ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год)

Выполняют электрофорез антигена, подлежащего определению, в геле,

содержащем относительно низкую концентрацию соответствующих антител.

Испытуемый материал и разведения стандартного антигена, используемые для

калибровки, вносят в разные лунки в геле. В процессе электрофореза появляются

мигрирующие пикообразные зоны преципитации, начинающиеся от лунок. Фронт

преципитации становится неподвижным, когда количество антигена перестает быть

избыточным. Зависимость расстояния, пройденного фронтом преципитации, от

количества нанесенного антигена является линейной для данной концентрации

антител.

Обратный иммуноэлектрофорез представляет собой быстрый метод

количественного определения, позволяющий устанавливать концентрационные

градиенты внешних антител и антигенов в электрическом поле в зависимости от

разницы зарядов. Разведения стандарта для калибровки и разведения испытуемого

материала вносят в ряд лунок в геле, а в противоположный ряд лунок вносят

фиксированное количество соответствующего реактанта. Титр испытуемого

материала может быть определен как максимальное разведение, для которого

наблюдается линия преципитации.

Существует ряд модификаций методов перекрестного иммуноэлектрофореза

и электроиммунного анализа.

В других методах сочетается разделение антигенов по размеру молекул и

серологическим свойствам.

Визуализация и характеризация линий иммунопреципитации.

Эти операции могут быть выполнены с использованием селективных или

неселективных красителей, по флуоресценции, введением ферментных или

изотопных меток или другими подходящими методами. Для характеризации в

преципитатах веществ небелковой природы обычно используют методы

селективного окрашивания.

В полупрозрачных гелях, например, на основе агара или агарозы, линии

осаждения четко различимы визуально при условии наличия достаточной

концентрации каждого из реактантов.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА

Критерии валидации

Количественный иммунохимический метод является достоверным при

выполнении следующих условий:

1. Антитела и антигены не имеют существенных отличий в стандартном и

испытуемом образце. В случае меченых реактантов, различия меченого и

немеченого компонента соответствующего реактанта должны быть

незначительными.

2. На результат не должна оказывать влияния матрица, т.е. любой компонент

испытуемого образца или используемые вспомогательные вещества, которые

могут отличаться в разных образцах. В образцах могут содержаться высокие

концентрации посторонних белков, солей, консервантов или веществ,

обладающих протеолитической активностью.

3. Предел количественного определения должен быть ниже критерия,

установленного в частной статье.

4. Точность определения должна быть достаточной для выполнения требований,

предъявляемых в частных статьях.

5. Порядок, в котором проводится определение, не приводит к увеличению

системных ошибок.

Методы валидации

Для проверки выполнения этих критериев разрабатывается процесс валидации,

включающий следующие элементы:

1. Испытание выполняют не менее чем в трех повторностях.

2. Испытание проводят не менее чем для трех различных разведений препарата

сравнения и трех разведений испытуемых препаратов, предполагаемая

активность которых равна активности стандартного образца.

3. Используют рандомизированную схему количественного определения.

4. Если испытуемый препарат находится в сыворотке или в смеси с иными

компонентами, стандарт должен быть приготовлен аналогичным образом.

5. Испытание должно включать измерение неспецифического связывания меченого

реактанта.

6. В случае заместительного иммунного анализа:

a) определяют максимальное связывание (нулевое замещение),

б) разведения должны охватывать весь диапазон откликов от значений, близких к

неспецифическому связыванию, до максимального связывания, предпочтительно,

как для стандартного, так и для испытуемого препарата.

СТАТИСТИЧЕСКИЕ ВЫЧИСЛЕНИЯ

Кривые откликов, полученные для испытуемого и стандартного препаратов,

могут быть проанализированы с использованием методов, описанных в разделе 5.3.

Статистический анализ результатов биологических испытаний и

количественных определений.

Существенная степень непараллельности указывает на то, что между

антителом и антигеном в испытуемом и стандартном образцах имеются различия, и

результаты испытания являются недостоверными.

В заместительных иммунологических количественных определениях не

должно быть существенных различий между значениями неспецифического

связывания и максимального замещения при высокой концентрации испытуемого

образца и стандарта. Различия могут указывать на наличие эффектов, связанных с

матрицей: ингибированием связывания либо разложением метки.

2.7.2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Активность антибиотика определяют путем сравнения степени угнетения

роста чувствительных микроорганизмов под действием испытуемого антибиотика и

стандартного образца в известных концентрациях.

Стандартные образцы, используемые для количественного определения,

представляют собой субстанции, активность которых точно установлена по

отношению к международному стандарту.

# Для количественного определения используют ФСО.

Определение должно выполняться способом, позволяющим производить

проверку достоверности математической модели, на которой основан расчет

активности. Если выбрана модель параллельных линий, линии логарифмической

зависимости активности от дозы для испытуемого препарата и стандартного образца

должны быть параллельны; они должны быть линейны в области доз,

использовавшихся при вычислении. Эти условия должны быть проверены тестами

соответствия для определенной вероятности, обычно Р = 0,05.

# Вычисления целесообразно проводить по схеме латинских квадратов (если

при проведении анализа методом диффузии в агар были использованы

прямоугольные кюветы) или по схеме рандомизированных блоков

(если при

проведении анализа методом диффузии в агар были использованы чашки Петри или

анализ проводился турбидиметрическим методом).

Могут быть использованы и другие математические модели, например,

модель отношения уклонов прямых, при условии доказательства их достоверности.

Если в частной статье не указано иное, доверительные интервалы ошибки

количественного определения активности (Р = 0,95) должны составлять от 95% до

105% от оцениваемой активности.

Определение выполняют методом А или методом В, если иное не указано в

частной статье.

А. МЕТОД ДИФФУЗИИ

Питательную среду определенного состава расплавляют, засевают

суспензией микроорганизмов, чувствительных к испытуемому антибиотику, при

подходящей температуре, например, 48-50°С для вегетативных форм и 65-70°С при

использовании суспензии спор. Количество суспензии микроорганизмов выбирают

таким образом, чтобы образовывались четко определенные зоны ингибирования

требуемого диаметра при концентрациях антибиотика, используемых в

определении. Инокулированная среда разливается по чашкам Петри или по

прямоугольным кюветам на строго горизонтальной поверхности в количестве,

достаточном для формирования однородного слоя толщиной от 2 до 5 мм. Среда

может также состоять из двух слоев, из которых только верхний подвергался

инокуляции. Чашки хранят таким образом, чтобы не происходило заметного роста

или гибели микроорганизмов до использования, а поверхность среды была сухой к

моменту использования.

Используя растворитель и буферный раствор, указанный в Таблице 2.7.2.-1,

готовят растворы стандартного образца и испытуемого антибиотика, имеющие

известные концентрации и предположительно равные активности. Растворы наносят

на поверхность среды, например, в стерильных цилиндрах из фарфора,

нержавеющей стали или другого подходящего материала, или в лунках, сделанных в

агаре. В каждый цилиндр или лунку должны быть помещены равные объемы

раствора. Кроме того, можно использовать стерильные диски абсорбирующей

бумаги подходящего качества; диски пропитывают растворами стандартного

образца и растворами испытуемого антибиотика и помещают на поверхность агара.

Для оценки достоверности количественного определения используют не

менее трех доз стандартного образца и трех доз испытуемого антибиотика,

имеющих равные предполагаемые активности. Предпочтительно использовать ряды

доз, меняющихся в геометрической прогрессии.

# Например, в соотношении 1:2:4.

В рутинных анализах, когда линейность системы продемонстрирована в

адекватном количестве экспериментов с определением по трем значениям, по

согласованию с компетентными органами может считаться достаточным

определение по двум значениям. Однако во всех спорных случаях должно

применяться вышеописанное определение по трем значениям.

Растворы в каждой чашке Петри или прямоугольной кювете располагают

статистически предпочтительным образом, кроме чашек Петри малого размера, на

которых невозможно разместить больше шести растворов; растворы испытуемого

антибиотика

(U) и стандартного образца

(S) чередуют таким образом, чтобы

исключить взаимное влияние более концентрированных растворов.

# Последовательность внесения стандартного и испытуемого образцов в

цилиндры или лунки каждой чашки рекомендуется следующей: первыми вносятся

растворы стандартного и испытуемого образца с малой концентрацией (S₁, U₁),

затем со средней концентрацией (S₂, U₂), последними вносят растворы с большими

концентрациями (S₃, U₃).

# Все растворы стандартного испытуемого образцов вносят в цилиндры или

лунки одной чашки Петри таким образом, чтобы растворы с большими

концентрациями не соприкасались между собой. Предлагаемый вариант

закапывания S₁ U₃ S₂ U₁ S₃ U₂.

Чашки инкубируют при подходящей температуре около 18 часов. Чашки могут

выдерживаться до инкубации при комнатной температуре или, если необходимо, при

4 С⁰ в течение определенного промежутка времени, обычно от 1 до 4 часов для

протекания диффузии, что уменьшает эффекты вариаций временных интервалов

между нанесением растворов и улучшает качество кривой регрессии.

Измеряют диаметры (с точностью не ниже 0,1 мм) или площади кольцевых зон

ингибирования

(с соответствующей точностью) и вычисляют активность с

использованием подходящих статистических методов.

В каждом определении используют достаточное для получения требуемой

точности количество повторов. Может быть проведено несколько определений,

результаты которых статистически обработаны для получения требуемой точности и

для подтверждения того, что активность испытуемого антибиотика не ниже

минимальных требований.

Таблица 2.7.2.-1.

Количественное определение методом диффузии.

Растворитель,

Среда и

Температур

Стандартный

используемый для

Буферный раствор

Микрооргани

конечное

Антибиотик

образец

приготовления

(рН)

зм

значение рН

инкубации,

основного раствора

(±0,1 ед. рН)

⁰C

Bac.subtilis

35-37,

Азитромици-

Буфер №6,

АТСС 6633,

№ 9

#Азитромицин

на ФСО

рН 6,0

Bac.subtilis,

pH 7,8-8,0

30-37

var. Л2

1 мл этилового спирта

Bac.cereus

на 10 мг навески,

Буфер № 4,

№ 9

var.mуcoides

35-37

затем буфер № 4 до

pH 7,8-8,0

НВ

1000 ЕД/мл

Ампициллина

№ 11,

Буфер № 1,

Staphylococcus

#Ампициллин

тригидрата

№ 7+0,1%

35-39

pH 6,8-7,0

aureus 209 P

ФСО

глюкозы,

pH 6,8-7,0

Буфер № 1 рН 6,8-7,0

№ 16+0,1%

#Амфотерицин

Амфотери-

(Срок годности р-ров

Candida utilis

Диметилсульфоксид

глюкозы,

29-31

цина В ФСО

при комнатной т-ре не

ЛИА - 01

pH 5,8-6,0

более 30 мин)

Micrococcus

Бацитраци-

0,01 М

luteus

Бацитрацина

на цинковой

хлористоводородная

7,0 (0,05 М)

NCTC 7743

A; 7.0

35-39

цинковая соль

соли ФСО

кислота

CIP 53.160

ATCC 10240

Бензилпени-

№ 11,

#Бензилпеници

циллина

Буфер № 1,

Staphylococcus

№ 7+0,1%

35-37

ллин

натриевой

pH 6,8-7,0

aureus 209 P

глюкозы,

соли ФСО

pH 6,8-7,0

Блеомицина

Mycobacterium

Блеомицина

Дистиллированная

сульфата

6,8 (0,1 М)

smegmatis

G; 7.0

35-37

сульфат

вода

ФСО

ATCC 607

Bacillus subtilis

Ванкомицина

Дистиллированная

NCTC 8236

гидрохлорида

8,0

A; 8.0

37-39

гидрохлорид

вода

ATCC 6633

ФСО

CIP 52.62

Bac.cereus

Грамицидина

Дистиллированная

№ 13,

#Грамицидин С

Этиловый спирт 95%

var.mуcoides

35-37

С ФСО

вода

pH 7,0-7,2

537

Bacillus pumilus

NCTC 8241

CIP 76.18

A; 7.9

35-39

Гентамици-

Гентамицина

Дистиллированная

Staphylococcus

на сульфата

8,0 (0,05 М)

сульфат

вода

epidermidis

ФСО

NCIMB 8853

A; 7.9

35-39

CIP 68.21

ATCC 12228

Гентамици-

Буфер № 4,

Bac. рumilus

№ 9,

#Гентамицин

на сульфата

35-37

pH 7,8-8,0

NCTC 8241

pH 7,8-8,0

ФСО

0,1 М раствор едкого

Гелиомицина

натра (1 мг основного

0,1 М раствор едкого

Bac.subtilis

№ 17,

#Гелиомицин

35-37

ФСО

в-ва в 5 мл раствора

натра

АТСС 6633

pH 7,8-8,0

натра едкого)

Bacillus subtilis

Дигидро-

NCTC 8236

A; 7.9

30-37

Дигидро-

стрептоми-

CIP 1.83

Дистиллированная

стрептомицина

цина

8,0 (0,05 М)

Bacillus subtilis

вода

сульфат

сульфата

NCTC 10400

A; 7.9

30-37

ФСО

CIP 52.62

ATCC 6633

Дигидро-

стрептоми-

Bac.cereus

#Дигидро-

Буфер № 3

Буфер № 4,

№ 9

цина

var.mуcoides

35-37

стрептомицин

pH 6,0-6,2

pH 7.8-8,0

pH 7,8-8,0

сульфата

537

ФСО

Bac.cereus

Дактино-

Дистиллированная

Буфер № 4,

№ 14

#Дактиномицин

var.mуcoides

35-37

мицина ФСО

вода

pH 7,8-8,0

НВ

Диклокса-

№ 11,

#Диклокса-

циллина

Буфер№ 1,

Буфер № 1, pH 6,8-

Staphуlococcus

№ 7+0,1%

35-37

циллин

натриевой

pH 6,8-7,0

7,0

aureus 209 P

глюкозы

соли ФСО

pH 6,8-7,0

Доксициклина

0,01 М раствор

№ 6+1%

Буфер № 2

Bac.subtilis,

#Доксициклин

гидрохлорида

хлористоводородной

глюкозы pH

35-37

pH 5,8-6,0

var. Л2

ФСО

кислоты

6,8-7,0

Колистина

Bordetella

B; 7.3

35-39

сульфата

bronchiseptica

Колистина

ФСО

NCTC 8344

сульфат

Дистиллированная

Колистин-

6,0 (0,05 М)

CIP 53.157

Колистиметата

вода

метансуль-

ATCC 4617

натриевая соль

фоната

Escherichia coli

B; 7.3

35-39

натрия ФСО

NCIMB 8879

CIP 54.127

ATCC 10536

Канамицина

№ 12 pH 7,8-

Дистиллированная

Буфер № 4,

Bac.subtilis

#Канамицин В

моносульфа-

8,0, № 8 pH

35-37

вода

pH 7,8-8,0

АТСС 6633

та ФСО

7,8-8,0

Карбени-

Буфер № 2

Pseudomonas

#Карбени-

циллина

Буфер № 1

№ 7 pH 6,8-

pH 5,8-6,0

aeruginosa

35-37

циллин

динатриевой

pH 6,8-7,0

7,0

NCTC 2134

соли ФСО

Кармино-

Bac.cereus

#Кармино-

мицина

Дистиллированная

№ 5 pH 7,8-

Буфер № 4, pH 7,8

var.mуcoides

35-37

мицин

гидрохлорида

вода

8,0

537

ФСО

Bacillus subtilis

NCTC 10400

Канамицина

CIP 52.62

A; 7.9

30-37

моносульфат

Канамицина

ATCC 6633

Дистиллированная

Канамицина

моносульфа-

8,0 (0,05 М)

Staphylococc

вода

кислый

та ФСО

us aureus

сульфат

NCTC 7447

A; 7.9

35-39

CIP 53.156

ATCC 6538 P

Диметилсульфоксид

до концентрации 100

мкг/мл,а затем в

буфере № 1 рН 6,8-7,0

№16+1%

Леворина

Candida utilis

#Леворин

Диметилсульфоксид

(Срок годности

Глюкозы

29-31

ФСО

ЛИА - 01

растворов при

pH 5,8-6,0

комнатной

температуре не более

30 мин)

Линкомицина

Дистиллированная

Буфер № 4,

Bac.subtilis

№ 8 pH 7,8-

#Линкомицин

гидрохлорида

35-37

вода

pH 7,8-8,0

АТСС 6633

8,0

ФСО

Метиловый спирт до

Мидекамици-

концентрации 500

Bac.subtilis

№ 9,

#Мидекамицин

на ацетата

35-37

мкг/мл, а затем

АТСС 6633

pH 7,8-8,0

ФСО

буфер 7, рН 4,5

Метацикли-

0,01 М раствор

№ 6+1%

Bac.subtilis,

#Метациклин

на гидрохло-

хлористоводородной

Буфер № 2 pH 5,8-6,0

глюкозы pH

30-37

var. Л2

рида ФСО

кислоты

6,8-7,0

Метицилли-

№ 11,

на натрие-

Буфер № 1,

Staphуlococcus

№7+0,1%

#Метициллин

35-37

вой соли

pH 6,8-7,0

аureus 209

глюкозы

ФСО

pH 6,8-7,0

Диметилсульфоксид

до 50 мкг/мл,а затем

буфер № 4 pH 7,8-

8,0 (Срок годности

№16+1%

Микогепти-

Candida utilis

#Микогептин

Диметилсульфоксид

растворов при

глюкозы pH

29-31

на ФСО

ЛИА - 01

комнатной

5,8-6,0

температуре не

более 30 м)

Bac.cereus

Мономицина

Дистиллированная

3 % раствор хлорида

№ 9

#Мономицин

var.mycoides

35-37

ФСО

вода

калия

pH 7,8-8,0

537

Неомицина

Bac.cereus

Буфер № 4,

№ 9

#Неомицин

сульфата

var.mycoides

35-37

pH 7.8-8,0

pH 7,8-8,0

ФСО

537

Bacillus pumilus

NCTC 8241

E; 7.9

30-37

Неомицина

CIP 76.18

Неомицина

Дистиллированная

сульфата

8,0 (0,05 М)

Bacillus subtilis

сульфат

вода

ФСО

NCTC 10400

E; 7.9

30-37

CIP 52.62

ATCC 6633

№ 16+1%

Нистатина

Буфер № 3

Candida utilis

#Нистатин

Диметилформамид

глюкозы

29-31

ФСО

pH 6,0-6,2

ЛИА - 01

pH 5,8-6,0

Saccharomyce

6,0 (0,05 М) при

s cerevisiae

Нистатина

Нистатин

Диметилформамид

содержа-нии 5 об.%

NCYC 87

F; 6.0

30-32

ФСО

диметилформамида

CIP 1432-83

ATCC 9763

№ 11,

Оксациллина

Буфер № 1,

Staphуlococcus

№ 7+0,1%

#Оксациллин

натриевой

35-37

pH 6,8-7,0

aureus 209 P

глюкозы

соли ФСО

pH 6,8-7,0

Окситетра-

0,01 М раствор

№ 6+1%

#Окситетра-

циклина

Bac.subtilis,

хлористоводородной

Буфер № 2 pH 5,8-6,0

глюкозы

30-37

циклин

гидрохлорида

var. Л2

кислоты

pH 6,8-7,0

ФСО

Олеандо-

Bac.cereus

#Олеандо-

Буфер № 3

Буфер № 4,

№ 9

мицина фос-

var.mycoides

35-37

мицин

pH 6,0-6,2

pH 7,8-8,0

фата ФСО

НВ

Стандартный образец

Оливомицин-

в этиловом спирте из

№ 11,

Буфер № 1,

Bac.subtilis

#Оливомицин

кислоты

расчета 5 мг в1 мл,

№ 18

35-37

pH 6,8-7,0

АТСС 6633

ФСО

затем буфер № 1

pH 6,8-7,0

Полимиксина

Bordеtella

#Полимиксин

Буфер № 3

Буфер № 5

№ 15,

М сульфата

bronchiseptica

35-37

pH 6,0-6,2

pH 7,0-7,2

ФСО

АТСС 4617

Полимиксина

Bordеtella

#Полимиксин

№ 15

В сульфата

Буфер № 3 pH 6,0-6,2

Буфер № 5 pH 6,0-6,2

bronchiseptica

35-37

pH 7,0-7,2

ФСО

АТСС 4617

Bordetella

Полимиксина

bronchiseptica

Полимиксина

Дистиллированная

В сульфата

6,0 (0,05 М)

NCTC 8344

B; 7.3

35-39

В сульфат

вода

ФСО

CIP 53.157

ATCC 4617

1 мл

диметилформамида на

№ 10+0,1%

Рифампицина

Bac.subtilis

#Рифампицин

10 мл навески, затем

Буфер № 3 pH 6,0-6,2

глюкозы

35-37

ФСО

АТСС 6633

дистиллированная

pH 6,0-6,2

вода

Micrococcus

Рифамицина

flavus

натриевая

натриевой

Метанол

7,0 (0,05 М)

NCTC 8340

A; 6.6

35-39

соль

соли ФСО

CIP 53.45

ATCC 9341

Рубомицина

Bac.cereus

Дистиллированная

Буфер № 4,

№ 5

#Рубомицин

гидрохлори-

var.mуcoides

35-37

вода

pH 6,8-7,0

pH 7,8-8,0

да ФСО

537

Сизомицина

Буфер № 4,

Bac. рumilus

№ 12, № 8

#Сизомицин

сульфата

35-37

pH 6,8-7,0

NCTC 8241

pH 7,8-8,0

ФСО

Стрептоми-

Bac.cereus

#Стрепто-

Буфер № 4,

№ 9

цина суль-

Буфер №3 pH 6,0-6,2

var.mуcoides

35-37

мицин

pH 6,8-7,0

pH 7,8-8,0

фата ФСО

537

Bacillus subtilis

NCTC 8236,

A; 7.9

30-37

Стрепто-

Стрептоми-

CIP 1.83.

Дистиллированная

мицина

цина суль-

8,0 (0,05 М)

Bacillus subtilis

вода

сульфат

фата ФСО

NCTC 10400

A; 7.9

30-37

CIP 52.62,

ATCC 6633

Bacillus subtilis

Спирамицина

NCTC 10400,

Спирамицин

Метанол

8,0 (0,05 М)

A; 7.9

30-32

ФСО

CIP 52.62,

ATCC 6633

Тетрацикли-

0,01 М раствор

Bac.subtilis,

№ 6+1%

#Тетрациклин

Буфер № 2 pH 5,8-6,0

35-37

на гидро-

хлористоводородной

var. Л2

глюкозы

хлорида ФСО

кислоты

pH 6,8-7,0

Bacillus subtilis

Тобрамицина

Дистиллированная

NCTC 10400

Тобрамицин

8,0 (0,05 М)

A; 7.9

30-37

ФСО

вода

CIP 52.62

ATCC 6633

Bacillus subtilis

NCTC 10400

E; 7.9

30-37

CIP 52.62

Фрамицети-

Фрамицетина

Дистиллированная

ATCC 6633

на сульфата

8,0 (0,05 М)

сульфат

вода

Bacillus

ФСО

pumilus

E; 7.9

30-37

NCTC 8241

CIP 76.18

№ 11,

#Фенокси-

Фенокси-

Буфер № 1,

Staрhуlococcus

№ 7+0,1%

метилпени-

35-37

pH 6,8-7,0

aureus 209 P

глюкозы

циллин

циллина ФСО

pH 6,8-7,0

Флорими-

Дистиллированная

Буфер № 4, рН 7,8-

Bac.subtilis

№ 8

#Флоримицин

цина суль-

35-37

вода

8,0

АТСС 6633

pH 7,8-8,0

фата ФСО

Стандартный образец

- в этиловом спирте из

Фузидиевой

расчета 10 мг/мл,

Bac.cereus

№ 10+1%

Буфер № 3

#Фузидин

кислоты

затем буфер № 4;

var.mуcoides

глюкозы

35-37

pH 6,0-6,2

ФСО

испытуемый образец -

НВ

pH 6,0-6,2

в буфере № 4, рН 7,8-

8,0

№ 11,

Цефалексина

Буфер № 1,

Bac.subtilis

№ 7+0,1%

#Цефалексин

35-37

ФСО

pH 6,8-7,0

АТСС 6633

глюкозы

pH 6,8-7,0

№ 11,

Цефалотина

Буфер№ 1,

Буфер № 1,

Bac.subtilis

№ 7+0,1%

#Цефалотин

натриевая

35-37

pH 6,8-7,0

АТСС 6633

глюкозы

соль ФСО

pH 6,8-7,0

Хлортетра-

0,01 М раствор

№ 6+1%

#Хлортетра-

циклина

Bac.subtilis,

хлористоводородной

Буфер № 2

глюкозы pH

35-37

циклин

гидрохлори-

var. Л2

кислоты

6,8-7,0

да ФСО

1 мл этилового

Bac.cereus

Эритро-

спирта на 10 мг

Буфер № 4,

№ 9

#Эритромицин

var.mуcoides

35-37

мицина ФСО

навески, затем буфер

рН 7,8-8,0

pH 7,8-8,0

НВ

№ 4 до 1000 ЕД/мл

Bacillus pumil

Эритромицина

NCTC 8241

эстолат

CIP 76.18

A; 7.9

30-37

Метанол (см. частные

Эритромицина

Эритро-

Bacillus

статьи)

8,0 (0,05 М)

этилсукцинат

мицина ФСО

subtilis

Метанол

Эритромицина

NCTC 10400

A; 7.9

30-37

стеарат

CIP 52.62

ATCC 6633

В. МЕТОД ТУРБИДИМЕТРИИ

Подходящую питательную среду с суспензией выбранного микроорганизма,

обладающего чувствительностью к тестируемому антибиотику, инокулируют таким

образом, чтобы в условиях определения происходило достаточно значительное

ингибирование микробного роста. Количество суспензии выбирают таким образом,

чтобы получить после четырех часов инкубации помутнение, легко подвергающееся

количественной оценке.

Инокулированную среду используют немедленно после ее приготовления.

Используя растворитель и буферный раствор, указанные в Таблице 2.7.2.-2,

готовят растворы стандартного образца и испытуемого антибиотика, имеющие

известные концентрации и предположительно равные активности. Для оценки

достоверности количественного определения используют не менее трех доз

стандартного образца и трех доз испытуемого антибиотика. Предпочтительно

использовать ряды доз, меняющихся в геометрической прогрессии. Для получения

необходимой линейности может оказаться необходимым осуществить выбор из

большого количества трех последовательных доз, используя соответствующие дозы

для стандартного образца и испытуемого антибиотика.

Помещают равные объемы каждого из растворов в идентичные пробирки и

добавляют в каждую пробирку равные объемы инокулированной среды (например, 1

мл раствора и 9 мл среды).

Одновременно готовят две контрольные пробирки без антибиотика,

содержащие инокулированную среду. В одну из них немедленно добавляют 0,5 мл

формальдегида. Эти пробирки используют для настройки оптического прибора,

используемого для измерения роста.

Все пробирки, распределенные случайным образом, методом латинского

квадрата или рандомизированного блочного распределения, помещают в водяную

баню или в другой подходящий аппарат, позволяющий быстро довести температуру

всех пробирок до соответствующей температуры инкубации и поддерживать их при

этой температуре в течение 3-4 часов, обеспечивая однородность температурного

режима и равное время инкубации.

По окончании инкубации рост микроорганизмов останавливают добавлением

0,5 мл формальдегида в каждую пробирку или тепловой обработкой и измеряют

степень мутности, используя подходящий оптический прибор. Можно использовать

метод, позволяющий измерять степень мутности в каждой пробирке по окончании

одинаковых периодов инкубации.

Измеряют активность с использованием подходящих статистических методов.

Линейность преобразованной или не преобразованной зависимости реакции

от дозы часто получается лишь в ограниченном промежутке. Именно в этом

промежутке необходимо производить вычисление активности. Для подтверждения

линейности определение проводят на трех последовательных дозах из этого

промежутка. В рутинных анализах по согласованию с компетентными органами

определение может проводиться по двум значениям при условии, что линейность

подтверждена адекватным количеством экспериментов с использованием трех

значений. Однако, во всех спорных случаях должно применяться вышеописанное

определение по трем значениям.

В каждом определении используют достаточное для получения требуемой

точности количество репликаций. Определение может быть проведено повторно, и

результаты статистически комбинированы для получения требуемой точности и для

подтверждения того, что активность испытуемого антибиотика не менее

минимальных требований.

Таблица 2.7.2.-2

Количественное определение методом турбидиметрическим методом.

Антибиотик

Стандартный

Растворитель,

Буферный

Микроорганизм

Среда и

Темпе-

образец

используемый

раствор (рН)

конечное

ратура

для приготов-

значение рН

инкуба-

ления раствора

(±0,1 ед. рН)

ции, ⁰C

Staphylococcus

Ванкомицина

Дистиллирован-

aureus

гидрохлорида

8,0

C; 8.0

37-39

гидрохлорид

ная вода

ATCC 6538 P

ФСО

CIP 53.156

Staphylococcus

Гентамицина

aureus

Гентамицина

Дистиллирован-

сульфата

7,0

NCTC 7447

C; 7.0

35-37

сульфат

ная вода

ФСО

CIP 53.156

ATCC 6538 P

7,0. Может

оказаться

необходимым

добавление

Streptococcus

детергента для

faecalis

предотвращения

Грамицидина

ATCC 10541

Грамицидин

Метанол

адсорбции

C; 7.0

35-37

ФСО

Staphylococcus

материала в ходе

aureus

разведений,

ATCC 6538 P

например,

полисорбата 80 в

концентрации 0,1

мг/мл

Klebsiella

Дигидро-

pneumoniae

Дистиллированная

8,0

стрептомици-

стрептоми-

NCTC 7427

C; 7.0

35-37

вода

на сульфат

цина ФСО

CIP 53.153

ATCC 10031

Канамицина

Staphylococcus

моносульфат

Канамицина

aureus

Дистиллированная

8,0

Канамицина

сульфата

NCTC 7447

C; 7.0

35-37

вода

кислый

ФСО

CIP 53.156

сульфат

ATCC 6538 P

Колистина

сульфата

Колистина

Escherichia coli

C; 7.0

35-37

ФСО

сульфат

Дистиллированная

NCIMB 8666

Колистин-

7,0

Колистиметата

вода

CIP 2.83

натриевая соль^{метансульфо-}

ATCC 9637

ната натрия

ФСО

Staphylococcus

Неомицина

aureus

Неомицина

Дистиллированная

8,0

сульфата

NCTC 7447

C; 7.0

35-37

сульфат

вода

ФСО

CIP 53.156

ATCC 6538 P

Escherichia coli

Рифамицина

7,0

NCIMB 8879

натриевая

натриевой

Метанол

C; 7.0

35-37

CIP 54.127

соль

соли ФСО

ATCC 10536

Staphylococcus

aureus

Спирамицина

7,0

Спирамицин

Метанол

NCTC 7447

C; 7.0

35-37

ФСО

CIP 53.156

ATCC 6538 P

Klebsiella

pneumoniae

NCTC 7427

Стрептомицина^{Стрептоми-}

Дистиллированная

8,0

цина суль-

CIP 53.153

C; 7.0

35-37

сульфат

вода

фата ФСО

ATCC 10031

Staphylococcus

Тобрамицина

Дистиллированная

7,0

Тобрамицин

aureus

C; 7.0

35-37

ФСО

вода

NCTC 7447

ATCC 6538 P

CIP 53.136

ATCC 9144

Staphylococcus

Фрамицетина

aureus

Фрамицетина

Дистиллированная

8,0

сульфата

NCTC 7447

C; 7.0

35-37

сульфат

вода

ФСО

CIP 53.156

ATCC 6538 P

Klebsiella

pneumoniae

Эритромицина

NCTC 7427

Метанол (см.

D; 7.0

35-37

эстолат

CIP 53.153

частные статьи)

Эритромицина

Эритромици-

8,0

ATCC 10031

этилсукцинат

на ФСО

Staphylococcus

Эритромицина

aureus

Метанол

C; 7.0

35-37

стеарат

NCTC 7447

CIP 53.156

ATCC 6538 P

Следующий раздел дается для информационных и методических целей; он

не является обязательной частью общего метода.

РЕКОМЕНДУЕМЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

В нижеследующем тексте приводятся рекомендуемые микроорганизмы и

условия их применения. Могут также использоваться и другие микроорганизмы при

условии, что показана их чувствительность к испытуемому антибиотику и они могут

использоваться в подходящей среде и при подходящих значениях температуры и

рН. Концентрации используемых растворов должны быть выбраны таким образом,

чтобы в условиях испытания обеспечивалось наличие линейной зависимости между

логарифмом дозы и реакцией.

Приготовление посевного материала:

Bacillus cereus var. mycoides; Bacillus subtilis; Bacillus pumilus. Суспензия спор

микроорганизмов, используемая в качестве посевного материала, готовится

следующим образом.

Микроорганизм выращивается при 35-37°С в течение 7 дней на поверхности

подходящей среды, к которой добавлен сульфат марганца (II) в концентрации 0,001

г/л. Выращенную культуру, состоящую в основном из спор, смывают стерильной

водой. Нагревают суспензию при 70 °С 30 минут и разбавляют для получения

подходящей концентрации спор, обычно от 10 х 10⁶ до 100 х 10⁶ в мл. Суспензия

спор может храниться в течение продолжительного времени при температуре, не

превышающей 4°С.

Суспензия спор также может быть приготовлена путем культивирования

организмов в среде С при 26°С в течение 4-6 дней с последующим добавлением в

асептических условиях сульфата марганца в количестве, достаточном для

получения концентрации 0,001 г/л и инкубированием в течение 48 часов. Суспензию

микроскопируют для подтверждения спорообразования

(около

80%) и

центрифугируют. Осадок ресуспендируют в стерильной воде, получая концентрацию

спор от 10 х 10⁶ до 100 х 10⁶ в миллилитре, после чего нагревают при 70°С в течение

30 минут. Суспензию хранят при температуре, не превышающей 4°С.

Bordetella bronchiseptica. Микрорганизм выращивают на среде В при 35-37°С в

течение 16-18 ч. Выращенную культуру смывают стерильной водой и разбавляют до

требуемой степени мутности.

Staphylococcus aureus; Klebsiella pneumoniae; Escherichia coli; Micrococcus

flavus; Staphylococcus epidermidis. Посевной материал готовят по методу,

описанному выше для В. bronchiseptica, но с использованием среды А и доведением

степени мутности до значения, дающего, в зависимости от метода,

удовлетворительную зависимость реакции от дозы в турбидиметрическом

определении или четкие зоны ингибирования подходящего диаметра.

Saccharomyces cerevisiae; Candida tropicalis. Тест-культуры выращивают на

среде F при

30-37°С

24 часа. Смывают выращенную культуру стерильным

раствором натрия хлорида с концентрацией 9 г/л. Разбавляют до требуемой степени

мутности тем же раствором.

# Допустимо использование следующих методов приготовления посевного

материала:

Candida utilis ЛИА-01

Выращивают в пробирках со скошенной средой № 3 в течение 48 часов при

температуре (30 ± 1)°С.

Staphylococcus aureus

Выращивают в пробирках со скошенной средой № 1 в течение 24 часов при

температуре (36 ± 1)°С.

Bordetella bronchiseptica

Выращивают в пробирках со скошенной средой № 1. Продолжительность

инкубации 30-36 часов при температуре (36 ± 1)°С.

Pseudomonas aeruginosa NCTC 2134

Выращивают на мясо-пептонном бульоне рН 7,2-7,4 при температуре (36 ±

1)°С в течение 18-20 часов.

Bacillus pumilus, NCTC 8241, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus cereus var.mycoides

HB, Bacillus cereus var.mycoides 537

Для получения суспензии спор тест-микроорганизмы выращивают на

скошенной среде в пробирках (среда № 1 для В. subtilis var.L₂, B.pumilus NCTC8241,

В. subtilis ATCC 6633, B.cereus var.mycoides HB; среда № 2 для B.cereus var.mycoides

537), при температуре (36 ± 1)°C 18-20 часов. Культуру, выращенную в пробирках,

смывают 5-10 мл стерильного раствора натрия хлорида

0,9

%, засевают ею

несколько матрацев с 300 мл питательной среды со скошенной поверхностью,

(среда № 4 для B.pumilus, В. cereus var.mycoides 537; среда № 5 для В. subtilis ATCC

6633, B.cereus var.mycoides HB). На матрацах посевы инкубируют при температуре

(36 ± 1)°С в течение 5-7 суток. В процессе выращивания проводят микроскопический

контроль культуры. Культуру, содержащую

80-90

% спор, смывают стерильной

дистиллированной водой.

Полученную взвесь спор прогревают при температуре от 60 до 70°С в течение

30 минут. Затем промывают стерильной дистиллированной водой при

центрифугировании до полной прозрачности надосадочной жидкости. Промытую

взвесь спор вновь прогревают в течение 30 минут при температуре от 60 до 70°С.

Взвесь спор хранят при температуре от 4 до 10°С и используют до тех пор, пока

интенсивность роста и четкость зон при определении антимикробной активности

препаратов удовлетворяют предъявляемым требованиям.

Таблица 2.7.2 - 3

Характеристики культуральных свойств тест-микроорганизмов.

Название

При росте на плотной питательной

При росте на жидкой

При

тест-микроба

среде

питательной среде

микроскопическом

условия

описание культуры

условия

описание

изучении мазка

выращивания

выращивани

культуры

агаровой культуры,

окрашенной по

Граму

Однородные по

Среда № 1. Т⁰

Равномереное

Гладкие с ровными

Мясо-

величине и

(36±1)°С, 18-20

помутнение

краями колонии, с

пептонный

расположению в виде

Staphylococcus

ч. затем при

бульона без

равномерной

бульон.

гроздьев кокки с

aureus 209 Р

комнатной

пленки и

золотистой

рН 7,2—7,4,

хорошо выраженной

температуре 24

слизистого осадка

пигментацией

18—20 ч

грамположительной

на дне

окраской

Овальные иногда с

Круглые кремового

МПБ.

Рост в виде

Среда № 3.

отростками клетки:

Candida utilis

цвета с матовой

рН 7,2-7.4 с 1

равномерной

Т⁰ (30±1) ^ºС. 48

расположены

ЛИА-01

поверхностью колонии

% глюкозой.

мути и осадка на

отдельно, цепочками

с ровными краями

18—20 ч

дне

или группами

Колонии желтоватого

Палочки с

цвета, круглой формы

закругленными

влажно блестящие с

краями,

Среда №1.

МПБ.

Рост в виде

Bacillus subti-

шагреневой

располагающиеся

Т⁰ (36±1) ⁰С.

рН 7.2—7,4

пленки

lis. var. Л2

поверхностью, слегка

отдельно и цепочками

18—20ч

18—20 ч

с осадком на дне

зазубренными краями

с хорошо выраженной

и приподнятым

грамположительной

центром

окраской

Тонкие палочки

располагающиеся

Среда № 1.

Мелкие сероватые

МПБ.

Рост в виде

отдельно или

Bacillus subtilis

Т⁰ (36±1) ºС

колонии с зубчатым

рН 6.8—7.0.

пленки

цепочками, с хорошо

ATCC 6633

18—20 ч

краем

18—20 ч

с осадком на дне

выраженной

грамположительной

окраской

Палочки с

закругленными

Шероховатые колонии

концами,

Морщинистая

Bacillus cereus.

Среда № 2

с краем,

МПБ.

располагающимися

пленка: вся среда

var. mycoides

Т⁰ (36±1) ⁰С.

сформированным из

рН 7.8—8.0.

отдельно или

прозрачная без

537

18—20 ч.

переплетающихся

18—20 ч

цепочками, с хорошо

осадков

волокон

выраженной

грамположительной

окраской

Тонкие с

закругленными

Равномерное

концами палочки

Гладкие колонии с

Bacillus cereus.

Среда №1.

МПБ.

помутнение

располагающиеся

ровными краями и

var. mycoides

Тº (36±1)⁰С.

рН 6.8-7,0,

бульона без

отдельно или

сферической

НВ

18—20 ч

образования

короткими цепочками

поверхностью

пленки и осадка

с хорошо выраженной

грамположительно

окраской

Тонкие, мелкие

палочки с

закругленными

Мелкие серовато-

Равномерное

концами,

Bacillus pumilus

Среда № 1.

голубого цвета колонии

МПБ.

помутнение

располагающиеся

NCTC

Т⁰ (36±1)ºС.

с зазубренными

рН. 7.2—7.4.

бульона без

отдельно или

8241

18—20 ч

краями и приподнятым

18—20 ч

образования

короткими цепочками,

центром

пленки и осадка

с хорошо выраженной

грамположительной

окраской

Одиночные, короткие,

МПА.

Мелкие, мутные, белые

Заметное

Bordetella

тонкие палочки с

рН 7.2—7.4

слегка выпуклые

МПБ.

помутнение,

bronchiseptica

хорошо выраженной

Т⁰ (36-±1) ⁰С.

фарфоровидные

рН 7.2—7.4

серая пленка,

ATCC 4617

грамотрицательной

18—20 ч

колонии

тягучий осадок

окраской

Заметное

Одиночные палочки,

Широкие

помутнение,

МПА.

либо короткие

Pseudomonas

расплывчатые

толстая пленка,

рН 7.2—7.4.

МПБ.

цепочки с хорошо

aeruginosa

прозрачные с

среда может

Т⁰ (36±1) ⁰С.

рН 7.2—7.4

выраженной

NCTC 2134

неровным краем

приобретать

18—20 ч

грамотрицательной

колонии

желтовато-

окраской

зеленую окраску

Буферные растворы. Буферные растворы с показателем рН в интервале от

5,8 до

8,0 готовят смешиванием

50,0 мл

0,2 М раствора калия фосфата

однозамещенного с указанным в Таблице 2.7.2.-4 объемом 0,2 М раствора натрия

гидроксида. Разбавляют свежеприготовленной дистиллированной водой до 200,0

мл.

Таблица 2.7.2.-4

Буферные растворы

рН

Объем 0,2 М раствора

рН

Объем 0,2 М раствора

натрия гидроксида, мл

5,8

3,72

7,0

29,63

6,0

5,70

7,2

35,00

6,2

8,60

7,4

39,50

6,4

12,60

7,6

42,80

6,6

17,80

7,8

45,20

6,8

23,65

8,0

46,80

Эти буферные растворы используются для всех микробиологических

определений, указанных в Таблице 2.7.2.-1, за исключением блеомицина сульфата и

амфотерицина В.

Буферный раствор (рН 6,8) для блеомицина сульфата готовят растворением

6,4 г калия фосфата однозамещенного и 18,9 г натрия фосфата двузамещенного в

воде и доведением объема до 1000 мл.

# Допускается также применение буферных растворов следующего состава:

Буфер № 1

Состав:

Калия фосфат однозамещенный

3,63 г

Натрия фосфат двузамещенный

7,13 г

Вода дистиллированная

до 1000 мл

рН буфера

6,9±0,1

Буфер № 2

Состав:

Натрия цитрат трехзамещенный

20,6 г

Кислота хлористоводородная концентрированная

1,81 г

Вода дистиллированная

до 1000 мл

рН буфера

5,9±0,1

Буфер № 3

Состав:

Калия фосфат однозамещенный

7,72 г

Натрия фосфат двузамещенный

1,78 г

Вода дистиллированная

до 1000 мл

рН буфера

6,1±0,1

Буфер № 4

Состав:

Калия фосфат однозамещенный

0,68 г

Натрия фосфат двузамещенный

10,99 г

Вода дистиллированная

до 1000 мл

рН буфера

7,9±0,16

Буфер № 5

Состав:

Калия фосфат однозамещенный

32 г

Натрия фосфат двузамещенный

8 г

Вода дистиллированная

до 1000 мл

рН буфера

6,1 ±0,1

Буфер № 6

Состав:

Натрия фосфат двузамещенный

35,8 г

Вода дистиллированная

до 1000 мл

рН буфера

6,0

Буфер № 7

Состав:

Натрия фосфат однозамещенный

0,64 г

Натрия фосфат двузамещенный

0,195 г

Вода дистиллированная

до 1000 мл

рН буфера

4,5

Буферные растворы стерилизуют насыщенным паром под давлением при 121°С 15

минут.

Питательные среды. Могут быть использованы следующие или

эквивалентные питательные среды.

Среда А.

Пептон

6г

Панкреатический гидролизат казеина

4г

Мясной экстракт

1,5 г

Дрожжевой экстракт

3 г

Глюкозы моногидрат

1 г

Агар

15 г

Вода

до 1000 мл

Среда В

Панкреатический гидролизат казеина

17 г

Папаиновый гидролизат соевых бобов

3 г

Натрия хлорид

5 г

Калия фосфат двузамещенный

2,5 г

Глюкозы моногидрат

2,5 г

Агар

15 г

Полисорбат 80

10 г

Вода

до 1000 мл

Полисорбат 80 добавляется к горячему раствору остальных ингредиентов

после кипячения, непосредственно перед доведением объема.

Среда С.

Пептон

6г

Мясной экстракт

1,5 г

Дрожжевой экстракт

3 г

Натрия хлорид

3,5 г

Глюкозы моногидрат

1 г

Калия фосфат двузамещенный

3,68 г

Калия фосфат однозамещенный

1,32 г

Вода

до 1000 мл

Среда D.

Экстракт сердца

1,5 г

Дрожжевой экстракт

1,5 г

Пептон-казеин

5 г

Глюкозы моногидрат

1 г

Натрия хлорид

3,5 г

Калия фосфат двузамещенный

3,68 г

Калия фосфат однозамещенный

1,32 г

Калия нитрат

2 г

Вода

до 1000 мл

Среда Е.

Пептон

5 г

Мясной экстракт

3 г

Натрия фосфат двузамещенный двенадцативодный

26,9 г

Агар

10 г

Вода

до 1000 мл

Натрия фосфат двузамещенный добавляется в виде стерильного раствора

после стерилизации среды.

Среда F.

Пептон

9,4 г

Дрожжевой экстракт

4,7 г

Мясной экстракт

2,4 г

Натрия хлорид

30,0 г

Глюкозы моногидрат

10,0 г

Агар

23,5 г

Вода

до 1000 мл

Среда G.

Глицерин

10 г

Пептон

10 г

Мясной экстракт

10 г

Натрия хлорид

3 г

Агар

15 г

Вода

до 1000 мл

рН 7,0+0,1 после стерилизации

Среда № 1

Состав:

Мясо-пептонный бульон

1000 мл

Агар-агар

20 г

рН после стерилизации

7,1 ±0,1

Среда № 2

Состав:

Мясо-пептонный бульон

1000 мл

Агар-агар

20 г

рН после стерилизации

7,9 ±0,1

Среда № 3

Состав:

Мясо-пептонный бульон

1000 мл

Агар-агар

17 г

Глюкоза

10 г

Натрия хлорид

5г

рН после стерилизации

7,1±0,1

Среда № 4

Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием

1000 мл

аминного азота 35-40% мг %

Агар-агар

25 г

рН после стерилизации

6,1±0,1

Среда № 5

Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием

1000 мл

аминного азота 35-40% мг %

Агар-агар

25 г

рН после стерилизации

7,9±0,1

Среда № 6

Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием

1000 мл

аминного азота 130-140% мг %

Агар-агар

10 - 15 г

рН после стерилизации

6,9±0,1

Среда № 7

Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием

1000 мл

аминного азота 130-140% мг %

Агар-агар

10-12 г

Натрия фосфат двузамещенный

3 г

рН после стерилизации

6,9±0,1

Среда № 8

Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием

1000 мл

аминного азота 130-140% мг %

Агар-агар

10-12 г

Натрия фосфат двузамещенный

3 г

рН после стерилизации

7,9±0,1

Среда № 9

Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием

1000 мл

аминного азота 35-40% мг %

Натрия фосфат двузамещенный

3 г

рН после стерилизации

7,9±0,1

Среда № 10

Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием

1000 мл

аминного азота 130-140% мг %

Агар-агар

10-15 г

Калия фосфат однозамещенный

25 г

рН после стерилизации

6,1 ±0,1

Среда № 11

Состав:

Агар-агар

10-15 г

Натрия фосфат двузамещенный

3 г

Вода дистиллированная

до 1000 мл

рН после стерилизации

6,9 ±0,1

Среда № 12

Состав:

Агар-агар

15 г

Натрия фосфат двузамещенный

3 г

Вода дистиллированная

до 1000 мл

рН после стерилизации

7,9±1

Среда № 13

Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием

1000 мл

аминного азота 35-40% мг %

Агар-агар

20 г

Калия хлорид

20 г

рН после стерилизации

7,1± 1

Среда № 14

Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием

1000 мл

аминного азота 35-40% мг %

Агар-агар

15 г

рН после стерилизации

7,9± 1

Среда № 15

Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием

1000 мл

аминного азота 35-40% мг %

Агар-агар

15г

Калия фосфат однозамещенный

25 г

рН после стерилизации

7,1±,0,1

Среда № 16

Состав:

Агар-агар

18-20 г

Натрия фосфат двузамещенный

5г

Натрия хлорид

Аммония цитрат двузамещенный

5 г

Калия хлорид

20 г

Вода дистиллированная

до 1000 мл

рН после стерилизации

5,9±,0,1

Среда № 17

Состав:

Агар-агар

18 г

Глюкоза

5 г

Натрия фосфат двузамещенный

15 г

Мочевина

2г

Аммония хлорид

2г

Вода дистиллированная

до 1000 мл

рН после стерилизации

7,9±1

Среда № 18

Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием

1000 мл

аминного азота 130-140% мг %

Агар-агар

15-20 г

Глюкоза

5 г

Натрия хлорид

30 г

рН после стерилизации

6,9±1

Среды стерилизуют насыщенным паром под давлением при 121°С 15 минут.

При приготовлении питательных сред вместо раствора гидролизата мяса по

Хоттингеру можно использовать питательные среды на основе рыбного или мясо-

пептонного бульона с таким же содержанием аминного азота

Среды стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121 °С в

течение 15 минут.

2.7.3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРТИКОТРОПИНА

Активность кортикотропина определяют путем сравнения одного или

нескольких из его биологических эффектов с аналогичными эффектами

Международного Стандарта или препарата сравнения, калиброванного в

Международных Единицах при проведении экспериментов в аналогичных условиях.

За Международную Единицу принимают активность установленного

количества Международного Стандарта, состоящего из высушенного из

замороженного состояния очищенного свиного кортикотропина с добавлением

лактозы. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах

устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец кортикотропин BRP калиброван в Международных

Единицах в сравнении с Международным Стандартом.

В испытании используют крыс обоего пола массой тела от 100 до 200 г.

Разница в массе тела у самого тяжелого и самого легкого животного должна

составлять не более 15 г. Крыс содержат в однородных условиях в течение не менее

7 дней до начала испытания. В день, предшествующий испытанию, крыс

взвешивают и проводят гипофизэктомию. После операции крысам обеспечивают

доступ к раствору глюкозы R концентрацией 50 г/л и раствору натрия хлорида R

концентрацией 1,8 г/л в дополнение к обычной диете и воде и содержат крыс в

помещении с постоянной температурой от 24 до 27⁰С. Испытание выполняют через

18-36 часов после гипофизэктомии.

В день испытания повторно взвешивают животных и делят их случайным

образом на 6 групп, каждая из которых состоит из 6-8 особей. Выбирают три дозы

препарата сравнения и три дозы испытуемого препарата таким образом, чтобы

наименьшая доза приводила к некоторому уменьшению, а наибольшая доза не

приводила к максимальному уменьшению содержания аскорбиновой кислоты в

надпочечниках. Дозы, отрегулированные с учетом массы тела животных, вводят

подкожно в случайном порядке. Подходящими обычно являются дозы порядка 1,0,

0,5 и 0,25 МЕ на 100 г массы тела. Если в частной статье нет иных указаний,

стандартный и испытуемый препараты растворяют в 0,01 М хлористоводородной

кислоте и выполняют последовательные разведения водой R, содержащей

желатин R в концентрации 150 г/л. Растворы вводят в течение 4 часов после

приготовления.

Через

3 часа после инъекции у анестезированной крысы удаляют обе

надпочечные железы, освобождают их от посторонних тканей и по возможности

быстро взвешивают для предотвращения потери массы. Крысу умерщвляют и

исследуют на предмет полноты гипофизэктомии.

Пару надпочечников измельчают и гомогенизируют в свежеприготовленном

растворе метафосфорной кислоты R концентрацией 25 г/л и разбавляют тем же

раствором до 10 мл. Гомогенат выдерживают в течение 30 минут, после чего

центрифугируют. 7 мл прозрачного супернатанта добавляют к свежеприготовленной

смеси, состоящей из 7 мл раствора натрия ацетата R концентрацией 45,3 г/л со

значением рН, доведенным до 7 путем добавления уксусной кислоты R, 3 мл воды

R и 2 мл стандартного раствора дихлорфенолиндофенола R. Через 30 секунд

после смешивания измеряют светопоглощение с помощью колориметра, используя

фильтр с максимумом пропускания при 470 нм, в диапазоне пропускания от 450 до

520 нм. Содержание аскорбиновой кислоты вычисляют из стандартной кривой,

которую

получают

аналогичной

обработкой

подходящих

объемов

свежеприготовленного раствора аскорбиновой кислоты R в

растворе

метафосфорной кислоты R концентрацией

25 г/л. Результаты выражают в

миллиграммах на

100 г надпочечной железы. Результат количественного

определения получают с использованием обычных статистических методов.

2.7.4. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ VIII

Количественное определение фактора свертывания крови VIII производят по

его биологической активности в качестве кофактора активации фактора Х

активированным фактором IX

(фактором IХa) в присутствии ионов кальция и

фосфолипидов. Активность препарата фактора VIII оценивают путем сравнения

количества, необходимого для достижения определенной скорости образования

фактора Ха в испытуемой смеси, содержащей вещества, принимающие участие в

активации фактора Х, и количества Международного Стандарта или препарата

сравнения, калиброванного в Международных Единицах, которое требуется для

получения такой же скорости образования фактора Ха.

За Международную Единицу принимают активность фактора VIII в

установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенного

из замороженного состояния концентрата человеческого фактора свертывания крови

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год) - часть 20