в контроле комплемента (а) находится в преде-

лах от 80 до 120 СН₅₀/мл.

2.6.18. ИСПЫТАНИЕ ЖИВЫХ ВИРУСНЫХ ВАКЦИН НА

НЕЙРОВИРУЛЕНТНОСТЬ

В каждом испытании используют не менее десяти серонегативных по отно-

шению к испытуемому вирусу обезьян. Каждой из обезьян в таламический отдел

каждого полушария вводят не менее 0,5 мл испытуемого материала, если иное не

предписано в частной статье. Общее количество привитого каждой обезьяне ви-

руса не должно быть менее количества, содержащегося в рекомендованной еди-

ничной человеческой дозе вакцины. Для проверки наличия диких нейровирулент-

ных вирусов контрольную группу, состоящую не менее чем из четырех обезьян,

содержат в тех же клетках, что и группу привитых обезьян, или в непосредствен-

ной близости от них. Привитых обезьян наблюдают в течение 17-21 дней, отме-

чая возникновение паралича и других неврологических симптомов; обезьян из

контрольной группы наблюдают в течение того же периода и дополнительно 10

дней. Животные, погибшие в течение первых 48 часов после инъекции, считаются

погибшими по причинам неспецифического характера и могут быть заменены дру-

гими. Результаты испытания признают недостоверными, если: более 20% приви-

тых обезьян погибают по неспецифическим причинам; образцы сыворотки, ото-

бранные у обезьян контрольной группы, в момент прививки испытуемых животных

и через 10 дней после умерщвления последних, имеют признаки инфекции, вы-

званной диким вирусом испытуемого типа или вирусом кори. По окончании перио-

да наблюдения выполняют вскрытие и гистопатологическое изучение соответст-

вующих отделов мозга на предмет наличия воздействия на центральную нервную

систему. Материал выдерживает испытание, если не обнаруживается неожидан-

ных клинических и гистопатологических признаков воздействия на центральную

нервную систему, которые могут быть вызваны введенным вирусом.

2.6.19. ИСПЫТАНИЕ ПЕРОРАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ПОЛИО-

МИЕЛИТА НА НЕЙРОВИРУЛЕНТНОСТЬ

Обезьяны, используемые в испытании на нейровирулентность, должны со-

ответствовать требованиям, приведенным в частной статье «Вакцина полиомие-

лита, пероральная (0215)» и иметь массу тела не менее 1,5 кг. Патогенность для

обезьян семейств Macaca или Cercopithecus испытывается в сравнении с патоген-

ностью стандартного вирусного препарата для испытания на нейровирулентность

путем введения в поясничный отдел центральной нервной системы после седа-

ции с использование подходящего агента, например, гидрохлорида кетамина. Для

образца сыворотки, отобранного до инъекции, должно быть показано отсутствие

нейтрализующих антител в разведении 1:4 при испытании против не более, чем

1000 CCID₅₀ каждого из трех типов полиовируса.

Количество обезьян. Вакцину и подходящий гомотипический вирус срав-

нения испытывают одновременно в одной и той же группе обезьян. Вакцину и

препарат сравнения вводят равному количеству животных. Животных с разли-

чающимися типами введенного препарата размещают случайным образом по

клеткам, а их принадлежность кодируется таким образом, чтобы тип полученной

ими прививки был скрыт от наблюдателей. Количество привитых обезьян должно

быть таково, чтобы при оценке как вакцины, так и препарата сравнения было

включено не менее одиннадцати обезьян, положительных по отношению к вирусу

типов 1 и 2, и не менее восемнадцати обезьян, положительных по отношению к

вирусу типа 3 (положительными считают обезьян, имеющих специфические ней-

ронные повреждения, вызванные полиовирусом в центральной нервной системе).

С одним и тем же гомотипическим стандартом могут испытываться несколько пар-

тий вакцины. По возможности, используют обезьян из одной и той же карантинной

группы. В других случаях используют обезьян из двух групп, причем вакцина и

препарат сравнения прививаются равному количеству обезьян из каждой группы.

Если испытание проводится в течение двух рабочих дней, в каждый из дней вак-

циной и гомотипическим препаратом сравнения прививают равное количество

обезьян.

Содержание вируса. Содержание вируса в вакцине и гомотипическом пре-

парате сравнения регулируют таким образом, чтобы они были насколько возмож-

но близки и находились в пределах от 10^5.5 до 10^6.5 CCID₅₀ в 0,1 миллилитре.

Наблюдение. Всех обезьян наблюдают в течение 17-22 дней, отмечая

признаки полиомиелита или других вирусных инфекций. Обезьян, выживших в те-

чение первых 24 часов, но погибших до 11-го дня после прививки, подвергают

вскрытию для определения того, являлся ли причиной гибели полиомиелит. Жи-

вотные, погибшие по причинам, не связанным с полиомиелитом, не учитываются

при оценке результатов. Умирающих и в тяжелой степени парализованных живот-

ных умерщвляют и вскрывают. Также вскрывают всех животных, выживших в те-

чение периода наблюдения. Результаты испытания считают недостоверными, ес-

ли более, чем у 20% животных в течение периода наблюдения была обнаружена

интеркуррентная инфекция.

Количество срезов, подлежащих испытанию. Гистологическому иссле-

дованию подлежат, как минимум, поясничный и шейный отделы, верхний и ниж-

ний продолговатый мозг, средний мозг, зрительный бугор и двигательная область

коры головного мозга каждой обезьяны. Отбирают препараты толщиной 15 мкм и

окрашивают их галлоцианином. Минимальные количества подлежащих испыта-

нию срезов составляют:

(а)

12 срезов, репрезентативных для поясничного утолщения,

(b)

10 срезов, репрезентативных для шейного утолщения,

(c)

2 среза продолговатого мозга,

(d)

1 срез моста и мозжечка,

(e)

1 срез среднего мозга,

(f)

1 срез с левой и правой части зрительного бугра,

(g)

1 срез с левой и правой части двигательной области коры головного мозга.

Подсчет вирусной активности. Для оценки вирусной активности в полу-

секциях поясничного корда и ствола мозга используют систему подсчета тяжести

повреждений, по которой следующим образом дифференцируют клеточную ин-

фильтрацию и разрушение нейронов:

Наличие лишь клеточной инфильтрации (обезьяна не считается положи-

тельной),

Клеточная инфильтрация с минимальным повреждением нейронов,

Клеточная инфильтрация со значительным повреждением нейронов,

Массовое повреждение нейронов в сочетании или без клеточной инфильт-

рации.

Полученные значения записывают на стандартном бланке (пример подхо-

дящей формы имеется в разделе «Требования к вакцине полиомиелита (перо-

ральной)» в Требованиях к биологическим субстанциям №7 Всемирной организа-

ции здравоохранения). Обезьяна, на срезах тканей которой имеются поврежден-

ные нейроны, но не имеется игольчатых трактов, считается положительной.

Обезьяна, на срезах тканей которой имеются игольчатые тракты, но не имеется

поврежденных нейронов, не считается положительной. Срезы, на которых имеют-

ся повреждения травматического происхождения, но не имеется специфических

вирусных повреждений, при подсчете не учитываются.

Уровни тяжести повреждений основаны на данных, полученных при изуче-

нии полусекций поясничных (L), шейных (C) и мозговых (B) гистологических сре-

зов. Для каждой положительной обезьяны рассчитывают уровень повреждений

(LS) по формуле

ÏÈСуммарное число L˘

ÈСуммарное число С˘

ÈСуммарное число С˘¸

¸3:

ÌÍ

˙˝

Число полусекций

Числополусекций

Число полусекций

ÓÎ

˚˛

Для каждой группы положительных обезьян рассчитывают среднее значе-

ние уровня повреждений.

Оценка. Сравнение вирусной активности в вакцине и в препарате сравне-

ния основано на активности в поясничном расширении корда и степени распро-

странения активности из этого региона в шейное расширение и головной мозг.

Положительное или отрицательное решение основано на общем уровне для всех

животных, подвергнутых испытанию. Необычно высокая активность как в пояснич-

ном отделе, так и в результате распространения из этого региона, обнаруженная у

отдельных животных, также должна приниматься во внимание при вынесении

окончательного решения. Моновалентный материал выдерживает испытание, ес-

ли имеется требуемое количество положительных животных и если ни в одном из

клинических и гистопатологических исследований не выявлено существенных

различий в патогенности между вирусом вакцины и препаратом сравнения. Кри-

терии положительного решения приведены ниже.

Критерии. Для каждой из вакцин сравнения (типов 1, 2 и 3) проводят под-

ходящее количество (например, четыре) квалификационных испытаний на виру-

лентность с целью получения данных об активности этих вакцин как основы кри-

териев для оценки испытуемых вакцин. Для повторных испытаний каждого из

стандартных вирусов вычисляют общий средний уровень повреждений (М), а так-

же суммарную оценку дисперсии (s²) и отклонения (s) результатов испытания.

Критерии достоверности результатов испытания препарата сравнения ус-

танавливаются на основе данных, накопленных в квалификационных испытаниях.

Общепринятых критериев не имеется; для лабораторий с ограниченным опытом

работы может быть полезен следующий эмпирический метод установления до-

пустимых пределов среднего уровня повреждений для препарата сравнения (X_ref):

Таблица 2.6.19.-1

Нижний предел

Верхний предел

Типы 1 и 2

M - s

M + s

Тип 3

M - s/2

M + s

Если средний уровень повреждений испытуемой вакцины равен X_test, а C₁,

C₂ и C₃ - константы, определенные ниже, то:

Вакцина не выдерживает испытание при:

Xtest - Xref > C1

Вакцина может быть однократно подвергнута повторному испытанию при:

C₁< X_test - X_ref< C₂

Если вакцина испытывается повторно, средние значения уровней повреж-

дений для испытуемой вакциной и препаратом сравнения рассчитываются заново.

Вакцина не выдерживает испытание при:

(test1+test 2)

(ref

1+ref

Константы C₁, C₂ и C₃ вычисляют по формулам:

C =

N₁

C =

N₁

C =1,

N₂

где :

N_l

количество положительных обезьян при испытании вакцины,

N₂

количество положительных обезьян в двух испытаниях,

2,3

нормальное отклонение для 1% уровня,

2.6

нормальное отклонение для 0,5% уровня,

1.6

нормальное отклонение для 5% уровня.

Испытание на нейровирулентность, в котором получен средний уровень по-

вреждений препарата сравнения (X_ref), несовместимый с предшествующим опы-

том, не используется для оценки испытуемой вакцины. Если результаты испыта-

ния достоверны, вычисляют средний уровень повреждений для испытуемой вак-

цины (X_test) и сравнивают его с соответствующим значением для гомотипической

стандартной вакцины.

2.6.20. АНТИ-А И АНТИ-В ГЕМАГГЛЮТИНИНЫ (НЕПРЯМОЙ

МЕТОД)

Готовят два серийных разведения испытуемого препарата в растворе на-

трия хлорида R концентрацией 9 г/л. К каждому разведению одного ряда добав-

ляют равный объем суспензии эритроцитов группы А₁ концентрацией 5 объемных

процентов, предварительно трижды промытых раствором натрия хлорида. К каж-

дому разведению другого ряда добавляют равный объем суспензии эритроцитов

группы В концентрацией 5 объемных процентов, предварительно трижды промы-

тых раствором натрия хлорида. Суспензии инкубируют при температуре 37⁰С в

течение 30 минут, затем клетки трижды промывают раствором натрия хлорида.

Клетки оставляют в контакте с поливалентным антиреагентом человеческого им-

муноглобулина в течение 30 минут. Каждую из суспензий, не подвергая центрифу-

гировангию, исследуют под микроскопом на агглютинацию.

2.6.21. МЕТОДЫ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИ-

СЛОТ

1. ВВЕДЕНИЕ

Методы амплификации нуклеиновых кислот основаны на двух различных

подходах:

1. Амплификация последовательности-мишени нуклеиновой кислоты с ис-

пользованием, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР), лигазной цепной

реакции

(ЛЦР) или изотермической амплификации рибонуклеиновой кислоты

(РНК).

2. Амплификация сигнала гибридизации с использованием, например, для

дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) метода разветвленной ДНК (bDNA). В

этом случае амплификация сигнала достигается без подвергания нуклеиновой ки-

слоты повторяющимся циклам амплификации.

В данном общем разделе в качестве стандартного метода описывается ме-

тод ПЦР. Могут применяться и альтернативные методы, если они выдерживают

требования к качеству, перечисленные ниже.

2. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

В данном разделе устанавливаются требования к подготовке образца, к ам-

плификации in vitro последовательностей ДНК и к детектированию специфическо-

го продукта ПЦР. С помощью ПЦР могут быть детектированы определенные по-

следовательности ДНК. Последовательности РНК могут также быть детектирова-

ны путем обратной транскрипции РНК на комплементарную ДНК (cDNA) с после-

дующей амплификацией.

3. ПРИНЦИП МЕТОДА

ПЦР представляет собой процедуру, позволяющую производить в условиях

in vitro амплификацию сегментов ДНК или РНК (после обратной транскрипции на

cDNA).

После денатурации двунитевой ДНК в однонитевую два синтетических оли-

гонуклеотидных праймера противоположной полярности спариваются с их соот-

ветствующими комплементарными последовательностями в подлежащей ампли-

фикации ДНК. Короткие двунитевые участки, формирующиеся в результате спе-

цифического спаривания оснований праймеров и комплементарной ДНК-

последовательности, образуют границы амплифицируемого сегмента ДНК и слу-

жат начальными точками для синтеза ДНК in vitro с участием термостабильной

ДНК-полимеразы.

Процесс амплификация ДНК состоит из циклов, включающих:

- тепловую денатурацию нуклеиновой кислоты (последовательности-мишени) на

две отдельные нити;

- специфический отжиг последовательности-мишени с праймерами в подходящих

реакционных условиях;

- наращивание праймеров, присоединенных к обеим отдельным нитям, под воз-

действием ДНК-полимеразы при подходящей температуре (синтез ДНК).

Повторяющиеся циклы тепловой денатцурации, отжига с праймерами и

синтеза ДНК приводят к экспоненциальной амплификации сегмента ДНК, ограни-

ченного праймерами.

Специфический продукт ПЦР, называемый ампликоном, может быть опре-

делен разнообразными методами соответствующей специфичности и чувстви-

тельности.

4. ИСПЫТУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ

В связи с высокой чувствительностью ПЦР, образцы должны быть опти-

мальным образом защищены от попадания извне последовательностей-мишеней.

Отбор проб, хранение и транспортировку испытуемого материала производят в

условиях, минимизирующих деградацию последовательности-мишени. В случае

проведения испытания на РНК-последовательности, необходимо принять особые

меры предосторожности ввиду высокой чувствительности РНК к деструктивному

воздействию рибонуклеаз. Следует учитывать, что некоторые добавляемые реа-

генты, например, антикоагулянты или консерванты, могут оказывать влияние на

ход определения.

5. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

5.1. Предотвращение загрязнения

В связи с риском загрязнения следует строго разграничивать рабочие зоны

в зависимости от используемых материалов и применяемой технологии. Учиты-

ваемые факторы включают передвижение персонала, использование спецодеж-

ды, перемещение материалов, подачу воздуха и процедуры деконтаминации.

Систему следует разделить на такие отсеки, как:

- зона основной смеси (зона, в которой работы осуществляются только с материа-

лами, не содержащими шаблонных последовательностей, например, праймерами,

буферными растворами и т.д.),

- пре-ПЦР (зона, в которой ведется работа с реагентами, образцами и контроля-

ми),

- ПЦР-амплификация (амплифицируемый материал содержится в закрытой сис-

теме),

- пост-ПЦР детектирование (единственная зона, в которой операции с амплифи-

цируемым материалом производятся в открытой системе).

5.2 Подготовка образцов

При подготовке образцов подлежащая амплификации последовательность-

мишень должна быть эффективным и воспроизводимым образом экстрагирована

или высвобождена из испытуемого материала так, чтобы амплификация в из-

бранных реакционных условиях была осуществима. Могут быть использованы

различные физико-химические процедуры экстракции и/или обогащения.

Добавки, присутствующие в испытуемом материале, могут оказывать влия-

ние на ход ПЦР. Для контроля присутствия ингибиторов в испытуемом материале

следует провести процедуры, описанные в пункте 7.3.2.

В случае РНК-матриц следует уделять внимание предотвращению прояв-

ления рибонуклеазной активности.

5.3 Амплификация

Амплификация последовательности-мишени методом ПЦР проводится в опти-

мизированных циклически изменяющихся условиях (температурный профиль для

денатурации двунитевой ДНК, отжига и наращивания праймеров; периоды инку-

бации при выбранных температурах; скорость наращивания). Эти условия зависят

от различных параметров, например:

длины и состава праймера и последовательности-мишени;

типа ДНК-полимеразы, буферной смеси и реакционного объема, используемых

при амплификации;

типа используемого устройства для термоциклирования и скорости передачи

тепла между аппаратом, реакционным сосудом и реакционной жидкостью.

5.4 Детектирование

Ампликон, образовавшийся в результате ПЦР, может быть идентифицирован

по размеру, последовательности, путем химической модификации или комбина-

цией этих методов. Характеризация по размеру может быть проведена методами

гель-электрофореза (с использованием слоев агарозного или полиакриламидного

гелей или капиллярного электрофореза) или колоночной хроматографии (напри-

мер, ВЭЖХ). Характеризация по составу последовательности может быть прове-

дена путем специфической гибридизации зондов, содержащих последователь-

ность, комплементарную мишени, или расщеплением амплифицированного мате-

риала, отражающим наличие мишень-специфических сайтов ферментативной ре-

стрикции. Характеризация по химической модификации может быть проведена,

например, введением в ампликоны флуорофора с дальнейшей детекцией флуо-

ресценции, возникающей в результате возбуждения.

6. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результат испытания является достоверным лишь при условии получе-

ния однозначно положительных результатов для положительного контроля

(контролей) и однозначно отрицательных результатов для отрицательного

контроля (контролей). В связи с исключительно высокой чувствительностью

метода ПЦР и с риском попадания загрязняющих примесей, положительные ре-

зультаты должны подтверждаться двукратным полным повторением проце-

дуры испытания, по возможности, с новой аликвотой образца. Считают, что

образец дает положительную реакцию, если не менее одного из повторных ис-

пытаний дает положительный результат.

7. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА

7.1 Валидация системы для количественного определения методом

ПЦР.

Программа валидации должна включать валидацию оборудования и ис-

пользуемого метода ПЦР. Следует учитывать положения, изложенные в руково-

дстве ICH (тема Q2B) «Валидация аналитического метода: методология».

Для валидации ПЦР-испытания обязательным является применение

официальных рабочих стандартных образцов или стандартных препаратов

внутреннего применения, калиброванных относительно Международных Стан-

дартов, для последовательностей-мишеней, для определения которых систе-

ма будет использоваться.

При валидации должно быть определено положительное граничное значе-

ние. Положительное граничное значение определяется как минимальное количе-

ство последовательностей-мишеней в объеме образца, которые могут быть опре-

делены в 95% испытаний. Положительное граничное значение зависит от таких

взаимосвязанных факторов, как объем экстрагированного образца и эффектив-

ность методологии экстракции, транскрипция РНК-мишени в cDNA, процесс ам-

плификации и детекции.

При определении предела детекции системы следует учитывать положи-

тельные граничные значения для каждой последовательности-мишени и резуль-

таты проведения испытания выше и ниже этих значений.

7.2. Контроль качества реагентов.

Все реагенты, имеющие критическое значение для используемой методоло-

гии, должны проходить контроль перед использованием в рутинных испытаниях.

Их пригодность или непригодность основывается на заранее определенных кри-

териях качества.

Праймеры являются важнейшими компонентами ПЦР-анализа, и поэтому

следует уделять особое внимание их строению, чистоте и валидации для ПЦР-

анализов. Каждая новая партия праймеров перед введением в испытание должна

быть испытана на специфичность, эффективность амплификации и отсутствие ин-

гибирующих примесей. Праймеры могут быть подвергнуты модификации (напри-

мер, связыванием с флуорофором или антигеном) для проведения детекции ам-

пликона специфическими методами при условии, что такие модификации не при-

ведут к ингибированию правильного и эффективного протекания процесса ам-

плификации последовательности-мишени.

7.3. Контроль хода испытания.

7.3.1. Внешние контроли.

Для минимизации риска загрязнения и обеспечения адекватной чувствитель-

ности в состав каждого ПЦР-испытания вводят следующие внешние контроли:

положительный контроль: в нем содержится определенное количество копий

последовательности-мишени; количество копий определяется индивидуально

для каждой системы и кратно положительному граничному значению данной

системы;

отрицательный контроль: образец аналогичного основного состава, для кото-

рого доказано отсутствие последовательностей-мишеней.

7.3.2. Внутренний контроль.

Внутренние контроли представляют собой определенные последовательности

нуклеиновых кислот, содержащие сайты связывания с праймерами. Внутренние

контроли должны амплифицироваться так же эффективно, как и испытуемая по-

следовательность-мишень, но ампликоны должны иметь четкие отличия. Тип нук-

леиновой кислоты (ДНК/РНК), используемой в качестве внутреннего контроля,

должен быть тем же, что и в испытуемом материале. Внутренний контроль пред-

почтительно добавлять к испытуемому материалу до выделения нуклеиновой ки-

слоты; при этом он может использоваться для общего контроля процесса (экс-

тракция, обратная транскрипция, амплификация, детекция).

7.4. Внешняя оценка качества

Участие во внешних программах оценки качества представляет собой важную

процедуру обеспечения качества ПЦР-анализов для каждой лаборатории и каждо-

го оператора.

Следующий раздел приводится для информации.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ (МАНК) В

ОПРЕДЕЛЕНИИ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С (HCV) В ПУЛАХ ПЛАЗМЫ: РУКОВО-

ДСТВО

1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Большинство аналитических методик, основанных на амплификации нук-

леиновых кислот, представляют собой качественные испытания на наличие нук-

леиновых кислот. Существует также некоторое количество методик количествен-

ного определения (либо внутренних, либо коммерчески доступных). Для опреде-

ления загрязнения пулов плазмы РНК HCV адекватными являются качественные

тесты, которые могут быть рекомендованы как предельные испытания при кон-

троле содержания примесей, в соответствии с указаниями в Техническом руково-

дстве по разработке монографий «Pharmeuropa», декабрь 1999, глава III «Вали-

дация аналитических методик». В этом руководстве описаны лишь методы вали-

дации качественных аналитических методик оценки загрязнения пулов плазмы

РНК HCV на основе амплификации нуклеиновых кислот. Поэтому двумя наиболее

важными характеристиками для валидации аналитического метода являются его

специфичность и предел детекции. Кроме того, должна быть оценена устойчи-

вость аналитического метода.

Однако этот документ также может быть использован в качестве ос-

новы для валидации амплификации нуклеиновых кислот в общем.

Для целей данного документа, за аналитическую процедуру принимают всю

процедуру от экстракции нуклеиновой кислоты до детекции амплифицированного

продукта.

При использовании в аналитическом методе или его части коммерческого

набора, валидацию пользователя может заменить документированное подтвер-

ждение валидации вышеуказанных положений, произведенной изготовителем на-

бора. Тем не менее, пользователем должна быть продемонстрирована произво-

дительность набора в отношении его предполагаемого использования (т.е. пре-

дел детекции, устойчивость, перекрестная контаминация).

2. СПЕЦИФИЧНОСТЬ

Специфичность представляет собой способность к однозначной оценке

присутствия нуклеиновой кислоты в смеси с компонентами, присутствие которых

можно ожидать.

Специфичность аналитических методов, основанных на амплификации нук-

леиновых кислот, зависит от выбора праймеров, выбора зонда (для анализа ко-

нечного продукта) и обоснованности условий проведения испытания (как для ста-

дии амплификации, так и для стадии детекции).

При разработке праймеров и зондов должна быть исследована их специ-

фичность в отношении детектирования только РНК HCV путем сравнения избран-

ной последовательности с последовательностями, опубликованными в банках

данных. В случае HCV праймеры (и зонды) обычно выбирают из областей 5’-

некодируемого участка генома HCV, которые хорошо сохраняются для всех гено-

типов.

Амплифицированный продукт должен однозначно идентифицироваться од-

ним из многих методов, например, проведением амплификации с вложенными

праймерами, анализ с использованием ферментов рестрикции, секвенирование

или гибридизация со специфическим зондом.

Для валидации специфичности аналитического метода испытание должно

быть проведено в отношении не менее 100 РНК HCV-отрицательных пулов плаз-

мы, для которых должно быть показано отсутствие реакции. Подходящие образцы

пулов, не дающих реакции, могут быть получены в Европейском директорате по

качеству медицинских препаратов.

Способность аналитического метода к детекции всех генотипов HCV также

зависит от выбора праймеров, зондов и параметров метода. Эта способность

должна быть продемонстрирована с использованием характеризованных эталон-

ных панелей. Однако, ввиду сложности получения некоторых генотипов (напри-

мер, генотипа 6), должны быть на подходящем уровне детектированы генотипы

преобладающих типов (например, в Европе - генотипы 1 и 3).

3. ПРЕДЕЛ ДЕТЕКЦИИ

За предел детекции данной аналитической процедуры принимают наи-

меньшее количество нуклеиновой кислоты в образце, которое может быть детек-

тировано, но не обязательно определено как точное значение. Аналитический ме-

тод с использованием амплификации нуклеиновых кислот, используемый для де-

текции РНК HCV в пулах плазмы, обычно дает качественные результаты. Количе-

ство возможных результатов ограничено двумя: либо положительным, либо отри-

цательным. Хотя рекомендуется определение предела детекции, в практических

целях для аналитического метода на основе амплификации нуклеиновых кислот

должно быть определено положительное граничное значение. Положительное

граничное значение (в соответствии с определением в общем разделе 2.6.21)

представляет собой минимальное количество последовательностей-мишеней в

объеме образца, которые могут быть определены в 95% испытаний. На это поло-

жительное граничное значение оказывают влияние распределение вирусных ге-

номов в индивидуальных испытуемых образцах и такие факторы, как эффектив-

ность фермента. Это может привести к получению различных 95% граничных зна-

чений для отдельных испытаний.

Для определения положительного граничного значения ряд разведений ра-

бочего реагента или стандартного образца вируса гепатита С BRP, калиброван-

ного в сравнении с Международным Стандартом HCV ВОЗ 96/790, должен быть

подвергнут испытанию в разные дни для проверки изменчивости результатов

анализа. Для проведения статистического анализа результатов должно быть ис-

пытано не менее трех независимых рядов разведений в количестве повторностей

для каждого из разведений, достаточном для получения всего 24 результатов ис-

пытания для каждого разведения.

Например, в лаборатории в разные дни могут быть проведены испытания

трех рядов разведений в восьми повторностях для каждого из них, четырех рядов

разведений в шести повторностях для каждого из них или шести рядов разведе-

ний в четырех повторностях для каждого из них. Для того, чтобы число разведе-

ний не было слишком большим, следует провести предварительное испытание

(например, с использованием логарифмических разведений образца пула плаз-

мы) с получением предварительного положительного граничного значения (т.е.

наибольшего значения, дающего положительный результат). После этого диапа-

зон разведений может быть выбран в области полученного предварительного

значения (с использованием, например, логарифмического фактора разведения

0,5 или менее и отрицательного пула плазмы для матрицы разведения). Концен-

трация РНК HCV, которая может быть детектирована в 95% испытаний, может

быть вычислена с использованием соответствующих методов статистической

оценки.

Эти результаты также могут служить для демонстрации изменчивости ре-

зультатов, получаемых данным аналитическим методом, в ходе испытания и в

разные дни.

4. УСТОЙЧИВОСТЬ

Устойчивость аналитического метода - мера его способности выдерживать

воздействие малых, но определенных изменений параметров метода, являющая-

ся показателем его надежности при обычном использовании.

Оценка надежности должна проводиться в фазе разработки. Она должна

показать надежность аналитической процедуры с учетом определенных вариаций

параметров метода. Для случая МАНК, небольшие изменения параметров метода

могут иметь решающее значение. Однако, в ходе разработки метода его устойчи-

вость может быть продемонстрирована небольшим изменением концентраций

реагентов (например, MgCl₂, праймеров или dNTP). Для демонстрации устойчиво-

сти не менее 20 РНК HCV-отрицательных пулов плазмы, отобранных случайным

образом и инфицированных РНК HCV с получением конечной концентрации, в три

раза превышающей заранее определенное 95% граничное значение, должны

быть испытаны и признаны положительными.

Проблемы с устойчивостью могут возникнуть также в связи с методами, в

которых экстракции вирусной РНК предшествует стадия ультрацентрифугирова-

ния. Поэтому для испытания устойчивости таких методов не менее 20 пулов

плазмы, содержащих различные уровни РНК HCV, но не содержащих специфиче-

ских антител к HCV, должны быть испытаны и признаны положительными.

Предотвращение перекрестной контаминации должно быть продемонстри-

ровано путем точной детекции панели из не менее 20 образцов, попеременно за-

полненной образцами отрицательных пулов плазмы и отрицательных пулов плаз-

мы, инфицированных высокими концентрациями HCV (не менее 100-кратного 95%

граничного значения или не менее 10⁴ МЕ/мл).

5. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА

Для таких биологических испытаний, как МАНК, имеется вероятность воз-

никновения специфических проблем, которые могут повлиять как на валидацию,

так и на интерпретацию результатов. Методики испытаний должны быть четко

описаны в форме стандартных операционных процедур (СОП). В них должно ука-

зываться:

- способ отбора проб (тип контейнеров и т. д.),

- приготовление мини-пулов (по потребности),

- условия хранения до анализа,

- точное описание условий испытания, включая меры предосторожности против

перекрестной контаминации и деструкции вирусной РНК, используемых реагентов

и стандартных препаратов,

- точное описание используемой аппаратуры,

- детальные формулы для вычисления результатов, включая статистическую об-

работку.

В качестве удовлетворительной проверки соответствия системы и надеж-

ности аналитической процедуры, когда бы она ни использовалась, может быть ре-

комендован подходящий контроль процесса (например, подходящее разведение

стандартного образца вируса гепатита С BRР или образец плазмы, инфициро-

ванной HCV, калиброванным в сравнении с Международным Стандартном HCV

ВОЗ 96/790).

Техническая квалификация: каждой критической части используемого обо-

рудования должна соответствовать программа квалификации по установке и экс-

плуатации. После замены критически важного оборудования (например, устройств

для термоциркуляции) должна быть документально подтверждена производи-

тельность путем проведения параллельного испытания в отношении 8 повторных

образцов пула плазмы, инфицированного РНК HCV с получением конечной кон-

центрации, соответствующей предварительно определенному трехкратному 95%

граничному значению. Все результаты должны быть положительными.

Квалификация оператора: в отношении каждого оператора, принимающего

участие в испытании, должна действовать соответствующая квалификационная

программа. Для подтверждения соответствующего уровня подготовки каждый

оператор должен провести испытание не менее 8 повторяющихся образцов пула

плазмы, инфицированного РНК HCV с получением конечной концентрации, соот-

ветствующей предварительно определенному трехкратному 95% граничному зна-

чению. Это испытание (8 повторяющихся образцов) должно быть повторено два-

жды, в два различных дня. Таким образом, должно быть проведено 24 испытания

на протяжении трех дней. Все результаты должны быть положительными.

2.6.22. АКТИВИРОВАННЫЕ ФАКТОРЫ СВЕРТЫВАНИЯ

КРОВИ

При необходимости определяют количество присутствующего гепарина

(2.7.12) и нейтрализуют его добавлением протамина сульфата R (10 мкг прота-

мина сульфата нейтрализуют 1 МЕ гепарина). Готовят разбавления испытуемого

препарата в соотношениях 1:10 и 1:100 с использованием трис-(гидроксиметил)-

аминометанового буферного раствора рН 7,5 R. Ряд пробирок из полистирола

помещают в водяную баню с температурой 37⁰С и добавляют к каждой из проби-

рок по 0,1 мл плазмы с пониженным содержанием тромбоцитов R и по 0,1 мл

подходящего разведения цефалина R или заменителя тромбоцитов R. Выдер-

2.7 Биологические методы количественного определения

2.7.1. ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Иммунохимические методы основаны на селективном, обратимом

нековалентном связывании антигенов антителами. Эти методы используются для

обнаружения и количественного определения как антигенов, так и антител. Факт

образования комплекса антигена с антителом и количество этого комплекса могут

быть определены различными путями. Положения данного общего метода относятся

к иммунохимическим методам с использованием меченых или немеченых реагентов.

Результаты, получаемые иммунохимическими методами, зависят от

реакционных условий, а также природы и качества используемых реагентов. Важно

стандартизировать компоненты, используемые в ходе иммуноанализа и, по

возможности, использовать для количественных определений международные

стандартные препараты.

Реагенты, необходимые для многих иммунохимических методов, содержатся в

составе коммерчески доступных наборов, т.е. наборов, включающих реагенты

(антигены или антитела) и материалы, предназначенные для оценки in vitro

указанной субстанции, а также инструкции по их надлежащему применению. Наборы

используются в соответствии с инструкциями производителя; важно убедиться в

том, что наборы являются подходящими для анализа испытуемой субстанции с

особым учетом их селективности и чувствительности.

МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ИЛИ АНТИТЕЛА

В методах с использованием меченых веществ могут применяться

подходящие метки, например, ферменты, флуорофоры, люминофоры и

радиоизотопы. Если меткой является радиоизотоп, метод называют

«радиоиммунологическим

анализом».

Рекомендации

по

измерению

радиоактивности, приведенные в статье

«Радиофармацевтические препараты

(0125)», подходят также и для иммунологических анализов с использованием

радиоизотопов. Работа с радиоактивными материалами должна выполняться в

соответствии с национальным законодательством и международными документами

по защите от радиационной опасности.

МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕМЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ИЛИ АНТИТЕЛА

Методы иммунопреципитации

Методы иммунопреципитации включают процессы флокуляции и осаждения.

При смешивании растворов антигена с соответствующим антителом в подходящих

условиях реактанты образуют флокулирующие или преципитационные агрегаты.

Отношение реактантов, при котором достигается минимальное время флокуляции

или наиболее заметное осаждение, называют оптимальным отношением. Такое

отношение обычно составляют эквивалентные количества антигенов и антител.

Иммунопреципитация может оцениваться визуально или по светорассеянию

(нефелометрическое и турбидиметрическое определение).

Увеличение

чувствительности может быть достигнуто использованием в качестве реактантов

частиц (например, из латекса), покрытых антигенами или антителами.

В методах флокуляции обычно используют ступенчатые разбавления одного

из реактантов, в то время, как в иммунодиффузионных (ИД) методах разбавление

достигается путем диффузии в гелеобразную среду: достигаются концентрационные

градиенты одного из реактантов или обоих. Таким образом, в геле образуются зоны,

в которых отношение реактантов способствует преципитации. В то время как

флокуляционные методы выполняются в пробирках, в иммунодиффузионных

методах используются различные носители: пробирки, пластины, стекла, ячейки или

камеры.

Если система иммунопреципитации состоит из одного антигена в комбинации

с соответствующим антителом, система определяется как простая; если в ней

участвуют родственные, но серологически неидентичные реактанты, система

является сложной, а если в ней участвуют несколько серологически не связанных

друг с другом реактантов, ее называют комплексной.

В методах простой диффузии концентрационный градиент устанавливается

только для одного из реактантов, диффундирующего из внешнего источника в

гелевую среду, содержащую соответствующий реактант в относительно низкой

концентрации.

Простая радиальная иммунодиффузия (ПРИД) представляет собой простой

количественный иммуодиффузионный метод. При достижении равновесия между

внешним и внутренним реактантами круговая область преципитации, начинающаяся

от места локализации внешнего реактанта, прямо пропорциональна количеству

нанесенного антигена и обратно пропорциональна концентрации антитела в геле.

В двойных диффузионных методах концентрационные градиенты

устанавливаются для обоих реактантов. И антиген, и антитело диффундируют из

различных участков в гель, который первоначально был иммунологически

нейтральным.

Сравнительные методы двойной диффузии используются для

количественного сравнения различных антигенов против подходящих антител или

наоборот. Сравнение основано на наличии или отсутствии взаимодействия между

образцами преципитации. Могут быть выделены реакции идентичности,

неидентичности и частичной идентичности антигенов или антител.

Иммуноэлектрофоретические методы

Иммуноэлектрофорез

(ИЭ)

- качественный метод, сочетающий две

процедуры: гель-электрофорез с последующей иммунодиффузией.

Перекрестный иммуноэлектрофорез представляет собой модификацию

метода ИЭ и является подходящим как для качественного, так и для

количественного анализа. Первая часть процедуры представляет собой обычный

гель-электрофорез. По ее окончании протяженную полосу геля, содержащую

разделенные фракции, подлежащие определению, вырезают и переносят на другую

пластину. Электрофорез во втором направлении проводят перпендикулярно

предыдущему электрофоретическому процессу в геле, содержащем относительно

небольшую концентрацию антитела, соответствующего используемому антигену.

Зависимость площади соответствующих пиков преципитации от количества

соответствующего антигена является линейной для данной концентрации антитела и

толщины геля.

Электроиммунный

анализ,

часто

называемый

ракетным

иммуноэлектрофорезом представляет собой быстрый метод количественного

определения антигенов с зарядом, отличным от заряда антител, и наоборот.

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год) - часть 19