ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год)

(2) Важнейшие витамины

Биотин

100 мг

Кальция пантотенат

100 мг

Холина хлорид

100 мг

Фолиевая кислота

100 мг

i-Инозит

200 мг

Никотинамид

100 мг

Пиридоксаля гидрохлорид

100 мг

Рибофлавин

10 мг

Тиамина гидрохлорид

100 мг

Дистиллированная вода

до 1000 мл

(3) Ионагар

Высокочистый агар для использования в микробиологии и иммунологии го-

товят ионообменным методом с получением продукта исключительной чистоты,

прозрачности и прочности образующегося геля. Приблизительное содержание в

ионагаре:

Вода

12,2%

Зола

1,5%

Зола, нерастворимая в кислоте

0,2%

Хлор

Фосфаты (в пересчете на Р₂О₅)

0,3%

Общий азот

0,3%

Медь

0,0008%

Железо

0,017%

Кальций

0,28%

Магний

0,32%

(4) Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (модифицированный)

Натрия хлорид

6,4 г

Калия хлорид

0,32 г

Магния сульфат гептагидрат

0,08 г

Магния хлорид гексагидрат

0,08 г

Кальция хлорид безводный

0,112 г

Натрия гидрофосфат дигидрат

0,0596 г

Калия дигидрофосфат безводный

0,048 г

Дистиллированная вода

до 1000 мл

(5) Экстракт из сердца и мозгов

Экстракт мозга теленка

200 г

Экстракт говяжьего сердца

250 г

Протеозный пептон

10 г

Глюкозы моногидрат

2 г

Натрия хлорид

5 г

Натрия гидрофосфат безводный

2,5 г

Дистиллированная вода

до 1000 мл

(6) Бульон PPLO

Экстракт говяжьего сердца

50 г

Пептон

10 г

Натрия хлорид

5 г

Дистиллированная вода

до 1000 мл

2.6.8 ПИРОГЕННОСТЬ

Испытание состоит в измерении роста температуры тела вызванного у кро-

ликов внутривенным введением стерильного раствора испытуемой субстанции.

Выбор животных. Используют здоровых взрослых кроликов обоего пола мас-

сой не менее 1,5 кг, # желательно от 2,0 до 3,5 кг # получавших полноценное сба-

лансированное питание, не включающее антибиотиков, масса тела которых не

снижалась в течение недели, предшествующей испытанию. Кролика не следует

использовать в испытании на пирогенность, если:

a) он использовался в испытании на пирогенность, давшем отрицательный ре-

зультат, в течение предшествующих 3 дней:

б) он использовался в испытании на пирогенность, в котором испытуемая суб-

станция была признана не соответствующей требованиям, в течение предшест-

вующих 3 недель.

# Кролики, бывшие в опыте, могут быть использованы для определения пи-

рогенности повторно, но не ранее чем через 3 суток, если внедренный им до этого

раствор лекарственного средства или вода для инъекций были непирогенными.

Если же введенный раствор лекарственного средства или вода для инъекций ока-

зались пирогенными, кролики могут быть использованы для дальнейших опытов

через 2 недели. При повышении температуры у кроликов в подобных случаях на

1,2^оС и более они используются через 3 недели. Если исследуемые вещества об-

ладают антигенными свойствами, то одних и тех же кроликов нельзя использовать

для испытания повторно (если нет специальных указаний в частной статье)

Помещение для животных. Кроликов содержат индивидуально в спокойном

помещении при однородной подходящей температуре. Кроликов не кормят в те-

чение ночи и до окончания испытания. В течение испытания кроликам не дают во-

ду. Испытание проводят в тихом помещении, где отсутствует риск возникновения

помех, которые могут возбудить животных, и в котором температура поддержива-

ется на уровне, не более, чем на 3⁰С отличающемся от температуры, поддержи-

ваемой в месте постоянного содержания кроликов, или в котором кролики содер-

жались в течение не менее 18 часов до начала испытания.

Материалы. Стеклянная посуда, шприцы и иглы. Тщательно моют всю

стеклянную посуду, шприцы и иглы водой для инъекций и нагревают в сухожаро-

вом шкафу при 250⁰С в течение 30 минут или при 200⁰С в течение 1 часа.

Клетки. Клетки для кроликов, температура которых измеряется с помощью

электрического прибора, устроены таким образом, чтобы животные фиксирова-

лись лишь с помощью свободно закрепленных на шее хомутов; остальная часть

тела остается относительно свободной так, чтобы кролики могли сидеть в обыч-

ном положении. Они не удерживаются с помощью ремней или другими подобны-

ми методами, которые могут причинить вред животному. Животные помещаются в

клетки не менее чем за 1 час до первого измерения температуры и остаются там в

течение испытания.

Термометры. Используют термометр или электрическое устройство, пока-

зывающее температуру с точностью до 0,1⁰С, вводя его в прямую кишку кролика

на глубину около 5-7 см. Глубина введения постоянна для каждого из кроликов в

течение каждого из испытаний. При использовании электрического устройства,

оно может оставаться на месте в течение всего испытания.

Предварительное испытание. После отбора животных, за 1-3 дня до про-

ведения испытания продукции, тем из них, которые не использовались в течение

последних двух недель, вводят внутривенно апирогенный раствор хлорида натрия

концентрацией 9 г/л, нагретый приблизительно до 37,0⁰С в количестве 10 мл на

килограмм массы тела. Записывают температуру животных, начиная не менее,

чем за 90 минут до введения и продолжая в течение 3 часов после введения рас-

твора. Животные, температура которых колеблется в пределах более 0,6⁰С, не

используются в основном испытании.

Основное испытание. Испытание проводят с использованием группы из

трех кроликов.

Подготовка и введение продукта. Испытуемую жидкость перед введением

нагревают до 37,0⁰С. Испытуемый продукт может быть растворен или разведен в

апирогенном растворе, содержащем 9 г/л хлорида натрия, или другой раствори-

телем, указанной в частной статье. Раствор медленно вводят в крайнюю вену уха

каждого из кроликов в течение не более 2 минут, если иное не предписано в част-

ной статье. Количество вводимого продукта варьируется в зависимости от испы-

туемого препарата и указывается в частной статье. Вводимый объем должен со-

ставлять не менее 0,5 мл и не более 10 мл на 1 кг массы тела.

# Объем введенного раствора должен составлять не менее 0,1 мл и не бо-

лее 10 мл на 1,0 кг массы тела кролика.

Определение исходной и максимальной температуры. За «исходную тем-

пературу» каждого из кроликов принимают среднее из двух значение температу-

ры, записанных для данного кролика с интервалом 30 минут в течение 40 минут,

предшествующих введению испытуемого продукта. «Максимальная температура»

каждого из кроликов - самая высокая температура, записанная для данного кро-

лика в течение 3 часов после введения. Температуру каждого из кроликов запи-

сывают с интервалами, не превышающими 30-60 минут, начиная не менее, чем за

90 минут до введения испытуемого продукта и продолжая в течение 3 часов после

введения. За результат испытания принимают разность между максимальной и

исходной температурами каждого из кроликов. При отрицательной разности ре-

зультат принимают равным нулю.

При определении исходной температуры кролики, у которых два последо-

вательных значения температура варьируется в пределах, превышающих 0,2⁰С,

изымаются из испытания. В каждом из испытаний используют кроликов, исходная

температура которых отличается друг от друга не более, чем на 1⁰С. Кролики, ис-

ходная температура которых выше 39,5⁰С или ниже 38,5⁰С, изымаются из испыта-

ния.

Интерпретация результатов. После проведения испытания на группе из

трех кроликов, его при необходимости повторяют на других группах из трех кроли-

ков (суммарно до четырех групп), в зависимости от полученных результатов. Если

суммированный результат, полученный в первой группе, не превышает значение,

данное во второй колонке таблицы 2.6.8.-1, считают, что субстанция выдерживает

испытание. Если суммированный результат превышает значение, данное во вто-

рой колонке таблицы, но не превышает значение, данное в третьей колонке таб-

лицы, испытание повторяют, как указано выше. Если суммированный результат

превышает значение, данное в третьей колонке таблицы, считают, что продукт не

выдерживает испытание.

Таблица 2.6.8.-1.

Количество Продукт выдерживает испыта-

Продукт не выдерживает

кроликов

ние при суммированном ре-

испытание при суммиро-

зультате, не превышающем:

ванном результате, пре-

вышающем:

1,15⁰С

2,65⁰С

2,80⁰С

4,30⁰С

4,45⁰С

5,95⁰С

6,60⁰С

# Интерпретация результатов

Воду для инъекций или раствор лекарственного средства считают непиро-

генным, если сумма повышений температуры у 3 кроликов меньше или равна

1,4^оС; если эта сумма превышает 2,2^оС, то воду для инъекций или раствор лекар-

ственного средства считают пирогенными. В случаях, когда сумма повышений

температуры у 3 кроликов находится в пределах от 1,5 до 2,2^оС, испытание по-

вторяют дополнительно на 5 кроликах. В этом случае воду и для инъекций или

раствор лекарственного средства считают непирогенным, если сумма повышений

температуры у всех 8 кроликов не превышает 3,7^оС. Если же эта сумма равна

3,8^оС или больше, воду для инъекций или раствор лекарственного средства счи-

тают пирогенным.

# Таблица 2.6.9

Количество

Продукт выдерживает испыта-

Продукт не выдерживает испы-

кроликов

ние при суммированном резуль-

тание при суммированном ре-

тате, не превышающем:

зультате, превышающем:

1,4⁰С

2,2⁰С

1,5 до 2,2^оС

3,7⁰С

#Примечание: Испытание проводят поэтапно. На I этапе его выполняют на

трех кроликах. Если необходим II этап, его выполняют на пяти кроликах.

2.6.9. АНОМАЛЬНАЯ ТОКСИЧНОСТЬ

# ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

# Испытание проводят на здоровых белых мышах обоего пола массой 19-21

г, на которых ранее не проводили никаких испытаний.

# ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ МЕРОПРИЯТИЯ

# За 24 часа до испытания и во время его проведения животные должны

находиться в помещении с постоянной температурой. За 2 часа до взвешивания и

отбора животных для проведения испытания у них отбирается корм и вода.

ОБЩЕЕ ИСПЫТАНИЕ

Каждой из пяти здоровых мышей вводят внутривенно предписанное в част-

ной статье количество субстанции, растворенное в 0,5 мл воды для инъекций или

стерильного раствора хлорида натрия концентрацией 9 г/л. Если не предписано

иное, раствор вводят в течение 15-30 секунд.

# Мышь фиксируется на станке, в котором свободным остается только хво-

стик. Инъекция производится в хвостовую вену мыши.

# Если в частной статье предусмотрен иной путь введения препарата мы-

шам, объем раствора, вводимого в брюшную полость, под кожу или в желудок,

может быть увеличен до 1 мл. Введение в желудок производят шприцем посред-

ством инъекционной иглы, на конце которой имеется наплавленная олива, или

при помощи другого приспособления, обеспечивающего поступление раствора

или взвеси препарата в желудок.

Считают, что субстанция # и другие препараты # выдерживает испытание,

если ни одна из мышей не погибает в течение 24 часов или времени, указанного в

частной статье. Если погибает более одного животного, считают, что субстанция

не выдерживает испытание. Если погибает одно животное, испытание повторяют.

Считают, что препарат выдерживает испытание, если ни одна из мышей второй

группы не погибает в течение указанного промежутка времени.

# ПОВТОРНЫЕ ИСПЫТАНИЯ

# В случае гибели одной мыши опыт повторяют на 5 мышах; в случае гибе-

ли при первоначальном испытании двух мышей повторное испытание проводят на

15 животных. Если при повторном испытании ни одна мышь не погибнет, т.е. сум-

марная гибель животных в двух опытах не превысит 10%, препарат считается вы-

державшим испытание. В противном случае препарат бракуют.

ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ И ВАКЦИНЫ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Если не предписано иное, каждой из пяти здоровых мышей массой от 17 до

22 г внутрибрюшинно вводят одну человеческую дозу, но не более 1,0 мл. Чело-

веческая доза указана на этикетке или листке-вкладыше испытуемого препарата.

Животных наблюдают в течение 7 дней. Препарат выдерживает испытание, если

ни одно из животных не обнаруживает признаков недомогания. Если погибает бо-

лее одного животного, препарат не выдерживает испытание. Если одно из живот-

ных погибает или обнаруживает признаки недомогания, испытание повторяют.

Препарат выдерживает испытание, если ни одно из животных второй группы не

погибает и не обнаруживает признаков недомогания в течение указанного проме-

жутка времени.

Испытание также должно быть проведено на двух здоровых морских свин-

ках массой от 250 до 300 г. Внутрибрюшинно вводят каждому животному одну че-

ловеческую дозу, но не более 5,0 мл. Человеческая доза указана на этикетке или

листке-вкладыше испытуемого препарата. Животных наблюдают в течение 7

дней. Препарат выдерживает испытание, если ни одно из животных не обнаружи-

вает признаков недомогания. Если погибает более одного животного, препарат не

выдерживает испытание. Если одно из животных погибает или обнаруживает при-

знаки недомогания, испытание повторяют. Препарат выдерживает испытание, ес-

ли ни одно из животных второй группы не погибает и не обнаруживает признаков

недомогания в течение указанного промежутка времени.

ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ И ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЕТЕРИНАРНОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Если не предписано иное, каждой из пяти здоровых мышей массой от 17 до

22 г подкожно вводят 0,5 мл препарата. Животных наблюдают в течение 7 дней.

Препарат выдерживает испытание, если ни одно из животных не показывает зна-

чительной локальной или системной реакции. Если погибает более одного живот-

ного, препарат не выдерживает испытание. Если одно из животных погибает или

показывает значительную локальную или системную реакцию, испытание повто-

ряют. Препарат выдерживает испытание, если ни одно из животных второй группы

не погибает и не показывает значительной локальной или системной реакции в

течение указанного промежутка времени.

Испытание также должно быть проведено на двух здоровых морских свин-

ках массой от 250 до 300 г. Внутрибрюшинно вводят каждому животному не менее

2 мл препарата. Препараты, содержащие вспомогательные вещества, вводят под-

кожно. Животных наблюдают в течение 7 дней. Препарат выдерживает испыта-

ние, если ни одно из животных не показывает значительной локальной или сис-

темной реакции. Если погибает более одного животного, препарат не выдержива-

ет испытание. Если одно из животных погибает или показывает значительную ло-

кальную или системную реакцию, испытание повторяют. Препарат выдерживает

испытание, если ни одно из животных второй группы не погибает и не показывает

значительной локальной или системной реакции в течение указанного промежутка

времени.

2.6.10. ГИСТАМИН

Убивают морскую свинку массой от 250 до 350 г, которая была лишена пи-

щи в течение предшествовавших 24 часов. Извлекают участок периферийной тон-

кой кишки длиной 2 см и опорожняют отделенную часть путем тщательной про-

мывки раствором В, описанным ниже, с помощью шприца. К каждому из концов

присоединяют тонкую нить и делают маленький поперечный разрез в центре

фрагмента кишки. Помещают её в ванночку для органов, вместимостью от 10 до

20 мл, содержащую раствор B, поддерживаемый при постоянной температуре (от

34⁰С до 36⁰С), и пропускают через раствор смесь 95 частей кислорода и 5 частей

диоксида углерода. Укрепляют одну из нитей рядом с дном ванночки для органов.

Другую нить присоединяют к изотоническому миографу и регистрируют сокраще-

ния органа с помощью кимографа и другим подходящим способом непрерывной

регистрации. Если используется рычаг, его длина должна быть такой, чтобы дви-

жение органа усиливались приблизительно в 20 раз. Натяжение кишки должно со-

ставлять около 9,8 мН (1 г) и быть отрегулировано в соответствии с чувствитель-

ностью органа. Промывают ванночку для органов раствором В. Выдерживают в

течение 10 минут. Промывку раствором В повторяют еще 2 или 3 раза. Стимули-

руют серию сокращений путем добавления измеренных объемов от 0,2 до 0,5 мл

раствора гистамина дигидрохлорида R, имеющего концентрцию, которая вызы-

вает воспроизводимые субмаксимальные реакции. Эту дозу обозначают как «вы-

сокую дозу». Перед каждым добавлением гистамина ванночку для органов триж-

ды промывают (предпочтительно, путем переполнения без опорожнения ванноч-

ки) раствором В. Последовательные добавления следует выполнять, соблюдая

равные интервалы времени, достаточные для полной релаксации между добав-

лениями (около 2 минут). Добавляют равные объемы более разбавленного рас-

твора гистамина дигидрохлорида R, приводящего к воспроизводимым реакциям,

составляющим примерно половину от реакций, вызываемых «высокой дозой». Эту

дозу обозначают как «малую дозу». Продолжают периодическое добавление «вы-

соких» и «низких» доз раствора гистамина, следуя вышеуказанному, и чередуют

каждое добавление с равным объемом разведения испытуемого раствора, регу-

лируя степень разбавления таким образом, чтобы сокращение кишки, в случае его

наличия, было меньшим, чем сокращение, вызываемое «высокой дозой» гистами-

на. Определяют, является ли сокращение, в случае его наличия, воспроизводи-

мым и остаются ли реакции на «высокую» и «низкую» дозы гистамина неизмен-

ными. Вычисляют активность испытуемой субстанции, выраженную в ее эквива-

ленте на микрограмм основания гистамина, основываясь на определенном выше

разведении.

Определенное таким образом количество не должно превышать количест-

во, указанное в частной статье.

Если испытуемый раствор не вызывает сокращений, готовят свежий рас-

твор, добавляя количество гистамина, соответствующее максимально допустимо-

му в соответствии с требованиями частной статьи, и отмечают, соответствуют ли

сокращения, вызываемые препаратом с добавкой гистамина, количеству добав-

ленного гистамина. Если такого соответствия не наблюдается, или сокращение,

вызываемое испытуемой субстанцией, не воспроизводимо, или последующие ре-

акции на «высокие» и «низкие» дозы гистамина уменьшаются, то результаты ис-

пытания считают недостоверными и выполняют испытание на депрессорные ве-

щества (2.6.11).

Раствор А

Натрия хлорид

160,0 г

Калия хлорид

4,0 г

Кальция хлорид, безводный

2,0 г

Магния хлорид, безводный

1,0 г

Натрия гидрофосфат додекагидрат

0,10 г

Вода для инъекций R

До 1000 мл

Раствор В

Раствор А

50,0 мл

Атропина сульфат

0,5 мг

Натрия гидрокарбонат

1,0 г

Глюкозы моногидрат

0,5 г

Вода для инъекций R

До 1000 мл

Раствор В должен быть свежеприготовленным, и его используют в течение 24 ча-

сов.

2.6.11. ДЕПРЕССОРНЫЕ ВЕЩЕСТВА

Испытание проводят на кошке массой не менее 2 кг, анестезированной с

использованием хлоралозы или барбитурата, что позволяет поддерживать посто-

янное кровяное давление. Животное защищают от потери температуры тела и

поддерживают ее таким образом, чтобы ректальная температура оставалась в

физиологических пределах. В трахею вводят дыхательную трубку. В общую сон-

ную артерию вводят канюлю, наполненную гепаринизированным раствором хло-

рида натрия концентрацией 9 г/л, и присоединяют ее к устройству, обеспечиваю-

щему постоянную регистрацию кровяного давления. В бедренную вену вводят

другую канюлю, наполненную гепаринизированным раствором хлорида натрия

концентрацией 9 г/л, через которую может быть введен раствор гистамина и испы-

туемого образца. Определяют чувствительность животного к гистамину путем

внутривенного введения через равные промежутки времени раствора гистамина

R в дозах, соответствующих 0,1 мкг и 0,15 мкг основания гистамина на килограмм

массы тела. Введение меньшей дозы повторяют не менее трех раз. Вторую и по-

следующие инъекции вводят не ранее, чем через одну минуту после того, как кро-

вяное давление возвращается к уровню, наблюдавшемуся непосредственно пе-

ред предыдущей инъекцией. Животное используют в испытании только в случае,

если получено четко регистрируемое снижение кровяного давления, являющееся

постоянным для меньшей дозы, а большая доза вызывает более высокую реак-

цию. Испытуемое вещество растворяют в растворе хлорида натрия концентраци-

ей 9 г/л или в другом растворителе, указанном в частной статье и взятом в коли-

честве, достаточном для получения предписанной концентрации. Вводят внутри-

венно на килограмм массы тела 1,0 мл раствора гистамина R, затем две после-

довательные инъекции предписанного в частной статье количества испытуемого

раствора и, наконец, 1,0 мл раствора гистамина R. Вторую, третью и четвертую

инъекции вводят не ранее, чем через одну минуту после того, как кровяное дав-

ление возвращается к уровню, наблюдавшемуся непосредственно перед преды-

дущей инъекцией. Эти серии инъекций повторяют дважды и завершают испыта-

ние введением 1,5 мл раствора гистамина R на килограмм массы тела.

Если реакция на 1,5 мл раствора гистамина R на килограмм массы тела не

превышает реакцию на 1,0 мл того же раствора, результаты испытания признают

недостоверными. Испытуемый образец не выдерживает испытание, если среднее

значение реакции на его введение превышает среднее значение реакции на 1,0

мл раствора гистамина R на килограмм массы тела, или если любая из доз об-

разца вызвала более высокую депрессорную реакцию, чем завершающая доза

раствора гистамина. Лабораторное животное не следует использовать в другом

испытании на депрессорные вещества, если любая из испытанных доз вызывает

более выраженную депрессорную реакцию, чем завершающая доза раствора гис-

тамина, или если реакция на высокую дозу гистамина, введенную после испытуе-

мой субстанции, менее среднего значения реакции на введенные ранее меньшие

дозы гистамина.

# Испытание на содержание веществ гистаминоподобного действия может

быть проведено также в соответствии с нижеизложенным методом.

Испытание проводят на кошках обоего пола массой не менее 2 кг, анесте-

зированной с использованием хлоралозы, зооксилазина, рометара или барбиту-

рата, что позволяет поддерживать постоянное кровяное давление.

Для регистрации артериального давления в отпрепарированную сонную ар-

терию вставляют канюлю, заполненную раствором, предупреждающим свертыва-

ние крови (насыщенный раствор натрия гидрокарбоната, 25% раствор магния

сульфата, раствор гепарина, содержащий 50 ЕД в 1 мл и др.) и соединяют ее с

ртутным манометром. Запись давления производят на ленте кимографа.

Испытуемые растворы вводят внутривенно. Вначале проверяют чувстви-

тельность животного к гистамину. Для приготовления основного раствора гиста-

мина, содержащего 1 мг гистамина-основания в 1 мл воды, около 138,1 мг (точная

навеска) гистамина фосфата или около 82,8 мг (точная навеска) гистамина дигид-

рохлорида растворяю в 50 мл дистиллированной воды.

Раствор хранят не более 1 месяца в склянке из темного стекла с притертой

пробкой в защищенном от света месте при температуре от 4 до 10⁰С.

В качестве основного раствора гистамина можно использовать также 0,1%

раствор гистамина дигидрохлорида в ампулах, в 1 мл которого содержится 0,6038

мг гистамина-основания.

Из основного раствора гистамина непосредственно перед опытом путем по-

следовательных разведений в воде или в растворе натрия хлорида изотоническо-

го 0,9% для инъекций, в зависимости от растворителя для испытуемого препара-

та, указанного в соответствующей статье, готовят стандартные растворы, содер-

жащие 0,5 и 1 мкг/мл гистамина-основания.

Для проверки реакции животного на гистамин в вену последовательно вво-

дят указанные стандартные растворы с промежутками не менее 5 минут в дозах

0,1 и 0,2 мкг гистамина-основания в 0,2 мл на 1 кг массы. Скорость введения рас-

твора 0,1 мл в секунду. Животных, у которых при введении гистамина в дозе 0,2

мкг на 1 кг массы артериальное давление снизится менее чем на 20 мм рт. ст., из

опыта исключают.

После проверки чувствительности животного к гистамину уточняют величи-

ну гипотензивной реакции посредством повторного введения стандартного рас-

твора гистамина в дозе 0,1 мкг (0,2 мл раствора) на 1 кг массы со скоростью 0,1

мл в секунду. Введение гистамина с интервалом 5 минут повторяют несколько

раз, пока при двух последовательных введениях не будет получено одинаковое

снижение артериального давления, которое принимается за стандартное в дан-

ных условиях опыта.

Затем с интервалом не менее 5 минут животному вводят испытуемый рас-

твор лекарственного средства с той же скоростью, с которой вводили раствор гис-

тамина.

Растворитель и концентрация испытуемого раствора (тест-доза) указаны в

соответствующей фармакопейной статье.

Препарат считают выдержавшим испытание, если снижение артериального

давления после введения тест-дозы не превышает реакции на введение 0,1 мкг/кг

гистамина в стандартном растворе.

При испытании в одном опыте разных лекарственных средств необходимо

проводить дополнительное определение реакции животного на введение стан-

дартного раствора гистамина в дозе 0,1 мкг/кг. Отмеченная при этом величина ре-

акции принимается за стандартную для последующего испытания препарата.

В случае значительного уменьшения величины реакции по сравнению с на-

блюдаемой в начале опыта необходимо вновь проверить чувствительность жи-

вотного к действию гистамина в дозе 0,2 мкг/кг. Если снижение артериального

давления при этом будет не менее 20 мм рт. ст., испытание препаратов продол-

жают в соответствии с указанными выше требованиями.

2.6.12. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ НЕСТЕ-

РИЛЬНОЙ ПРОДУКЦИИ

(СУММАРНОЕ КОЛИЧЕСТВО

ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ АЭРОБОВ)

Испытания, описанные ниже, позволяют осуществлять количественное оп-

ределение мезофильных бактерий и грибов, способных расти в аэробных услови-

ях.

Испытания предназначены прежде всего для того, чтобы определить, соот-

ветствует ли субстанция требованиям микробиологической чистоты, приведенным

в частной статье. Если испытания проводят с этой целью, выполняют требования,

изложенные ниже, включая количество образцов, отбираемых для анализа, и ин-

терпретацию полученных результатов. Приведенные ниже методики могут быть

также использованы при испытании эффективности антимикробных консервантов

(5.1.3), в соответствии с Фармакопеей. Кроме того, их можно использовать при оп-

ределении качества сырья и готовых лекарственных средств в соответствии с ре-

комендациями, изложенными в статье «Микробиологическая чистота лекарст-

венных средств» (5.1.4). В этом случае, например, при определении производи-

телем качества сырья и/или готовых лекарственных средств или при проведении

проверки пригодности выбранной методики порядок проведения исследования, в

том числе количество образцов, отбираемых для анализа, и интерпретацию полу-

ченных результатов производитель устанавливает при согласовании с компетент-

ным уполномоченным органом.

Выполняют испытания в условиях, позволяющих избежать случайной кон-

таминации испытуемого продукта. Меры предосторожности, предпринимаемые

для предотвращения контаминации, не должны влиять ни на один из микроорга-

низмов, обнаруживаемых в ходе испытания. Если испытуемый продукт обладает

антимикробной активностью, она должна быть подходящим образом нейтрализо-

вана. Если для этой цели используют инактиваторы, должна быть продемонстри-

рована их эффективность и нетоксичность в отношении микроорганизмов.

# Если всвязи с природой лекарственного средства нельзя использовать

метод мембранной фильтрации, а все вышеперечисленные методы устранения

его антимикробного действия в отношении данного тест-штамма не эффективны,

этот вид испытания не проводят.

Суммарное количество жизнеспособных аэробов определяют методом

мембранной фильтрации, чашечным методом подсчета или методом последова-

тельных разведений, в соответствии с указаниями в частной статье.

# Допускается использование автоматизированных методов испытаний.

Метод наиболее вероятного числа предназначен для использования в тех

случаях, когда другие методы использовать невозможно. При выборе метода ис-

пытания необходимо учитывать природу испытуемого лекарственного средства и

ожидаемое количество микроорганизмов. Необходимо надлежащим образом про-

вести проверку пригодности выбранной методики.

Если испытание проводится в соответствии с разделом 5.1.3 или 5.1.4, сле-

дует использовать методы глубинного, поверхностного, двухслойного высева на

чашки Петри или метод мембранной фильтрации.

ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦА

Порядок отбора проб. Отбор проб лекарственного средства необходимо

проводить в строго определенном порядке. Порядок отбора проб зависит от объ-

ема серии, степени опасности для здоровья, связанной с микробным загрязнени-

ем лекарственного средства выше допустимого уровня, характеристиками лекар-

ственного средства и ожидаемым уровнем микробного загрязнения. Если нет дру-

гих указаний в частной статье, для испытания используют образцы по 10 г или 10

мл субстанции или лекарственного средства, отобранные с вышеупомянутыми

мерами предосторожности. Образец (образцы) отбирают случайным образом из

массы испытуемого материала или из контейнеров с лекарственным средством.

Для отбора средней пробы, при необходимости, смешивают содержимое доста-

точного количества контейнеров для получения образца необходимой массы или

объема, в зависимости от природы испытуемой субстанции или препарата.

Примером плана отбора проб является трехуровневый порядок пробоотбо-

ра, используемый для лекарственных средств с большой вероятностью неравно-

мерного распределения микроорганизмов. Этот план предусматривает отбор от

каждой серии пяти образцов, каждый из которых испытывают отдельно. При этом

допускают, что в результате исследования могут быть выявлены образцы, харак-

теризующиеся тремя уровнями микробного загрязнения: (i) - соответствующие

образцы, содержащие меньше m колониеобразующих единиц (КОЕ) в грамме или

миллилитре, где m - предельно допустимое количество микроорганизмов, уста-

новленное соответствующей частной статьей; (ii) - граничные образцы, содержа-

щие в грамме или миллилитре больше m, но меньше 10m КОЕ; (iii) - бракованные

образцы, содержащие больше 10m КОЕ в грамме или миллилитре.

Водорастворимые продукты. 10 г или 10 мл испытуемого продукта рас-

творяют в буферизированном растворе хлорида натрия и пептона рН 7,0 или дру-

гой подходящей жидкости. Обычно готовят разведение в соотношении 1:10. Одна-

ко характеристики некоторых продуктов или требуемая чувствительность могут

обусловить необходимость использования других соотношений. Если известно,

что продукт обладает антимикробной активностью, к растворителю может быть

добавлен инактивирующий агент. При необходимости доводят значение рН при-

близительно до 7 и готовят серийные десятикратные разведения с использовани-

ем того же растворителя.

Нерастворимые в воде продукты, не относящиеся к жирам. 10 г или 10

мл испытуемого продукта суспендируют в буферизированом растворе хлорида

натрия и пептона рН 7,0 или в другой подходящей жидкости. Обычно готовят раз-

ведение в соотношении 1:10, но характеристики некоторых продуктов могут обу-

словить необходимость использования больших объемов. Для облегчения сус-

пендирования плохо смачиваемых субстанций может быть добавлен подходящий

поверхностно-активный компонент, например, полисорбат 80 в количестве 1 г/л.

Если известно, что продукт обладает антимикробной активностью, к растворителю

может быть добавлен инактивирующий агент. При необходимости доводят значе-

ние рН приблизительно до 7 и готовят серийные десятикратные разведения с ис-

пользованием того же растворителя.

Жиры. 10 г или 10 мл испытуемого продукта гомогенизируют с полисорба-

том 80 или с другим подходящим стерильным поверхностно-активным агентом,

взятым в количестве, не превышающем половины массы испытуемого образца, и

при необходимости нагретым до температуры, не превышающей 40⁰С, в исключи-

тельных случаях - 45⁰С. Осторожно перемешивают, при необходимости поддер-

живая температуру с помощью водяной бани или инкубатора. Добавляют предва-

рительно нагретый буферизированный раствор хлорида натрия и пептона рН 7,0 в

количестве, достаточном для получения разведения исходного продукта в соот-

ношении 1:10. Осторожно перемешивают, поддерживая температуру в течение

минимального промежутка времени, необходимого для образования эмульсии, и в

любом случае не превышающего 30 минут. Дальнейшие серийные десятикратные

разведения могут быть приготовлены с использованием буферизированного рас-

твора хлорида натрия и пептона рН 7,0, содержащего стерильный полисорбат 80

или другой стерильный поверхностно-активный агент в подходящей концентра-

ции.

Трансдермальные пластыри. Десять пластырей освобождают от защит-

ного покрытия с помощью стерильного пинцета и помещают в стерильные пласт-

массовые или стеклянные лотки клейкой поверхностью вверх. При необходимости

клейкую поверхность накрывают стерильной марлей или сеткой из полимерного

моноволокна типа тканого фильтра и переносят 10 пластырей в емкость, вме-

щающую не менее 500 мл буферизированного раствора хлорида натрия и пепто-

на рН 7,0, содержащего подходящий инактиватор, например, полисорбат 80 или

лецитин. Энергично встряхивают не менее 30 минут (образец А). Другую группу из

10 пластырей готовят аналогичным образом и помещают в емкость, содержащую

не менее 500 мл жидкой питательной среды D, и энергично встряхивают не ме-

нее 30 минут (образец B).

ИСПЫТАНИЕ ОБРАЗЦА

Мембранная фильтрация. Используют мембранные фильтры с номиналь-

ным размером пор, не превышающим 0,45 мкм, с установленной способностью к

удерживанию бактерий. Тип фильтрующего материала выбирают таким образом,

чтобы компоненты испытуемого образца не влияли на эффективность удержива-

ния бактерий. Например, фильтры на основе нитрата целлюлозы используют для

водных, масляных и разбавленных спиртовых растворов, а фильтры на основе

ацетата целлюлозы - в частности, для растворов с высоким содержанием спирта.

Конструкция аппарата для фильтрования должна обеспечивать перенос фильтра

на питательную среду.

Подходящее количество образца, приготовленного в соответствии с указа-

ниями раздела «Подготовка образца» (предпочтительно, соответствующее 1 г

продукта, или меньшему количеству, если ожидается наличие большого числа ко-

лониеобразующих единиц), наносят на каждый из двух мембранных фильтров и

немедленно фильтруют. Каждый фильтр промывают тремя порциями, приблизи-

тельно по 100 мл каждая, подходящей жидкости, например, буферизированного

раствора хлорида натрия и пептона рН 7,0. К этому раствору могут быть добавле-

ны поверхностно активные агенты, например, полисорбат-80, или инактиваторы

антимикробных компонентов. Допускается проведение менее трех промывок, при

условии проведения проверки пригодности такой методики. Один из мембранных

фильтров, предназначенный преимущественно для подсчета бактерий, переносят

на поверхность чашки с подходящей агаризованной средой, например, агаризо-

ванной средой В # или средой №1, а другой, предназначенный преимущественно

для подсчета грибов, - на поверхность чашки с подходящей агаризованной сре-

дой, например, агаризованной средой С # или средой №2. Чашку с агаризованной

средой В (# средой №1) инкубируют при температуре от 30⁰С до35⁰С, а чашку с

агаризованной средой С (# средой №2) - при температуре от 20⁰С до 25⁰С в тече-

ние 5 дней, если за более короткое время не могут быть получены достоверные

результаты. Выбирают чашки с максимальным количеством колоний менее 100 и

вычисляют количество колониеобразующих единиц в грамме или миллилитре ис-

пытуемого продукта.

При испытании трансдермальных пластырей 50 мл образца А фильтруют по

отдельности через каждый из двух стерильных мембранных фильтров. Одну мем-

брану помещают на агаризованную среду В # или среду №1 для определения об-

щего числа аэробов, а другую мембрану - на агаризованную среду С # или среду

№2 для подсчета грибов.

МЕТОДЫ ЧАШЕЧНОГО ПОДСЧЕТА

А. Метод глубинного посева. Используют чашки Петри диаметром 9 см. В

каждую чашку помещают 1 мл образца, подготовленного в соответствии с указа-

ниями раздела «Подготовка образца», и 15-20 мл расплавленной агаризованной

среды, подходящей для культивирования бактерий (например, среды В или среды

№1) или 15-20 мл расплавленной агаризованной среды, подходящей для культи-

вирования грибов (например, среды С или среды №2), при температуре, не пре-

вышающей 45⁰С. Если используются чашки Петри большего размера, то соответ-

ственно увеличивают количество агара. Готовят для каждой среды не менее двух

чашек с каждым из разведений. Чашки инкубируют при температуре от 30⁰С до

35⁰С (от 20⁰С до 25⁰С для грибов) в течение 5 дней, если за более короткое время

не могут быть получены достоверные результаты. Выбирают чашки, соответст-

вующие одному разведению, на которых максимальное число колоний менее 300

(100 для грибов). Вычисляют среднее арифметическое значение числа колоний и

определяют количество колониеобразующих единиц в грамме или миллилитре.

В. Метод поверхностного посева. Используют чашки Петри диаметром 9

см. В каждую чашку помещают 15-20 мл расплавленной агаризованной среды,

подходящей для культивирования бактерий (например, среды В или среды №1)

или 15-20 мл расплавленной агаризованной среды, подходящей для культивиро-

вания грибов (например, среды С или среды №2), при температуре около 45⁰С и

дают среде застыть. Если используются чашки Петри большего размера, то соот-

ветственно увеличивают количество агара. Чашки сушат, например, в условиях

ламинарного потока воздуха или в инкубаторе. Отмеренный объем образца, под-

готовленного в соответствии с указаниями раздела «Подготовка образца», со-

ставляющий не менее 0,1 мл, распределяют по поверхности среды. Готовят для

каждой среды не менее двух чашек с каждым из разведений. Инкубацию и под-

счет количества колониеобразующих единиц производят в соответствии с выше-

приведенными указаниями для метода глубинного высевания.

# Двухслойный агаровый метод. 1 мл подготовленного продукта вносят в

две пробирки с 4 мл расплавленной и охлажденной до 45⁰С среды №1 (для опре-

деления количества бактерий). Содержимое пробирки быстро перемешивают, пе-

реносят в чашку Петри, содержащую 15-20 мл застывшей питательной среды №1,

и равномерно распределяют по поверхности. Для количественного определения

грибов поступают аналогичным способом, используя среду №2. Инкубирование

посевов, подсчет колоний бактерий и грибов выполняют, как описано выше.

МЕТОД НАИБОЛЕЕ ВЕРОЯТНОГО ЧИСЛА

Метод наиболее вероятного числа (НВЧ) уступает по точности методам

мембранной фильтрации и чашечного подсчета. Особенно недостоверными яв-

ляются результаты подсчета плесневых грибов. Поэтому метод НВЧ следует при-

менять лишь для подсчета бактерий в тех случаях, когда другие методы недос-

тупны. Если применение данного метода обосновано, определение проводят в

соответствии с нижеследующими указаниями.

Готовят ряд не менее, чем из трех последовательных десятикратных раз-

ведений продукта, в соответствии с указаниями раздела «Подготовка образца».

Для каждого уровня разведения используют три аликвоты по 1 г или 1 мл для ино-

куляции трех пробирок, содержащих от 9 до 10 мл подходящей жидкой питатель-

ной среды (например, питательной среды А). При необходимости, к среде могут

быть добавлены поверхностно-активные агенты (например, полисорбат 80) или

инактиваторы антимикробных компонентов. Таким образом, для трех уровней

разведения готовят для инокуляции девять пробирок. Все пробирки инкубируют

при температуре от 30⁰С до 35⁰С в течение 5 дней. Для каждого уровня разведе-

ния записывают количество пробирок, в которых наблюдается микробный рост.

Если природа испытуемого продукта приводит к получению неопределенных или

трудно оцениваемых результатов, производят пересев на ту же жидкую среду или

на подходящую агаризованную среду (например, агаризованную среду В), инкуби-

руют при той же температуре от 18 до 24 часов и для подсчета используют полу-

ченные результаты. Наиболее вероятное количество микроорганизмов в грамме

или миллилитре испытуемого продукта определяют по Таблице 2.6.12.-1.

Таблица 2.6.12.-1

Наиболее вероятное число микроорганизмов

Три пробирки для каждого уровня разведения

Количество пробирок с на-

НВЧ

Категория*

Пределы 95% до-

блюдаемым ростом микроор-

в 1 г

верительного ин-

ганизмов

тервала

0,1 г

0,01 г

0,001 г

< 3

< 1

129

180

210

280

390

150

510

210

640

240

100

1400

460

200

2400

1100

300

4800

> 1100

* Категория 1: Нормальные результаты, получаемые в 95% случаев.

Категория 2: Менее вероятные результаты, получаемые только в 4% случаев.

Их не следует использовать при принятии важных решений. Результаты, еще ме-

нее вероятные, чем относящиеся к категории 2, не приводятся и всегда являются

неприемлемыми.

РОСТОВЫЕ СВОЙСТВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И ПРОВЕРКА ПРИГОДНОСТИ

МЕТОДИКИ ИСПЫТАНИЯ

В контейнерах с подходящей жидкой питательной средой (например, с пи-

тательным бульоном А) выращивают по отдельности бактериальные тест-

культуры при температуре от 30⁰С до 35⁰С в течение 18-24 часов. На подходящих

агаризованных средах (например, на среде С без антибиотиков # или среде №2)

выращивают по отдельности тест-культуры грибов. Candida albicans, инкубируют

при температуре от 20⁰С до 25⁰С в течение 48 часов, а Aspergillus niger - при тем-

пературе от 20⁰С до 25⁰С в течение 7 дней.

Staphylococcus aureus

например, АТСС 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83)

# или

ATCC 6538 P

Escherichia coli

например,

ATCC 8739 (NCIMB 8545, CIP 53.126)

# или

АТСС 25922

Bacillus subtilis

например,

ATCC 6633 (NCIMB 8054, CIP 52.62)

Candida albicans

например,

ATCC 10231 (NCPF 3179, IP 48.72),

# или

АТСС 885-653

Aspergillus niger

например,

ATCC 16404 (IMI 149007, IP 1431.83)

# или

ВКМ F-1119

Порции каждой из культур разбавляют буферизированным раствором хло-

рида натрия и пептона рН 7,0, получая тест-суспензии, содержащие около 100

жизнеспособных микроорганизмов в миллилитре. Используют суспензию каждого

из микроорганизмов по отдельности в качестве контроля методов подсчета в при-

сутствии и отсутствии испытуемого продукта. При проверке метода мембранной

фильтрации или чашечного подсчета результат подсчета для каждого из тест-

штаммов не должен отличаться более, чем в пять раз, от значения, вычисленного

для посевного материала. При проверке метода наиболее вероятного числа зна-

чение, вычисленное для посевного материала, должно находиться в пределах

95% доверительного интервала для полученных результатов. Для проверки сте-

рильности среды и растворителя, а также контроля условий асептики при прове-

дении испытания, выполняют определение тем же методом с использованием в

качестве испытуемого препарата стерильного буферизированного раствора хло-

рида натрия и пептона рН 7,0. Роста микроорганизмов наблюдаться не должно.

# Тест-культуры бактерий можно выращивать на скошенной в пробирках

плотной питательной среде подходящего состава, например, среде №1. Для по-

лучения тест-суспензии выращенные в пробирках культуры смывают раствором

натрия хлорида 0,9% и разводят этим же раствором до нужного содержания кле-

ток в миллилитре.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

За общее число бактерий принимают среднее количество колониеобра-

зующих единиц, обнаруженных на агаризованной среде В # или среде №1. За об-

щее число грибов принимают среднее количество колониеобразующих единиц,

обнаруженных на агаризованной среде С # или среде №2. Суммарное количество

жизнеспособных аэробов представляет собой сумму числа бактерий и числа гри-

бов, определенных выше. Если имеются доказательства роста на обеих средах

микроорганизмов одинаковых типов, могут быть внесены соответствующие по-

правки. Если подсчет выполнен методом наиболее вероятного числа, то вычис-

ленное значение представляет собой количество бактерий.

При использовании трехуровневого плана отбора проб поступают следую-

щим образом.

Определяют общее число микроорганизмов отдельно для каждого из пяти

образцов. Считают, что субстанция или готовое лекарственное средство удовле-

творяет требованиям по микробиологической чистоте, если выполняются сле-

дующие условия:

(i) - общее число микроорганизмов, определенное для каждого испытуемо-

го образца, не превышает допустимый уровень больше чем в 10 раз (отсутствуют

бракованные образцы),

(ii)

- не более чем для двух испытуемых образцов общее число микроорга-

низмов, определенное в результате испытания, находится в интервале между до-

пустимым уровнем и десятикратным значением (то есть не более двух предель-

ных образцов).

Использование трехуровневого плана отбора проб должно быть предусмот-

рено в частной статье.

Если в частной статье предписано максимальное значение, оно должно ин-

терпретироваться следующим образом:

10² микроорганизмов - максимально допустимое значение: 5х10²;

10³ микроорганизмов - максимально допустимое значение: 5х10³; и т.д.

# Если при испытании образца методом мембранной фильтрации при раз-

ведении лекарственного средства 1:10 не выявлен рост микроорганизмов на мем-

бранных фильтрах, результаты выражают следующим образом: «В 1 г (мл) лекар-

ственного средства (сырья) бактерии (грибы) не выявлены».

# В том случае, если при испытании образца методом высева на чашки при

разведении лекарственного средства 1:10 не выявлен рост микроорганизмов на

чашках, результаты отмечают следующим образом: «В 1 г (мл) лекарственного

средства (сырья) менее 10 бактерий».

# Если в частной статье приведены допустимые пределы содержания мик-

роорганизмов, результаты интерпретируют следующим образом:

10² микроорганизмов - максимально допустимое значение: 1х10²;

10³ микроорганизмов - максимально допустимое значение: 1х10³; и т.д.

Рекомендуемые растворы и питательные среды описаны в общем разделе 2.6.13.

2.6.13. МИКРОБИЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ НЕСТЕ-

РИЛЬНОЙ ПРОДУКЦИИ (ИСПЫТАНИЯ НА НАЛИЧИЕ СПЕ-

ЦИФИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ)

Методики, изложенные в данной статье, допускают использование селек-

тивных питательных сред, которые не позволяют выделять микроорганизмы с

сублетальными повреждениями. Так как для обеспечения качества лекарственно-

го средства необходимо выявлять микроорганизмы с сублетальными поврежде-

ниями, следует предусмотреть проведение процедуры восстановления их жизне-

способности перед использованием селективных питательных сред.

Если испытуемый продукт обладает антимикробной активностью, она

должна быть соответствующим способом нейтрализована.

# Допускается использование автоматизированных методов испытаний, ес-

ли в результате проверки пригодности было доказано, что они имеют результаты,

идентичные описанным ниже методам. Для биохимической идентификации мик-

роорганизмов могут быть использованы готовые тест-системы.

Энтеробактерии и некоторые другие грамотрицательные бактерии

Испытание предназначено для определения бактерий семейства Enterobac-

teriaceae, но также позволяет определять и другие типы микроорганизмов (напри-

мер, Aeromonas, Pseudomonas).

Определение наличия бактерий. Готовят испытуемый продукт в соответст-

вии с указаниями, приведенными в разделе 2.6.12, но с использованием пита-

тельного бульона D вместо буферизированного раствора хлорида натрия и пеп-

тона рН 7,0, гомогенизируют и инкубируют при 35-37⁰С в течение промежутка

времени, достаточного для оживления бактерий и недостаточного для иницииро-

вания их размножения (обычно 2 часа, но не более 5 часов). Контейнер встряхи-

вают, переносят количество содержимого [гомогенат (а)], соответствующее одно-

му грамму или одному миллилитру продукта, в 100 мл обогащенного питательного

бульона Е и инкубируют при 35-37⁰С в течение 18-48 часов. Пересевают на чашки

с агаризованной средой F. Инкубируют при 35-37⁰С в течение 18-24 часов. Про-

дукт выдерживает испытание, если ни на одной из чашек не наблюдается рост

грамотрицательных бактерий.

# 10 мл испытуемого образца, подготовленного, как описано в разделе

2.6.12, но с использованием среды №11 вместо буферного раствора с натрия

хлоридом и пептоном рН 7,0, вносят в 100 мл питательной среды № 3, перемеши-

вают и инкубируют при температуре от 30 до 35°С в течение 24 - 48 ч. При нали-

чии роста делают пересев на среду № 4 в чашке Петри. Посевы инкубируют при

температуре 30 - 35°С в течение 24 - 48 ч. Наличие роста малиновых с металли-

ческим блеском или без него; розовых, бесцветных, блестящих, выпуклых колоний

грамотрицательных палочек указывает на возможное загрязнение лекарственного

средства бактериями сем. Enterobacteriaceae и некоторыми другими грамотрица-

тельными бактериями. Выросшие колонии пересевают, каждую отдельно, со сре-

ды № 4 на скошенную в пробирках среду № 1 и выращивают при температуре 30 -

35°С течение 18 - 20 ч. Из каждой пробирки с чистой культурой делают пересевы

на среды № 6 и № 7.

После посева в половину пробирок со средой № 6 вносят по 0,5 мл сте-

рильного вазелинового масла. Все посевы инкубируют при температуре 30 - 35°С

в течение 18 - 20 ч. Ферментацию глюкозы устанавливают по изменению цвета

среды № 6 из красного в желтый в пробирках с маслом и без него. О наличии нит-

ритов в среде № 7 судят по появлению красного окрашивания при внесении в

среду реактива Грисса. Параллельно исследуют чистые культуры на наличие

фермента цитохромоксидазы. Если в образце обнаружены грамотрицательные

неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию,

ферментируют глюкозу с образованием кислоты (или кислоты и газа) и восста-

навливают нитраты в нитриты, лекарственное средство контаминировано бакте-

риями семейства Enterobacteriaceae.

# Тест на цитохромоксидазу. Полоску фильтровальной бумаги смачивают

реактивом и наносят стеклянной палочкой суточную чистую культуру исследуемых

бактерий со среды №1. Синее окрашивание, появляющееся через 2-5 мин, свиде-

тельствует о положительной оксидазной реакции.

Количественная оценка. Инокулируют подходящие количества питательно-

го бульона Е гомогенатом (а) и/или его разбавлениями, содержащими, соответст-

венно, 0,1г, 0,01 г и 0,001 г (или 0,1 мл, 0,01 мл и 0,001 мл) испытуемого продукта.

Инкубируют при температуре 35-37⁰С в течение 24-48 часов. Каждую из культур

пересевают на чашку с агаризованной средой F для достижения селективного

разделения. Инкубируют при температуре 35-37⁰С в течение 18-24 часов. Рост

хорошо развитых колоний грамотрицательных бактерий, обычно красной или

красноватой окраски, представляет собой положительный результат. Отмечают

наименьшее количество продукта, дающее положительный результат, и наи-

большее количество, дающее отрицательный результат. Вероятное количество

бактерий определяют по таблице 2.6.13.-1.

# Инокулируют подходящие количества среды №3 гомогенатом и /или его

разбавлениями, содержащими, соответственно, 0,1 г, 0,01 г и 0,001 г (или 0,1 мл,

0,01 мл и 0,001 мл) испытуемого продукта. Инкубируют при температуре 30 - 35⁰С

в течение 24 - 48 ч. При наличии роста делают пересев на плотную среду №4

(агар Эндо) и инкубируют при той же температуре в течение 18-24 ч. В случае по-

явления характерных для Enterobacteriaceae колоний грамотрицательных палочек

определяют количество энтеробактерий в 1 г или в 1 мл образца по Таблице

2.6.13.-1.

Таблица 2.6.13.-1.

Результаты для каждого количества продукта

Вероятное количество

0,1 г или 0,1 мл

0,01 г или 0,01 мл

0,001 г или 0,001

бактерий в грамме

мл

продукта

Более 10³

Менее 10³, но более

10²

Менее 10², но более

Менее 10

При испытании трансдермальных пластырей 50 мл образца В пропускают

через стерильный мембранный фильтр, как описано в разделе 2.6.12., помещают

мембрану в 100 мл обогащенной питательной среды Е и инкубируют при темпера-

туре 35-37 ⁰С 18-24 часа. После окончания инкубации делают пересев на по-

верхность агаризованной среды F для выявления энтеробактерий и других гра-

мотрицательных микроорганизмов.

Escherichia coli

Испытуемый продукт готовят в соответствии с указаниями общего раздела

2.6.12. 10 мл образца или количество, представляющее 1 г или 1 мл продукта, по-

мещают в 100 мл питательного бульона А, гомогенизируют и инкубируют при 35-

37⁰С в течение 18-48 часов. Контейнер встряхивают, переносят 1 мл содержимого

в 100 мл питательной среды G и инкубируют при 43-45⁰С в течение 18-24 часов.

Пересевают на чашки с агаризованной средой H и инкубируют при 35-37⁰С в те-

чение 18-72 часов. Рост красных, немукоидных колоний грамотрицательных пало-

чек указывает на возможное присутствие E.coli. Для подтверждения проводят со-

ответствующие биохимические тесты, например, по образованию индола. Продукт

выдерживает испытание, если подобные колонии не обнаруживаются или под-

тверждающие биохимические реакции дают отрицательный результат.

# 10 мл образца в питательной среде №11 или количество, представляю-

щее 1 г или 1 мл продукта, подготовленное и инкубированное как описано в раз-

деле «Энтеробактерии и некоторые другие грамотрицательные бактерии. Количе-

ственная оценка», помещают в 100 мл питательной среды №3 и инкубируют при

температуре 30-35⁰С в течение 18-24 часов Пересевают на среду № 4 и инкуби-

руют при температуре 30 - 35°С в течение 18-24 часов. На среде № 4 E.coli обра-

зуют, как правило, характерные малиновые колонии с металлическим блеском

или без него, диаметром 2-4 мм. Подозрительные на принадлежность к E.coli ко-

лонии микроскопируют. При обнаружении грамотрицательных палочек отсевают

на скошенную в пробирках плотную среду №1 и инкубируют при температуре 30 -

35°С в течение 18-24 часов. Из каждой пробирки с чистой культурой делают пере-

севы на среды №14 (агар Симмонса) и №15 (бульон Хоттингера), а также исполь-

зуют для теста на цитохромоксидазу. Через 18-24 часа инкубации при 30 - 35°С

отмечают бактериальный рост или его отсутствие на средах № 14 и № 15. Утили-

зацию цитрата устанавливают по изменению цвета среды №14 из зеленого в си-

ний. Наличие индола определяют по появлению красного кольца на поверхности

среды № 15 при добавлении реактива Ковача или Эрлиха.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие па-

лочки, не обладающие ферментом цитохромоксидазой, не утилизирующие цитрат

натрия и образующие индол, считают, что лекарственное средство контаминиро-

вано E. coli.

Salmonella

Испытуемый продукт готовят в соответствии с указаниями общего раздела

2.6.12, но с использованием питательного бульона А вместо буферизированного

раствора хлорида натрия и пептона рН 7,0, гомогенизируют и инкубируют при 35-

37⁰С в течение 18-24 часов. 1 мл обогащенной культуры переносят в 10 мл пита-

тельного бульона I и инкубируют при 41-43⁰С в течение 18-24 часов. Пересевают

не менее чем на две различные агаризованные среды, выбранные из агаризован-

ных сред J, К и L. Инкубируют при 35-37⁰С в течение 18-72 часов. На возможное

присутствие сальмонелл указывает рост культур, имеющих следующие характер-

ные признаки:

Агаризованная среда J: хорошо развитые бесцветные колонии.

Агаризованная среда К: хорошо развитые красные или красные с черным цен-

тром колонии.

Агаризованная среда L: маленькие прозрачные бесцветные или обладающие

окраской от розовой до белой колонии, часто окружен-

ные зоной розового или красного цвета.

Несколько подозрительных колоний переносят по отдельности на агаризо-

ванную среду М в пробирках с использованием поверхностной и глубинной иноку-

ляции. Присутствие сальмонелл предварительно подтверждается, если имеется

изменение окраски из красной в желтую и, как правило, газообразование в случае

глубинной, но не поверхностной инокуляции. При этом в агаре может образовы-

ваться сероводород. Окончательный вывод делают на основе соответствующих

биохимических и серологических испытаний. Продукт выдерживает испытание,

если культура описанного типа не обнаруживается или подтверждающие биохи-

мические и серологические испытания дают отрицательный результат.

# 1 мл обогащенной культуры на среде № 3 вносят в пробирку с 10 мл сре-

ды № 12 (селенитовая среда) и инкубируют при 30 - 35°С в течение 16-18 часов.

Делают пересев петлей на среду № 5 (висмут-сульфит агар) и инкубируют при

температуре 30 - 35°С в течение 24 - 48 часов. На среде № 5 Salmonella образует,

как правило, типичные черные колонии с характерным металлическим блеском,

при этом участок среды под колонией прокрашивается в черный цвет. Подозри-

тельные на принадлежность к Salmonella колонии микроскопируют и, при обнару-

жении в мазках грамотрицательных палочек, отсевают на среду №13 (трехсахар-

ный агар с солями железа), нанося небольшое количество культуры петлей сна-

чала на скошенную часть агара, а потом уколом в столбик. Параллельно ставят

тест на цитохромоксидазу, используя чистую культуру с плотной среды № 1. Че-

рез 18-24 часа инкубации при 30 - 35⁰С отмечают изменение цвета среды из

красного в желтый только в столбике питательной среды. Почернение среды сви-

детельствует об образовании сероводорода.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие па-

лочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не ферментирующие саха-

розу и лактозу и выделяющие сероводород, считают, что лекарственное средство

контаминировано Salmonella.

Pseudomonas aeruginosa

Испытуемый продукт готовят в соответствии с указаниями общего раздела

2.6.12. 10 мл образца или количество, соответствующее 1 г или 1 мл продукта,

помещают в 100 мл питательного бульона А, гомогенизируют и инкубируют при

35-37⁰С в течение 18-48 часов. Пересевают на чашки с агаризованной средой N и

инкубируют при 35-37⁰С в течение 18-72 часов. Если рост микроорганизмов не на-

блюдается, то продукт выдерживает испытание. Если имеется рост колоний гра-

мотрицательных палочек, выполняют пересев некоторого количества различаю-

щихся по морфологическим признакам изолированных колоний на питательный

бульон А и инкубируют при 41-43⁰С в течение 18-24 часов. Продукт выдерживает

испытание, если при 41-43⁰С роста не происходит.

При испытании трансдермальных пластырей 50 мл образца А пропускают

через стерильный мембранный фильтр в соответствии с указаниями общего раз-

дела 2.6.12, помещают мембранный фильтр в 100 мл жидкой среды А и инкуби-

руют при температуре 35-37⁰С в течение 18-48 часов. После окончания периода

инкубации пересевают на поверхность агаризованной среды N.

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год) - часть 16