ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год)

2.6. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ

2.6.1. СТЕРИЛЬНОСТЬ

Испытание применяется для субстанций, лекарственных средств или

изделий, которые, в соответствии с Фармакопеей, должны быть стерильны.

Однако, удовлетворительный результат показывает лишь то, что в условиях

испытания в тестируемом образце не обнаружено микроорганизмов. Руково-

дство по использованию испытания на стерильность приводится в конце раз-

дела.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРОТИВ МИКРОБНОЙ КОНТАМИНАЦИИ

Испытание на стерильность выполняют в асептических условиях. Для дос-

тижения таких условий обстановка, в которой выполняется испытание, должна

быть адаптирована к способу его проведения. Меры предосторожности, прини-

маемые против контаминации, не должны влиять ни на один из микроорганизмов,

обнаруживаемых в ходе испытания. Рабочие условия, в которых выполняется ис-

пытание, регулярно контролируются путем отбора проб воздуха и поверхностей

рабочей зоны, а также проведением соответствующих контрольных испытаний.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И ТЕМПЕРАТУРЫ ИНКУБАЦИИ

Среды для проведения испытаний могут быть приготовлены в соответ-

ствии с приведенными ниже указаниями; также могут использоваться эквива-

лентные коммерчески доступные среды, при условии, что они выдерживают

испытания на питательные свойства.

Показано, что следующие питательные среды являются подходящими для

испытания на стерильность. Жидкая тиогликолевая среда предназначена в пер-

вую очередь для культивирования анаэробных бактерий, но также обнаруживает и

аэробные бактерии. Среда на основе гидролизатов соевых бобов и казеина # и

среда Сабуро подходит для культивирования как грибов, так и аэробных бактерий.

Могут быть использованы также и другие среды, при условии их соответст-

вия требованиям испытаний на пригодность.

Жидкая тиогликолевая среда.

L-цистин

0,5 г

Гранулированный агар (избыточное содержание вла-

0,75 г

ги составляет не более 15%)

Натрия хлорид

2,5 г

Глюкозы моногидрат / Безводная глюкоза

5,5 / 5,0 г

Дрожжевой экстракт (водорастворимый)

5,0 г

Панкреатический гидролизат казеина

15,0 г

Натрия тиогликолят или

0,5 г

Тиогликолевая кислота

0,3 мл

Раствор резазурина натриевой соли (1 г/л) свежепри-

1,0 мл

готовленный

Вода

1000 мл

рН среды после стерилизации 7,1±0,2

Смешивают L-цистин, агар, натрия хлорид, глюкозу, водорастворимый

дрожжевой экстракт и панкреатический гидролизат казеина с 1000 мл воды и на-

гревают до получения раствора. Натрия тиогликолят или тиогликолевую кислоту

растворяют в полученной смеси и, при необходимости, добавляют 1 М раствор

гидроксида натрия так, чтобы после стерилизации значение рН раствора состав-

ляло 7,1±0,2. Если необходима фильтрация, раствор снова нагревают, не доводя

до кипения, и фильтруют в горячем виде через увлажненную фильтровальную

бумагу. Добавляют раствор резазурина натриевой соли, перемешивают и поме-

щают среду в подходящие сосуды, которые обеспечивают такое отношение по-

верхности к глубине среды, чтобы изменению окраски, указывающему на погло-

щение кислорода в конце периода инкубирования, был подвержен только верхний

слой, составляющий не более трети от общего объема среды. Стерилизуют с ис-

пользованием процесса с подтвержденной эффективностью. Среду хранят при

температуре 2-25⁰С в стерильном герметичном контейнере. Если верхний слой,

составляющий не более трети от общего объема среды, приобретает розовую ок-

раску, среду можно однократно регенерировать путем нагрева контейнеров на во-

дяной бане или в струе пара до исчезновения розовой окраски с последующим

быстрым охлаждением; при этом должны быть приняты меры предосторожности

против попадания в контейнер нестерильного воздуха. Среду не используют по

истечении валидированных сроков хранения.

Жидкую тиогликолевую среду инкубируют при температуре 30-35⁰С.

Среда на основе гидролизатов соевых бобов и казеина

Панкреатический гидролизат казеина

17,0 г

Папаиновый гидролизат сои

3,0 г

Натрия хлорид

5,0 г

Калия гидрофосфат

2,5 г

Глюкозы моногидрат / Безводная глюкоза

2,5 г / 2,3 г

Вода

1000 мл

рН среды после стерилизации 7,3±0,2

Твердые компоненты растворяют в воде, слегка нагревая для получения

раствора. Раствор охлаждают до комнатной температуры. При необходимости

добавляют 1 М раствор гидроксида натрия так, чтобы после стерилизации значе-

ние рН раствора составляло 7,3±0,2. При необходимости устранения мутности

раствор фильтруют, разливают по подходящим сосудам и стерилизуют с исполь-

зованием процесса с подтвержденной эффективностью. Если среда не подлежит

немедленному использованию, ее хранят при температуре 2-25⁰С в стерильном

герметичном контейнере. Среду не используют по истечении валидированных

сроков хранения.

Среду на основе гидролизатов соевых бобов и казеина инкубируют при

температуре 20-25⁰С.

# Допускается использование среды Сабуро.

Пептон ферментативный

10,0 г

Глюкоза

40,0 г

Вода

до 1000 мл

рН после стерилизации 5,6 ± 0,2

Среду Сабуро инкубируют при температуре 20-25⁰С.

Используемая среда должна выдерживать следующие испытания, прово-

димые для каждой партии до или одновременно с испытанием тестируемой про-

дукции.

Стерильность. Порции среды инкубируют в течение 14 дней. Роста микро-

организмов наблюдаться не должно.

Питательные свойства в отношении аэробов, анаэробов и грибов.

Проверке подвергают каждую партию готовой среды, и каждую партию среды,

приготовленной из обезвоженных составов или из ингредиентов. Подходящие

штаммы микроорганизмов приведены в Таблице 2.6.1.-1.

Порции жидкой тиогликолевой среды засевают небольшим количеством (не

более 100 колониеобразующих единиц) следующих микроорганизмов: Clostridium

sporogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Для каждого из

штаммов используют отдельную порцию среды. Порции среды на основе гидро-

лизатов соевых бобов и казеина (# или среды Сабуро) засевают небольшим коли-

чеством (не более 100 колониеобразующих единиц) следующих микроорганизмов:

Aspergillus niger, Bacillus subtilis, Candida albicans. Для каждого из штаммов ис-

пользуют отдельную порцию среды. Инкубируют в течение не более 3 дней в слу-

чае бактерий и не более 5 дней в случае грибов.

При получении рабочей культуры, используемой при проведении испыта-

ния, число пересевов, произведенных от исходного штамма, не должно превы-

шать пяти.

Среды являются пригодными при условии наличия четкого визуально на-

блюдаемого роста микроорганизмов.

Таблица 2.6.1.-1

Штаммы тест-микроорганизмов, пригодные для испытаний питательных сред

Аэробные бактерии

Staphylococcus aureus

АТСС 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518, #TCC

6538-P

Bacillus subtilis

АТСС 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054

Pseudomonas aerugi-

АТСС 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118

nosa

Анаэробные бактерии

Clostridium sporogenes

АТСС 19404, CIP 79.3, NCTC 532, ATCC 11437, # ГИСК

272

Грибы

Candida albicans

АТСС 10231, IP 48.72, NCPF 3179, # АTСС 885-653

Aspergillus niger

АТСС 16404, IP 1431.83, IMI 149007, # ВКМ F-1119

ПРОВЕРКА ПРИГОДНОСТИ МЕТОДИКИ ИСПЫТАНИЯ

Проверку методики испытания выполняют в соответствии с нижеприведен-

ным описанием теста на стерильность испытуемого продукта с использованием в

точности аналогичного метода со следующими модификациями.

Мембранная фильтрация. После переноса содержимого испытуемого кон-

тейнера или контейнеров на мембрану заключительную порцию стерильного рас-

творителя, используемого для промывки фильтра, инокулируют небольшим коли-

чеством жизнеспособных микроорганизмов (не более 100 колониеобразующих

единиц).

Прямая инокуляция. После внесения в питательную среду содержимого

испытуемого контейнера или контейнеров ту же среду инокулируют небольшим

количеством жизнеспособных микроорганизмов (не более 100 колониеобразую-

щих единиц).

В обоих случаях используют штаммы микроорганизмов, приведенные выше,

в описании испытания питательных свойств в отношении аэробов, анаэробов и

грибов. За положительный контроль принимают результаты испытания питатель-

ных свойств используемых сред. Все контейнеры, содержащие среду, инкубируют

не более 5 дней.

Если после периода инкубации ясно наблюдается рост микроорганизмов,

визуально сравнимый с ростом в контрольном сосуде, не содержащим испытуемо-

го продукта, делают вывод, что либо продукт в условиях испытания не обладает

антимикробной активностью, либо такая активность была в достаточной степени

исключена. В таком случае испытание на стерильность может проводиться без

дальнейших модификаций.

Если после периода инкубации не наблюдается роста микроорганизмов, ви-

зуально сравнимого с ростом в контрольном сосуде, не содержащим испытуемого

продукта, делают вывод, что продукт обладает антимикробной активностью, кото-

рая в условиях испытания не была в достаточной степени исключена. Условия

подвергают модификациям с целью исключения антимикробной активности и по-

вторяют испытание на пригодность.

Это испытание следует проводить в следующих случаях:

а) когда проводится испытание на стерильность новой продукции,

б) при внесении любых изменений в экспериментальные условия испытания.

Проверка пригодности может выполняться одновременно с контролем сте-

рильности испытуемой продукции.

# Частные фармакопейные статьи должны содержать сведения о наличии

антимикробного действия продукта и рекомендации по его устранению.

ИСПЫТАНИЕ НА СТЕРИЛЬНОСТЬ ТЕСТИРУЕМОГО ПРОДУКТА

Испытание может быть выполнено с использованием метода мембранной

фильтрации или путем прямой инокуляции питательной среды испытуемым про-

дуктом. Должны проводиться соответствующие отрицательные контрольные опы-

ты. В тех случаях, когда позволяет природа продукта (фильтруемые водные пре-

параты, спиртовые или масляные препараты, а также препараты, смешиваемые

или растворимые в водных или масляных растворителях, не обладающих анти-

микробным эффектом в условиях испытания), следует предпочитать метод мем-

бранной фильтрации.

Мембранная фильтрация. Используют мембранные фильтры с номиналь-

ным размером пор, не превышающим 0,45 мкм, с установленной способностью к

удерживанию бактерий. Например, фильтры на основе нитрата целлюлозы ис-

пользуют для водных, масляных и разбавленных спиртовых растворов, а фильтры

на основе ацетата целлюлозы - в частности, для растворов с высоким содержа-

нием спирта. Для некоторых видов продукции, например, для антибиотиков, могут

потребоваться специально подготовленные фильтры.

В нижеописанном методе предполагается использование мембран диамет-

ром около 50 мм. При использовании фильтров других диаметров объемы разве-

дений и промывок должны быть изменены соответствующим образом. Аппарат

для фильтрации и мембрану стерилизуют подходящим способом. Конструкция ап-

парата должна обеспечивать введение и фильтрацию испытуемого раствора в

асептических условиях, извлечение мембраны для ее переноса в питательную

среду или проведение инкубации после помещения питательной среды в аппарат.

Водные растворы. Небольшое количество подходящего стерильного рас-

творителя, не подавляющего рост микроорганизмов, например, нейтрального рас-

твора мясного или казеинового пептона концентрацией 1 г/л (рН 7,1 ± 0,2), поме-

щают на мембрану аппарата и фильтруют. Растворитель может содержать подхо-

дящие нейтрализующие и/или инактивирующие вещества, например, в случае ан-

тибиотиков.

Содержимое контейнера или контейнеров, подлежащих испытанию, пере-

носят на мембрану (мембраны), при необходимости, после разбавления до объе-

ма, используемого в испытании на пригодность, избранным стерильным раство-

рителем; в любом случае, используют количества испытуемого продукта не менее

указанных в Таблице 2.6.1.-2. Немедленно фильтруют. Если испытуемый раствор

обладает антимикробными свойствами, мембрану не менее трех раз промывают

путем пропускания через нее каждый раз объема выбранного стерильного рас-

творителя, указанного в испытании на пригодность. В процессе промывки объем

не должен превышать 5¥200 мл, даже если при проверке пригодности было пока-

зано, что такая промывка не полностью исключает антимикробную активность.

Мембрану целиком переносят в питательную среду или в асептических условиях

делят ее на две равные части, каждую из которых помещают в две подходящие

среды. Используют такие же объемы питательных сред, как и в испытании на при-

годность. Кроме того, среда может быть нанесена на мембрану в аппарате. Среды

инкубируют в течение не менее 14 дней.

Таблица 2.6.1.-2

Минимальные количества тестируемого продукта, используемые для каждой пи-

тательной среды

Минимальное количество, которое

Количество в контейнере

следует использовать для посева на

каждую среду, если не обосновано и

разрешено использование других ко-

личеств

Для жидкостей

Менее 1 мл

Все содержимое каждого контейнера

1 - 40 мл

Половина содержимого каждого кон-

тейнера, но не менее 1 мл

Более 40 мл, но не более 100 мл

20 мл

Более 100 мл

10% содержимого контейнера, но не

менее 20 мл

Для жидкостей, содержащих антибиоти-

1 мл

ки

Для других препаратов, растворимых в

Все содержимое каждого контейнера,

воде или в изопропилмиристате

составляющее не менее 200 мг

Нерастворимые препараты, кремы и ма-

Все содержимое каждого контейнера,

зи, подлежащие суспендированию или

составляющее не менее 200 мг

эмульгации

Для твердых веществ

Менее 50 мг

Все содержимое каждого контейнера

50 мг и более, но менее 300 мг

Половина содержимого каждого кон-

тейнера, но не менее 50 мг

От 300 мг до 5 г

150 мг

Более 5 г

500 мг

Твердые растворимые препараты. Для каждой среды используют количе-

ство продукта, растворенного в подходящем растворителе, например, растворе

натрия хлорида 0,9% или нейтральном растворе мясного или казеинового пептона

концентрацией 1 г/л, не менее указанного в Таблице 2.6.1.-2, и продолжают испы-

тание по методике, описанной выше для водных растворов, с использованием

мембраны, соответствующей выбранному растворителю.

Масла и масляные растворы. Для каждой среды используют количество

продукта не менее указанного в Таблице 2.6.1.-2. Масла и масляные растворы,

обладающие достаточно низкой вязкостью, могут быть подвергнуты фильтрова-

нию через сухую мембрану без разбавления. Вязкие масла могут быть при необ-

ходимости разбавлены подходящим стерильным растворителем, для которого по-

казано отсутствие антимикробной активности в условиях испытания, например,

изопропилмиристатом. Дают маслу проникнуть в мембрану под действием собст-

венной тяжести, затем фильтруют, постепенно увеличивая давление или вакуум.

Мембрану промывают путем фильтрования не менее трех порций по 100 мл под-

ходящего стерильного растворителя, например, нейтрального раствора мясного

или казеинового пептона концентрацией 1 г/л, содержащего подходящий эмульга-

тор в концентрации, приемлемость которой была подтверждена в ходе испытания

на пригодность, например, 10 г/л полисорбата 80. Мембрану или мембраны пере-

носят в питательную среду или среды (или наоборот) в соответствии с указания-

ми, приведенными выше для водных растворов, и инкубируют при таких же тем-

пературах в течение тех же промежутков времени.

Мази и кремы. Для каждой среды используют количество продукта, не ме-

нее указанного в Таблице 2.6.1.-2. Мази на жирной основе и водно-масляные

эмульсии могут быть разбавлены до содержания 1% изопропилмиристатом, как

описано выше, при необходимости, при нагревании до температуры, не превы-

шающей 40⁰С. В исключительных случаях может оказаться необходимым нагрев

до температуры, не превышающей 44⁰С. Фильтруют насколько возможно быстро и

продолжают испытание в соответствии с указаниями, приведенными выше для

масел и масляных растворов.

Прямая инокуляция питательной среды. Количество испытуемого препа-

рата, предписанное в таблице 2.6.1.-2, помещают непосредственно в питательную

среду. При этом объем продукта должен составлять не более 10% объема среды,

если не предписано иное.

Если испытуемый продукт обладает антимикробной активностью, испыта-

ния выполняют после нейтрализации подходящим нейтрализующим агентом или

путем разбавления в достаточном количестве питательной среды. При необходи-

мости использования большого объема продукта предпочтительнее использовать

концентрированную питательную среду, приготовленную с учетом последующего

разбавления. Если это удобно, концентрированная среда может быть добавлена

непосредственно к продукту в контейнере.

Масляные жидкости. Используют среды с добавкой подходящего эмульга-

тора в концентрации, приемлемость которой была подтверждена в ходе испыта-

ния на пригодность, например, 10 г/л полисорбата 80.

Мази и кремы. Готовят разбавлением в соотношении около 1:10 путем

эмульгирования с использованием избранного эмульгатора в подходящем сте-

рильном растворителе, например, растворе мясного или казеинового пептона

концентрацией 1 г/л. Разбавленный продукт переносят в среду, не содержащую

эмульгатора.

Инокулированную среду инкубируют в течение не менее 14 дней. Состоя-

ние культур оценивают несколько раз в течение инкубационного периода. Иноку-

лированные среды, содержащие масляные продукты, ежедневно осторожно

встряхивают. Однако, при использовании тиогликолевой или другой аналогичной

среды для определения анаэробных микроорганизмов, встряхивание или пере-

мешивание сводят к минимуму для поддержания анаэробных условий.

НАБЛЮДЕНИЕ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Время от времени в течение периода инкубации, а также по его завершении

оценивают наличие макроскопических признаков микробного роста в средах. Если

внесение испытуемого материала приводит к помутнению питательной среды,

вследствие чего наличие или отсутствие микробного роста не может быть легко

определено визуально, следует через 14 дней после начала инкубации перенести

порции среды (каждая объемом не менее 1 мл) в другие сосуды, содержащие

свежую аналогичную среду и инкубировать исходные сосуды и сосуды с перене-

сенными порциями в течение 4 дней.

Если признаков микробного роста не обнаруживается, то продукт признают

выдерживающим испытание на стерильность. При наличии признаков микробного

роста продукт не выдерживает испытание на стерильность, если не может быть

показано путем повторного испытания или другим способом, что результаты ис-

пытания не являются достоверными по причинам, не связанным с испытуемым

продуктом. Результаты испытания могут быть признаны недостоверными лишь

при выполнении не менее одного из нижеперечисленных условий:

a) данные микробиологического мониторинга зоны проверки стерильности указы-

вают на произошедшие сбои,

б) проверка методики, используемой в данном испытании, привела к обнаружению

недочетов,

в) в отрицательном контроле был обнаружен микробный рост,

г) после установления типа микроорганизмов, выделенных в ходе испытания, рост

этого штамма (этих штаммов) может быть однозначно приписан ошибкам, вноси-

мым материалами и/или методиками, используемыми при проведении испытания.

Если результаты испытания признаны недостоверными, испытание повто-

ряют, используя то же количество образцов, что и в первоначальном тесте.

Если признаков микробного роста в ходе повторного испытания не обнару-

живается, то продукт признают выдерживающим испытание на стерильность. Ес-

ли в ходе повторного испытания обнаруживается рост, то продукт не выдерживает

испытание на стерильность.

ПРИМЕНЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ К ПАРЕНТЕРАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ, ОФТАЛЬМО-

ЛОГИЧЕСКИМ И ДРУГИМ НЕИНЪЕКЦИОННЫМ ПРЕПАРАТАМ, ДЛЯ КОТОРЫХ

ТРЕБУЕТСЯ ВЫПОЛНЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ НА СТЕРИЛЬНОСТЬ

При использовании метода мембранной фильтрации используют, где это

возможно, все содержимое контейнера, но не менее количеств, указанных в Таб-

лице 2.6.1.-2, при необходимости разбавляя приблизительно до 100 мл подходя-

щим стерильным раствором, например, нейтральным раствором мясного или ка-

зеинового пептона концентрацией 1 г/л.

При использовании метода прямой инокуляции питательной среды исполь-

зуют количества, указанные в Таблице 2.6.1.-2, если не оправдано и не разрешено

применение других количеств. Испытания на стерильность в отношении бактерий

и грибов выполняют на одном и том же образце испытуемого продукта. В случа-

ях, когда объем или количество, содержащиеся в контейнере, являются недоста-

точными для проведения испытаний, для инокуляции различных сред используют

содержимое двух или более контейнеров.

Таблица 2.6.1.-3

Минимальное количество испытуемых единиц

Количество единиц в партии

Минимальное количество

тестируемых единиц для

каждой среды, если не

обосновано и разрешено

иное*

Парентеральные препараты

Не более 100 контейнеров

10%, но не менее 4 кон-

тейнеров

Более 100, но не более 500 контейнеров

10 контейнеров

Более 500 контейнеров

2%, но не более 20 кон-

тейнеров

Офтальмологические и другие неинъекционные

препараты

Не более 200 контейнеров

5%, но не менее 2 контей-

неров

Более 200 контейнеров

10 контейнеров

В случаях, когда продукция представлена в форме

контейнеров, содержащих одну дозу, применяют

указанную выше схему для парентеральных препа-

ратов

Большие объемы твердых субстанций

До 4 контейнеров

Каждый контейнер

Более 4, но не более 50 контейнеров

20%, но не менее 4 кон-

тейнеров

Более 50 контейнеров

2%, но не менее 10 кон-

тейнеров

Большие упаковки антибиотиков (более 5 г)

6 контейнеров

* Если содержимого одного контейнера достаточно для инокуляции двух сред, то

в данной колонке дано количество контейнеров, необходимое для обеих сред.

УКАЗАНИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ИСПЫТАНИЯ НА СТЕРИЛЬНОСТЬ

Цель испытания на стерильность, как и всех фармакопейных испытаний, за-

ключается в предоставлении независимым аналитикам средств проверки соот-

ветствия данного материала требованиям Фармакопеи. Производителю не вме-

няется в обязанность проводить такие испытания и не запрещается использовать

модификации установленного метода или альтернативные методы при условии,

что данная продукция будет соответствовать требованиям Фармакопеи при про-

ведении испытания с использованием официального метода.

Условия проведения испытаний. Асептические условия проведения ис-

пытания могут быть достигнуты, например, использованием камеры с ламинар-

ным потоком воздуха класса А, расположенной в чистом помещении класса В, или

с помощью изолятора.

Руководство для производителей. Уровень достоверности, подтвер-

ждаемый удовлетворительным результатом испытания на стерильность (отсутст-

вие загрязняющих единиц в образце), в отношении к качеству партии зависит от

ее однородности, условий производства и эффективности принятого плана отбора

проб. Для целей данного описания партия определяется как однородный набор

запечатанных контейнеров, приготовленных таким образом, чтобы риск микробно-

го загрязнения был одинаковым для каждой единицы.

Для продукции, стерилизуемой на последней стадии производства, биоло-

гически обоснованные и автоматически документированные фактические доказа-

тельства правильного протекания процесса стерилизации для всей партии дают

большую гарантию, по сравнению с испытанием на стерильность. Обстоятельст-

ва, при которых допустим параметрический выпуск серии, описаны в разделе

«Методы приготовления стерильной продукции» (5.1.1). Для подтверждения асеп-

тических условий производства может применяться метод наполнения питатель-

ными средами. За исключением этих ситуаций, испытание на стерильность явля-

ется единственным аналитическим методом для продукции, производство которой

осуществляется в асептических условиях.

Вероятность определения наличия микроорганизмов в ходе испытания на

стерильность возрастает с увеличением их количества в испытуемом образце и

варьируется в зависимости от способности к росту имеющихся микроорганизмов.

Вероятность обнаружения очень низких уровней микробного загрязнения, даже

если оно в пределах партии является однородным, весьма мала. Интерпретация

результатов испытания на стерильность основывается на предположении, что со-

держимое любого контейнера в партии, если он будет подвергнут испытанию,

даст одинаковый результат. Поскольку очевидно, что каждый контейнер не может

быть подвергнут испытанию, следует использовать соответствующий план отбора

проб. В случае асептического производства рекомендуется отбирать образцы в

начале и в конце выпущенной партии, а также после существенного вмешатель-

ства в технологический процесс.

Руководство, касающееся минимального рекомендуемого количества об-

разцов, отбираемых для проведения испытания, в зависимости от размера пар-

тии, приведено в таблице 2.1.6.-3. При использовании этих рекомендаций следует

учитывать объем препарата в контейнере, валидацию метода стерилизации и лю-

бые другие особые условия, касающиеся планируемой стерильности продукции.

Наблюдение и интерпретация результатов. Общепринятые микробиоло-

гические и биохимические методы в общем случае являются удовлетворительны-

ми для идентификации микроорганизмов, выделяемых в ходе испытания на сте-

рильность. Однако, если производитель желает использовать лишь критерий (d)

для признания результатов испытания на стерильность недостоверными, может

оказаться необходимым использование чувствительных методов классификации

для демонстрации идентичности микроорганизма, выделенного при испытании

продукции, - микроорганизму, выделенному из материалов и окружающей обста-

новки. Хотя с помощью рутинных микробиологических и биохимических методов

может быть показано, что два изолированных штамма не являются идентичными,

эти методы могут быть недостаточно чувствительными и надежными для получе-

ния однозначного доказательства того, что два штамма имеют один и тот же ис-

точник. Для определения того, что микроорганизмы имеют общее происхождение

и клонально связаны, может оказаться необходимым использование более чувст-

вительных тестов, например, молекулярной классификации по гомологии

РНК/ДНК.

2.6.2. МИКОБАКТЕРИИ

Если испытуемый образец может содержать микроорганизмы, отличные от

микобактерий, его обрабатывают подходящим деконтаминирующим раствором,

например, раствором ацетилцистеина и гидроксида натрия или раствором натрия

лаурилсульфата.

На каждую из двух подходящих твердых питательных сред (например, сре-

да Лёвенштейна-Йенсена или среда Миддлбрук 7Н10) наносят по 0,2 мл образца.

Эксперимент выполняют в трех повторностях. В подходящую жидкую питательную

среду также в трех повторностях вносят по 0,5 мл образца. Все среды инкубируют

при 37⁰С в течение 56 дней.

Устанавливают способность среды к обеспечению роста в присутствии ис-

пытуемого продукта путем инокуляции подходящего штамма семейства Mycobac-

terium, например, BCG, и, при необходимости, используют подходящий нейтрали-

зующий агент.

Если в течение первых восьми дней инкубации наблюдается развитие по-

сторонних микроорганизмов, испытание повторяют с одновременным проведени-

ем испытания на бактериологическую стерильность.

Продукт выдерживает испытание, если в конце инкубационного периода ни

в одной из пробирок не наблюдается роста микобактерий.

2.6.3. ИСПЫТАНИЯ НА ПОСТОРОННИЕ ВИРУСЫ С ИС-

ПОЛЬЗОВАНИЕМ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ

Используют жидкую вакцину или восстанавливают подлежащее испытанию

количество вакцины, высушенной из замороженного состояния, применяя указан-

ную на этикетке или другую подходящую жидкость, содержащую в каждом случае

соответствующие антибиотики. Если это предписано в частной статье, нейтрали-

зуют моноспецифической антисывороткой. При необходимости разбавляют таким

образом, чтобы 0,2 мл смеси содержали 10 доз вакцины. Смесь прививают двум

группам по 10 куриных эмбрионов возрастом от 9 до 11 дней, полученных из

групп, не содержащих указанных патогенов:

- 0,2 мл в аллантоисную полость каждого из яиц первой группы,

- 0,2 мл на хориоаллантоисную мембрану каждого из яиц второй группы.

В течение 7 дней ежедневно состояние яиц оценивают визуально путем

просвечивания. Эмбрионы, погибающие в течение первых 24 часов, не учитыва-

ют, считая, что их гибель вызвана неспецифическими причинами: результаты ис-

пытания считают достоверными при условии, что не менее 6 эмбрионов из каждой

группы выживают в течение более 24 часов после прививки. Все эмбрионы, по-

гибшие более чем через 24 часа после прививки, а также выжившие в течение 7

дней, проверяют на наличие аномалий. Проверяют также хориоаллантоисные

мембраны на наличие аномалий, аллантоисные жидкости - на наличие гемагглю-

тинирующих агентов, а клетки, отделяемые путем центрифугирования от аллан-

тоисных жидкостей, - на наличие вируса инфекционного бронхита с использова-

нием метода флуоресцирующих антител. Выполняют дополнительный экспери-

мент с эмбрионами. По отдельности отбирают образцы материала из живых и по-

гибших эмбрионов и прививают каждый из образцов 10 эмбрионам каждым из

вышеописанных методов. При этом материал хориоаллантоисных мембран дол-

жен наноситься на хориоаллантоисные мембраны, а аллантоисная жидкость

должна вводиться в аллантоисную полость. Яйца наблюдают в течение 7 дней и

оценивают их состояние в соответствии с вышеприведенными указаниями. В слу-

чае, если вакцина приводит к гибели или ненормальному развитию, она не вы-

держивает испытание.

2.6.4. ИСПЫТАНИЕ НА ВИРУСЫ ЛЕЙКОЗА

Если это предписано в частной статье, вакцину нейтрализуют моноспеци-

фической антисывороткой. Вакцину в количестве 10 доз прививают культуре фиб-

робластов куриных эмбрионов, поддерживающей рост подгрупп А и В вируса лей-

коза. Культуры должны состоять не менее, чем из пяти повторов, площадь каждо-

го из которых составляет не менее 60 см². Субкультивирование фибробластов

производят с интервалами от 3 до 4 дней; весь период поддерживания составляет

не менее 9 дней. В конце последнего периода клетки собирают, ресуспендируют,

получая концентрацию 10⁷ клеток в миллилитре, и готовят экстракт. Для каждого

из экстрактов проводят испытание на связывание комплемента для групп-

специфического антигена птичьего лейкоза. Параллельно проводят испытание

для контрольных групп с привитым вирусом лейкоза подгрупп А и В. Если обнару-

живаются любые свидетельства наличия вируса лейкоза, вакцина не выдержива-

ет испытание. Если результаты не позволяют сделать определенный вывод, про-

водят дальнейшее субкультивирование фибробластов и продолжают испытание

до получения однозначного результата.

2.6.5. ИСПЫТАНИЕ НА ПОСТОРОННИЕ ВИРУСЫ С ИС-

ПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

Используют жидкую вакцину или восстанавливают подлежащее испытанию

количество вакцины, высушенной из замороженного состояния, применяя указан-

ную на этикетке или другую подходящую жидкость. Если это предписано в частной

статье, вакцину нейтрализуют моноспецифической антисывороткой. При необхо-

димости разбавляют таким образом, чтобы 0,1 мл смеси содержали 10 доз вакци-

ны. 0,5 мл смеси прививают культурам, полученным из куриных почек или печени

куриных эмбрионов. Культуры выделяют из групп, не содержащих указанных пато-

генов. Выдерживают для адсорбции в течение 1 часа при 37⁰С. Культуры должны

состоять не менее, чем из пяти повторов, и иметь общую площадь не менее 150

см². Культуры наблюдают в течение не менее 5 дней, отмечая наличие любых

специфических цитопатических эффектов, вызываемых вакциной. Если специфи-

ческих эффектов не наблюдается, выполняют дополнительные испытания с клет-

ками и жидкостями, отобранными из всех культур с интервалами не менее 5 дней,

и проводят наблюдение в течение инкубационного периода, составляющего 20

дней. Конечные культуры испытывают также на наличие гемадсорбирующих аген-

тов с использованием куриных эритроцитов. Гемадсорбирующие агенты пред-

ставляют собой микроорганизмы или вирусы, вызывающие адсорбцию эритроци-

тов на поверхности клеточных культур, на которых происходит их репликация. Ге-

мадсорбцию можно наблюдать следующим образом: в конце периода испытания к

отделенным и промытым монослоям клеточной культуры добавляют 0,5% суспен-

зии промытых эритроцитов. По окончании периода адсорбции (20 минут при 4⁰С)

монослой осторожно промывают раствором хлорида натрия в фосфатном буфе-

ре рН 7,4 R и изучают под микроскопом. При наличии гемадсорбции на монослоях

клеток наблюдаются скопления эритроцитов. Результаты испытания достоверны,

если не менее 80% культур выживают после каждого посева. Вакцина не выдер-

живает испытание, если наблюдаются любые цитопатические эффекты или обна-

руживается наличие гемадсорбирующих агентов.

2.6.6. ИСПЫТАНИЕ НА ПОСТОРОННИЕ АГЕНТЫ С ИС-

ПОЛЬЗОВАНИЕМ ЦЫПЛЯТ.

Если в частной статье нет иных указаний, испытание проводят не менее,

чем на 10 цыплятах двухнедельного возраста, отобранных из групп, не содержа-

щих специфических патогенов. Каждому из цыплят делают прививку в количестве

100 доз внутримышечно и 10 доз путем закапывания в глаза. Через две недели

прививки повторяют. Птиц наблюдают в течение пяти недель со дня первой при-

вивки. В течение периода наблюдения птицам не вводятся антимикробные аген-

ты.

Проводят отбор сыворотки у каждого из цыплят перед первой прививкой и в

конце испытания. Каждую из сывороток исследуют соответствующим методом.

Определяют наличие антител против нижеперечисленных инфекционных агентов,

за исключением антител против вируса, из которого была изготовлена вакцина.

Вакцина не выдерживает испытания при наличии любых доказательств присутст-

вия посторонних агентов. Результаты испытания недостоверны при обнаружении

любых антител до прививки. В таком случае испытание повторяют. Результаты

испытания также недостоверны, если к его концу выживает менее 80% животных.

По согласованию с компетентными органами могут применяться и другие методы

испытания при условии их соответствующей специфичности и чувствительности,

не меньшей по сравнению с чувствительностью нижеуказанных методов.

Инфекция

Тип испытания

Инфекционный бронхит⁽¹⁾

Агаровый гель - преципитин

или ингибирование гемагглютинации

Инфекционный бурсит (болезнь Агаровый гель - преципитин

Гумборо)

Болезнь Марека

Агаровый гель - преципитин

Болезнь Ньюкасла

Ингибирование гемагглютинации

Инфекции, вызываемые Salmo-

Агглютинация

nella pullorum

Аденовирусные инфекции⁽²⁾

Агаровый гель - преципитин

Инфекции, вызываемые виру-

Агаровый гель - преципитин

сом птичьей энцефалопатии

или твердофазное иммуноферментное опреде-

ление (ELISA)

Реовирусные инфекции⁽²⁾

Агаровый гель - преципитин

Инфекции, вызываемые виру-

Нейтрализация сыворотки

сом лейкоза⁽²⁾

Грипп А⁽²⁾

Агаровый гель - преципитин

Инфекционный ларинготрахе-

Нейтрализация сыворотки

ит⁽²⁾

⁽¹⁾По согласованию с компетентными органами, при рутинных испытаниях партий

продукции данное испытание может не выполняться, если для каждой партии вы-

полнено испытание на посторонние вирусы с использованием оплодотворенных

яиц (2.6.3).

⁽²⁾По согласованию с компетентными органами, при рутинных испытаниях партий

продукции данное испытание может не выполняться, за исключением случаев, ко-

гда это требуется в соответствии с указаниями в частной статье.

2.6.7. МИКОПЛАЗМЫ

Если испытание на микоплазмы предписано для основного или рабочего

клеточного банка, для посевной партии вирусов или для контрольных клеток, при-

меняют как метод культивирования, так и метод индикаторной клеточной культу-

ры. Если испытание предписано для вирусного сбора, большого количества вак-

цины или готовой партии продукции, применяют метод культивирования. Метод

индикаторной клеточной культуры может при необходимости также использовать-

ся для контроля сред.

МЕТОД КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ВЫБОР ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ

Испытание выполняют с использованием достаточного количества как

твердых, так и жидких питательных сред для того, чтобы в избранных условиях

инкубации был обеспечен рост небольшого количества микоплазм, которые могут

присутствовать в испытуемом продукте. Жидкие среды должны содержать фено-

ловый красный. Для ряда сред показано наличие удовлетворительных питатель-

ных свойств, по крайней мере, для нижеперечисленных организмов. Для каждой

новой партии среды должны быть подтверждены питательные свойства в отно-

шении соответствующих организмов из списка.

Acholeplasma laidlawii (вакцины для медицинского и ветеринарного приме-

нения, в процессе производства которых используются антибиотики)

Mycoplasma gallisepticum (в случаях, когда для производства вакцин исполь-

зуются материалы, имеющие птичье происхождение или для вакцин, предназна-

ченных для применения в птицеводстве)

Mycoplasma hyorhinis (ветеринарные вакцины, кроме птичьих)

Mycoplasma orale (вакцины для медицинского и ветеринарного применения)

Mycoplasma pneumoniae (вакцины для медицинского применения) или дру-

гие подходящие виды, связанные с ферментацией D-глюкозы

Mycoplasma synoviae (в случаях, когда для производства вакцин использу-

ются материалы, имеющие птичье происхождение или для вакцин, предназначен-

ных для применения в птицеводстве).

Тест-штаммы представляют собой изоляты, подвергнутые не более, чем 15

пересевам, и хранящиеся в замороженном или лиофилизированном состоянии.

После клонирования принадлежность штамма к требуемому виду определяется

подходящим методом путем сравнения с типовыми культурами, например:

A. laidlawii

NCTC 10116

CIP 75.27

ATCC 23206

M. gallisepticum

NCTC 10115

CIP 104967

ATCC 19610

M. hyorhinis

NCTC 10130

CIP 104968

ATCC 17981

M. orale

NCTC 10112

CIP 104969

ATCC 23714

M. pneumoniae

NCTC 10119

CIP 103766

ATCC 15531

M. synoviae

NCTC 10124

CIP 104970

ATCC 25204

УСЛОВИЯ ИНКУБАЦИИ

Инокулированную среду делят на две равные части, одну из которых инку-

бируют в аэробных условиях, а другую - в микроаэрофильных условиях; в случае

твердых сред поддерживают атмосферную влажность, достаточную для предот-

вращения высыхания поверхности. В случае аэробных условий при инкубации

твердых сред в атмосфере должно присутствовать от 5 до 10% диоксида углеро-

да. Инкубацию в микроаэрофильных условиях проводят в атмосфере азота, в ко-

торой, в случае твердых сред, содержится от 5 до 10% диоксида углерода.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

Питательные свойства испытывают для каждой новой партии среды.

Выбранные среды засевают соответствующими тест-организмами. На чашку диа-

метром 60 мм, содержащую 9 мл твердой среды, наносят не менее 100 колоние-

образующих единиц, а в контейнер вместимостью 100 мл, содержащий соответст-

вующую жидкую среду, вносят не менее 40 колониеобразующих единиц; для каж-

дого вида организмов используют отдельные чашки и контейнеры. Среды инкуби-

руют в условиях, в которых проводится основное испытание (аэробных, микроаэ-

рофильных или тех и других, в зависимости от потребностей тест-организма).

Среда выдерживает испытание на питательные свойства, если наблюдается аде-

кватный рост тест-организмов, сопровождаемый соответствующим изменением

окраски жидкой среды.

ИНГИБИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА

Проводят испытание на питательные свойства в присутствии испытуемого

продукта. Если рост тест-организмов заметно менее выражен, чем в отсутствии

испытуемого продукта, то последний содержит ингибирующие вещества, требую-

щие нейтрализации (или исключения их влияния другим способом, например,

разбавлением) перед проведением испытания на микоплазмы. Эффективность

нейтрализации или иного процесса проверяется путем повторения испытания на

ингибирующие вещества после нейтрализации.

ИСПЫТАНИЕ АНАЛИЗИРУЕМОГО ПРОДУКТА НА МИКОПЛАЗМЫ

В случае твердых сред используют чашки диаметром 60 мм, содержащие 9

мл питательной среды. Каждая из используемых сред должна содержаться не ме-

нее, чем в двух чашках. На каждую чашку наносят по 0,2 мл испытуемого продук-

та; в каждую жидкую среду вносят испытуемый продукт в соотношении 10 мл на

100 мл среды. Инкубируют при температуре от 35 до 38⁰С в аэробных и микроаэ-

рофильных условиях в течение 21 дня. Одновременно инкубируют порции по 100

мл каждой среды без испытуемого продукта для контроля. Если при добавлении

испытуемого продукта происходит существенное изменение показателя рН, ис-

ходное значение восстанавливают добавлением раствора хлористоводородной

кислоты или гидроксида натрия. В первый, второй и третий дни после инокуляции

выполняют пересев по 0,2 мл каждой из жидких культур на чашки с твердыми сре-

дами (по две чашки для каждой из сред) и инкубируют при температуре от 35 до

38⁰С в аэробных и микроаэрофильных условиях в течение не менее 21 дня. Про-

цедуру повторяют на шестой, седьмой и восьмой, а также на тринадцатый и че-

тырнадцатый дни испытания. Состояние жидких сред контролируют каждые два

или три дня и, в случае изменения окраски, выполняют пересев немедленно. Со-

стояние твердых сред оценивают один раз в неделю.

Если в жидких средах обнаруживается бактериальное или грибковое за-

грязнение, испытание повторяют. Если не ранее, чем через семь дней после ино-

куляции, не более, чем одна чашка с каждой стадии испытания имеет случайные

бактериальные или грибковые примеси или разбита, результаты, связанные с

этой чашкой могут не учитываться, если при немедленной проверке на ней не об-

наруживается признаков роста микоплазм. Если на любой стадии испытания бо-

лее одной чашки подвергаются случайному загрязнению бактериями или грибами,

или разбивается, испытание считают недействительным и повторяют.

Испытание проводят также для положительных контролей, приготовленных

путем инокуляции не более 100 колониеобразующих единиц подходящего штам-

ма, например, M. orale или M. pneumoniae.

В конце периодов инкубации все инокулированные твердые среды изучают

под микроскопом для установления наличия микоплазм. Продукт выдерживает

испытание, если ни на одной инокулированной среде не обнаружено роста мико-

плазм. При обнаружении роста микоплазм испытание может быть проведено по-

вторно с использованием удвоенного количества инокулята, сред и чашек; если

роста микоплазм не обнаруживается, то продукт выдерживает испытание. Резуль-

таты испытания недостоверны, если в положительных контролях не наблюдается

роста соответствующих тест-организмов.

МЕТОД ИНДИКАТОРНОЙ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ

Клеточные культуры окрашиваются флуоресцентным красителем, обла-

дающим способностью связываться с ДНК. Микоплазмы детектируются по их ха-

рактерной точечной или волокнистой флуоресценции на клеточной поверхности и,

при высоком уровне загрязнения, в прилегающем пространстве.

ПРОВЕРКА СУБСТРАТА

Метод подвергают предварительному испытанию с использованием суб-

страта клеточной культуры Веро и инокулята, содержащего не более 100 коло-

ниеобразующих единиц хорошо растущего на жидкой или твердой среде штамма,

и показывают возможность определения этим методом потенциальных примесей

микоплазм, например, подходящих штаммов Mycoplasma hyorhinis и Mycoplasma

orale. Могут использоваться и другие клеточные субстраты, например, производ-

ственная линия клеток, если было показано, что чувствительность определения

микоплазм не будет меньшей.

Метод испытания

Отбирают не менее 1 мл испытуемого продукта и используют его для засе-

ва в двух повторностях индикаторной клеточной культуры, представляющей в со-

вокупности не менее 25 см² площади клеточной культуры. Руководствуются ука-

заниями подраздела «Процедура».

В испытание включают отрицательный (неинфицированный) контроль и два

положительных контроля, содержащих микоплазмы, например, M. hyorhinis и M.

orale. В положительных контролях используют инокулят, содержащий не более

100 колониеобразующих единиц.

Если для вирусных суспензий на интерпретацию результатов влияют за-

метные цитопатические эффекты, вирус может быть нейтрализован с использо-

ванием специфической антисыворотки, не обладающей ингибирующим эффектом

в отношении микоплазм или может использоваться субстрат клеточной культуры,

не поддерживающий рост вируса. Для демонстрации отсутствия ингибирующего

эффекта сыворотки выполняют положительные контрольные тесты в ее присутст-

вии и отсутствии.

Процедура

1. Среду однородно засевают культурой (от 2¥104 до 2

¥10⁵ клеток в милли-

литре, от 4¥103 до 2,5

¥10⁴ клеток на см²) и инкубируют при температуре 36±1⁰С не

менее 2 дней. Вносят испытуемый продукт и инкубируют не менее 2 дней; выпол-

няют не менее одного пересева. Последнюю субкультуру выращивают на покров-

ных стеклах в подходящих контейнерах или на другой подходящей поверхности.

Не допускают достижения слияния в последней субкультуре, так как это может

привести к ингибированию окрашивания и ухудшить визуализацию микоплазм.

2. Среду извлекают и выбрасывают.

3. Монослой промывают раствором хлорида натрия в фосфатном буфере

рН 7,4 R, затем смесью равных объемов этого раствора и подходящего фикси-

рующего раствора и, наконец, чистым фиксирующим раствором; если для окра-

шивания используется бисбензимид R, то подходящим фиксирующим раствором

является свежеприготовленная смесь 1 объема ледяной уксусной кислоты R и 3

объемов метанола R.

4. Добавляют фиксирующий раствор и оставляют на 10 минут.

5. Фиксирующий раствор удаляют и выбрасывают.

6. Если монослой будет подвергаться окрашиванию позже, его полностью

высушивают. (Требуется особое внимание при окрашивании высушенных стекол

ввиду возможности возникновения артефактов).

7.Если монослой подлежит окрашиванию немедленно, фиксирующий рас-

твор смывают дважды стерильной водой; промывные воды отбрасывают.

8. Добавляют рабочий раствор бисбензимида R или другой подходящий

агент, обладающий способностью вызывать появление окраски при взаимодейст-

вии с ДНК, и выдерживают в течение 10 минут.

9. Краситель удаляют и промывают монослой водой.

10. При необходимости каждое покровное стекло готовят к изучению путем

нанесения капли смеси равных объемов глицерина и раствора хлорида натрия в

фосфатном буфере рН 7,4 R; удаляют с краев стекла излишки смеси.

11. Стекла изучают методом эпифлуоресценции (фильтр возбуждения 330

нм / 380 нм, барьерный фильтр LP 440 нм) при 100-400-кратном (или большем)

увеличении.

12. Изучая внеядерную флуоресценцию, сравнивают микроскопическую

картину тест-культур с микроскопическими картинами отрицательного и положи-

тельных контролей. Микоплазмы проявляют себя в виде точек или волокон, рас-

положенных над цитоплазмой и иногда в межклеточном пространстве.

Испытуемый продукт выдерживает испытание, если в тест-культурах, на которые

он был нанесен, нет признаков присутствия микоплазм. Результаты испытания

недостоверны, если в положительных контролях не обнаруживается присутствия

соответствующих тест-организмов.

Следующий раздел публикуется для информации.

СРЕДЫ, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ДЛЯ МЕТОДА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Рекомендуются нижеследующие среды. Могут использоваться и другие

среды при условии, что на каждой партии в присутствии и отсутствии испытуемого

продукта продемонстрирована способность к поддерживанию роста микоплазм.

СРЕДЫ, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ MYCOPLASMA GALLISEPTI-

CUM

Жидкая среда

Бульон из экстракта говяжьего сердца (1)

90,0 мл

Лошадиная сыворотка (не подвергнутая нагреву)

20,0 мл

Дрожжевой экстракт (250 г/л)

10,0 мл

Ацетат таллия (раствор концентрацией 10 г/л)

1,0 мл

Феноловый красный (раствор концентрацией 0,6 г/л)

5,0 мл

Пенициллин (20 000 МЕ/мл)

0,25 мл

Дезоксирибонуклеиновая кислота (раствор концентрацией 0,6 г/л)

1,2 мл

Значение рН доводят до 7,8.

Твердая среда

Готовят так же, заменяя бульон из экстракта говяжьего сердца на агар из

экстракта говяжьего сердца, содержащий агар в концентрации 15 г/л.

СРЕДЫ, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ MYCOPLASMA SYNOVIAE

Жидкая среда

Бульон из экстракта говяжьего сердца (1)

90,0 мл

Важнейшие витамины (2)

0,025 мл

Глюкозы моногидрат (раствор концентрацией 500 г/л)

2,0 мл

Поросячья сыворотка (инактивированная при 56⁰С 30 минут)

12,0 мл

β-Никотинамидадениндинуклеотид (раствор концентрацией 10 г/л)

1,0 мл

Цистеина гидрохлорид (раствор концентрацией 10 г/л)

1,0 мл

Феноловый красный (раствор концентрацией 0,6 г/л)

5,0 мл

Пенициллин (20 000 МЕ/мл)

0,25 мл

Смешивают растворы β-никотинамидадениндинуклеотида и цистеина гид-

рохлорида и через 10 минут добавляют к остальным компонентам. Значение рН

доводят до 7,8.

Твердая среда

Бульон из экстракта говяжьего сердца (1)

90,0 мл

Ионагар (3)

1,4 г

Значение рН доводят до 7,8, стерилизуют автоклавированием, после чего

добавляют:

Важнейшие витамины (2)

0,025 мл

Глюкозы моногидрат (раствор концентрацией 500 г/л)

2,0 мл

Поросячья сыворотка (не подвергнутая нагреву)

12,0 мл

β-Никотинамидадениндинуклеотид (раствор концентрацией 10 г/л)

1,0 мл

Цистеина гидрохлорид (раствор концентрацией 10 г/л)

1,0 мл

Феноловый красный (раствор концентрацией 0,6 г/л)

5,0 мл

Пенициллин (20 000 МЕ/мл)

0,25 мл

СРЕДЫ, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОПЛАЗМ, ИМЕЮЩИХ

ОТЛИЧНОЕ ОТ ПТИЧЬЕГО ПРОИСХОЖДЕНИЕ

Жидкая среда

Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (модифицированный) (4) 800 мл

Дистиллированная вода

67 мл

Экстракт из сердца и мозгов (5)

135 мл

Бульон PPLO (6)

248 мл

Дрожжевой экстракт (170 г/л)

60 мл

Бацитрацин

250 мг

Метициллин

250 мг

Феноловый красный (5 г/л)

4,5 мл

Ацетат таллия (раствор концентрацией 56 г/л)

3 мл

Лошадиная сыворотка

165 мл

Поросячья сыворотка

165 мл

Значение рН доводят до 7,4 - 7,45.

Твердая среда

Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (модифицированный) (4) 200 мл

DEAE-декстран

200 мг

Ионагар (3)

15,65 мг

Хорошо перемешивают и стерилизуют автоклавированием. Охлаждают до

100⁰С. Добавляют к 1740 мл вышеописанной жидкой среды.

(1) Бульон из настоя говяжьего сердца

Говяжье сердце (для приготовления экстракта)

500 г

Пептон

10 г

Натрия хлорид

5 г

Дистиллированная вода

до 1000 мл

Стерилизуют автоклавированием.

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год) - часть 15