ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ. Том III Контроль качества фармацевтических субстанций (2009 год) - часть 4

2.2.56. Анализ аминокислот

фазы, состоящей из ацетонитрила и водной
буферной смеси. Элюируемые из колонки
ДАБС-аминокислоты определяют при длине
волны 436 нм.

Метод позволяет проводить с одинако-

вой чувствительностью анализ как амино-
кислот, так и иминокислот (таких как пролин).
Метод дериватизации с ДАБС позволяет ко-
личественно определять остатки триптофа-
на, полученные при гидролизе белка/пепти-
да с сульфоновыми кислотами (такими как
кислота меркаптоэтансульфоновая, кислота

п-

толуолсульфоновая или кислота метансуль-

фоновая) как указано в методе 2, описанном
в разделе «Гидролиз белков». Другие лабиль-
ные остатки аминокислот, такие как аспарагин
и глутамин, можно анализировать как и преды-
дущие после превращения их в кислоту диа-
минопропионовую и кислоту диаминомасля-
ную соответственно, как указано в методе 11,
описанном в разделе «Гидролиз белков».

В качестве внутреннего стандарта для

этого метода не может быть использован нор-
лейцин, так как он элюируется в области хро-
матограммы со скоплением пиков первичных
аминокислот. В качестве внутреннего стандар-
та может быть использован нитротирозин, ко-
торый элюируется в свободной от пиков обла-
сти хроматограммы.

Предел обнаружения ДАБС-аминокислот

обычно составляет 1 пикомоль. Предел опре-
деления ДАБС-аминокислот — 2—5 пикомоль.
Для получения удовлетворительных данных
рекомендуется для одного анализа использо-
вать 10—30 нг ДАБС-производных белкового
гидролизата.

МЕТОД 7. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ
ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С
9-ФТОРЕНИЛМЕТИЛХЛОРФОРМИАТОМ

Предколоночная дериватизация аминокис-

лот с 9-фторенилметилхлорформиатом (ФМФ)
проводится перед разделением смеси амино-
кислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с
флуориметрическим детектированием.

ФМФ взаимодействует с первичными и

вторичными аминокислотами с образованием
производных с сильной флуоресценцией. Ре-
акция проходит при мягких условиях в водном
растворе в течение 30 с. Полученные производ-
ные стабильны, за исключением подвержен-
ных деструкции производных гистидина. Из-
быток флуоресцирующего ФМФ и флуоресци-
рующие побочные продукты могут быть удале-
ны без потерь ФМФ-аминокислот.

ФМФ-аминокислоты могут быть разде-

лены на колонке С

методом обращенно-

фазовой ВЭЖХ. Разделение проводят с ис-
пользованием градиентного элюирования с
использованием линейно изменяющегося со-
става подвижной фазы со смеси из 10 объе-
мов ацетонитрила, 40 объемов метанола и 50

объемов ацетатного буфера до смеси из 50
объемов ацетонитрила и 50 объемов ацетат-
ного буфера. В результате такого элюирова-
ния 20 производных аминокислот разделяют-
ся в течение 20 мин. Элюируемые из колон-
ки производные аминокислот определяют при
длине волны возбуждающего света 260 нм и
длине волны излучаемого света 313 нм.

Предел обнаружения находится в нижнем

фемтомолярном диапазоне. Линейность от-
клика для большинства аминокислот наблю-
дается в области 0,1—50 микромоль.

МЕТОД 8. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ
ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С 7-ФТОР-4-
НИТРОБЕНЗО-2-ОКСА-1,3-ДИАЗОЛОМ

Предколоночная дериватизация ами-

нокислот с 7-фтор-4-нитробензо-2-окса-
1,3-диазолом (НБД) проводится перед раз-
делением смеси аминокислот методом
обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметриче-
ским детектированием.

НБД взаимодействует с первичными и

вторичными аминокислотами с образовани-
ем производных с сильной флуоресценцией.
Аминокислоты дериватизируются с НБД при
нагревании до 60°С в течение 5 мин.

Производные НБД-аминокислот могут

быть разделены на колонке С

методом

обращенно-фазовой ВЭЖХ с использовани-
ем градиентного элюирования и подвижной
фазы, состоящей из ацетонитрила и водной
буферной смеси. В результате такого элюи-
рования 17 производных аминокислот раз-
деляются в течение 35 мин. В качестве вну-
треннего стандарта может быть использована
ε-аминокапроновая кислота, которая элюи-
руется в свободной от пиков области хрома-
тограммы. Элюируемые из колонки произ-
водные аминокислот определяют при длине
волны возбуждающего света 480 нм и длине
волны излучаемого света 530 нм.

Чувствительность этого метода почти

такая же, как в предколоночной дериватиза-
ции с ОФА (метод 5), за исключением проли-
на, который не реагирует с ОФА (преимуще-
ственное отличие метода с НБД). Предел об-
наружения для каждой аминокислоты состав-
ляет около 10 фемтомоль. Для получения
удовлетворительных данных рекомендуется
для одного анализа использовать 10—30 нг
ДАБС-производных белкового гидролизата.
Анализ проводят с использованием 1,5 мг
белкового гидролизата в предколоночной ре-
акционной смеси.

РАСЧЕТ И АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ
ДАННЫХ

При определении содержания аминокис-

лот в белковом/пептидном гидролизате сле-
дует учитывать, что при кислотном гидроли-
зе разрушаются триптофан и цистеин, серин

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

и треонин разрушаются частично, в то время
как связи по остаткам изолейцина и валина
расщепляются не полностью. Метионин во
время кислотного гидролиза может подвер-
гаться окислению, в результате чего появля-
ются свободные аминокислоты (например,
глицин и серин), загрязняющие образец. Ис-
пользование вакуума (менее 200 мкм ртутно-
го столба, или 26,7 Па) или введение инерт-
ного газа (аргон) в пространство реакционного
сосуда может уменьшить степень окислитель-
ной деструкции. Поэтому количественные ре-
зультаты, полученные для цистеина, трипто-
фана, треонина, изолейцина, валина, метио-
нина, глицина и серина из белкового/пептид-
ного гидролизата, могут быть непостоянными
и служить основанием для дальнейшего ис-
следования и анализа.

Мольный процент аминокислот

—

это количество конкретных аминокислотных
остатков на 100 остатков белка. Эта величи-
на может быть полезной при оценке данных,
полученных при анализе аминокислот, если
молекулярная масса исследуемого белка не-
известна. Информация также может быть ис-
пользована для подтверждения подлинности
белка/пептида или для других целей. Моль-
ный процент каждой аминокислоты в испытуе-
мом образце рассчитывают по формуле:

⋅

100

где:

— отклик пика аминокислоты в испытуе-

мом образце, проинтегрированный в наномоль;

— сумма откликов пиков всех аминокис-

лот в испытуемом образце, проинтегрирован-
ных в наномоль.

Сравнение полученного в испытании моль-

ного процента аминокислот с данными извест-
ных белков может помочь установить или под-
твердить подлинность испытуемого образца
белка.

Образцы неизвестного белка

. Этот метод

расчета может быть использован для оценки
концентрации белка в образце неизвестного
белка с использованием данных, полученных
при анализе аминокислот. Массу каждой высво-
бождаемой аминокислоты рассчитывают в ми-
крограммах по формуле:

1000

⋅

где:

— количество аминокислоты, определен-

ное в испытании, в наномоль;

— средняя молекулярная масса данной

аминокислоты, скорректированная с учетом
массы молекулы воды, удаленной при образова-
нии пептидной связи.

Суммируя массы высвобожденных амино-

кислот, получают общую массу анализируемого

белка после соответствующей корректировки с
учетом частично или полностью разрушенных
аминокислот. Если известна молекулярная масса
неизвестного белка (например, определенная
методом гель-электрофореза в полиакриламид-
ном геле с использованием натрия додецилсуль-
фата или методом масс-спектрометрии), можно
установить аминокислотный состав неизвестно-
го белка. Число остатков каждой аминокислоты
рассчитывают по формуле:

⎟⎟⎠

⎞

⎜⎜⎝

⎛

⋅

r t

1000

где:

— количество аминокислоты определен-

ное в испытании, в наномоль;

— общая масса белка, в микрограммах;

— молекулярная масса неизвестного

белка.

Образцы известного белка

. Этот метод

расчета может быть использован для установ-
ления аминокислотного состава и концентрации
белка в образце белка с известной молекуляр-
ной массой и аминокислотным составом с ис-
пользованием данных, полученных при анали-
зе аминокислот. При анализе состава известно-
го белка учитывают, что некоторые аминокисло-
ты высвобождаются хорошо, в то время как от-
крываемость других аминокислот может быть
затруднена вследствие полного или частично-
го разрушения (например, триптофан, цистеин,
треонин, серин, метионин), неполного расще-
пления связей (например, изолейцин и валин),
контаминации свободными аминокислотами (на-
пример, глицин и серин).

Для определения количественного содер-

жания белка используют аминокислоты, откры-
ваемость которых наилучшая. Хорошо откры-
ваемыми аминокислотами обычно являются:
аспартат-аспарагин, глутамат-глутамин, аланин,
лейцин, фенилаланин, лизин и аргинин. Этот пе-
речень может быть модифицирован на основа-
нии наработанного опыта по проведению анали-
за аминокислот. Для определения количествен-
ного содержания белка по каждой хорошо от-
крываемой аминокислоте количество каждой
хорошо открываемой аминокислоты, в нано-
моль, делят на ожидаемое число остатков этой
аминокислоты в белке. Рассчитывают среднее
содержание белка. Содержание белка, установ-
ленное по каждой хорошо открываемой ами-
нокислоте, должно быть равномерно распре-
делено около средней величины. Значения со-
держания белка, определенные по этим ами-
нокислотам, имеющие неприемлемые отклоне-
ния (обычно более 5 %) от средней величины, от-
брасывают. С учетом оставшихся значений пере-
считывают среднее содержание белка в испыту-
емом образце. Для определения аминокислот-
ного состава испытуемого образца содержание

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2.4.8. Тяжелые металлы

каждой аминокислоты делят на рассчитанное
среднее содержание белка.

Относительную ошибку определения ами-

нокислотного состава рассчитывают в процен-
тах по формуле:

⋅

100

где:

— экспериментально установленное ко-

личество аминокислот, в наномоль на аминокис-
лотный остаток;

— известное значение остатков для этой

аминокислоты.

Средняя величина относительной ошибки

определения аминокислотного состава является
средним значением абсолютных величин отно-
сительных ошибок определения каждой амино-
кислоты, обычно кроме триптофана и цистеина.
Средняя величина относительной ошибки опре-
деления аминокислотного состава может дать
важную информацию об устойчивости анализа
во времени. Соответствие найденного аминокис-
лотного состава образца белка и известного со-
става может служить подтверждением подлинно-
сти и чистоты белка в испытуемом образце.

2.4. ИСПЫТАНИЯ

НА ПРЕДЕЛЬНОЕ
СОДЕРЖАНИЕ ПРИМЕСЕЙ

2.4.8. ТЯЖЕЛЫЕ МЕТАЛЛЫ

Все описанные ниже методы требуют ис-

пользования

тиоацетамидного реактива Р

Допускается использование

раствора натрия

сульфида Р1

вместо

тиоацетамидного реак-

тива Р

. Если предписанная в частной статье

методика испытания разработана с использова-
нием

тиоацетамидного реактива Р

, но вместо

него используется

раствор натрия сульфида Р1

(0,1 мл), то для методов А и В необходимо вве-
дение проверочного раствора, приготовленно-
го из такого же количества испытуемого образ-
ца, что используется при приготовлении испы-
туемого раствора, к которому прибавляют такой
же объем эталонного раствора свинца, что и при
приготовлении раствора сравнения. Испытание
считают недействительным, если окраска прове-
рочного раствора менее интенсивная, чем окра-
ска раствора сравнения.

МЕТОД А

Испытуемый раствор

. 12 мл указанного в

частной статье водного раствора испытуемого
образца.

Раствор сравнения (эталон)

. Смесь из

10 мл

эталонного раствора свинца (1 ppm Pb)

или

эталонного раствора свинца (2 ppm Pb)

, указанного в частной статье, и 2 мл указанно-

го в частной статье водного раствора испытуе-
мого образца.

Контрольный раствор

. Смесь из 10 мл

воды Р

и 2 мл указанного в частной статье вод-

ного раствора испытуемого образца.

К каждому раствору прибавляют по 2 мл

бу-

ферного раствора рН 3,5 Р

и перемешивают.

Полученные растворы прибавляют к порциям
по 1,2 мл

тиоацетамидного реактива Р

и не-

медленно перемешивают. Сравнение растворов
проводят через 2 мин.

Испытание считают недействительным,

если раствор сравнения не имеет светло-
коричневой окраски в сравнении с контрольным
раствором.

Испытуемый образец выдерживает испыта-

ние, если окраска испытуемого раствора не ин-
тенсивнее окраски эталона.

Если невозможно дать однозначную оценку

результату испытания, растворы фильтруют
через мембранный фильтр (размер пор 3 мкм;
рисунок 2.4.8.-1, без использования предфиль-
тра). Давление поршня шприца должно быть
умеренным и постоянным для обеспечения мед-
ленного и равномерного фильтрования. Сравни-
вают окраски мембранных фильтров, получен-
ные в опытах с разными растворами.

МЕТОД В

Испытуемый раствор

. 12 мл указанного в

частной статье раствора, приготовленного с ис-
пользованием органического растворителя, со-
держащего минимальное количество воды (на-
пример, диоксан или ацетон, содержащие по
15 % воды).

Раствор сравнения (эталон)

. Смесь из

10 мл эталонного раствора свинца (1 ppm или
2 ppm Pb), указанного в частной статье, и 2 мл
указанного в частной статье раствора испы-
туемого образца в органическом раствори-
теле. Эталонный раствор свинца (1 ppm или
2 ppm Pb) готовят путем разведения

эталонно-

го раствора свинца (100 ppm Pb)

органическим

растворителем, применяемым для растворения
испытуемого образца.

Контрольный раствор

. Смесь из 10 мл рас-

творителя, применяемого для растворения ис-
пытуемого образца, и 2 мл указанного в частной
статье раствора испытуемого образца в органи-
ческом растворителе.

К каждому раствору прибавляют по 2 мл

бу-

ферного раствора рН 3,5 Р

и перемешивают.

Полученные растворы прибавляют к порциям
по 1,2 мл

тиоацетамидного реактива Р

и не-

медленно перемешивают. Сравнение растворов
проводят через 2 мин.

Испытание считают недействительным,

если раствор сравнения не имеет светло-
коричневой окраски в сравнении с контрольным
раствором.

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Испытуемый образец выдерживает испыта-

ние, если окраска испытуемого раствора не ин-
тенсивнее окраски эталона.

Если невозможно дать однозначную оценку

МЕТОД С

Испытуемый раствор

. В кварцевый тигель

помещают 4 мл раствора 250 г/л

магния суль-

фата Р

кислоте серной разведенной Р

и при-

бавляют количество испытуемого образца, ука-
занное в частной статье (не более 2 г). Пере-
мешивают тонкой стеклянной палочкой и осто-
рожно нагревают. Если смесь жидкая, осторож-
но выпаривают на водяной бане до сухого остат-
ка, затем постепенно нагревают до обугливания
и продолжают нагревание до получения почти
белого или, в крайнем случае, сероватого остат-
ка. Сжигание проводят при температуре не более
800°С. Оставляют до охлаждения, затем остаток
в тигле смачивают несколькими каплями

кисло-

ты серной разведенной Р.

Выпаривают до сухого

остатка, вновь сжигают и оставляют до охлажде-
ния. Общее время сжигания не должно превы-
шать 2 ч. Остаток из тигля количественно перено-
сят в пробирку двумя порциями

кислоты хлори-

стоводородной разведенной Р

по 5 мл каждая.

Прибавляют 0,1 мл

раствора фенолфталеина

, затем нейтрализуют

раствором аммиака кон-

центрированным Р

до появления розовой окра-

ски. Охлаждают, прибавляют

кислоту уксусную

ледяную Р

до обесцвечивания раствора и при-

бавляют еще 0,5 мл

кислоты уксусной ледяной

Р.

При необходимости фильтруют и промывают

фильтр

водой Р.

Доводят объем раствора

водой

до 20 мл и перемешивают.

Раствор сравнения (эталон)

. Готовят ана-

логично испытуемому раствору, используя ука-
занное в частной статье количество

эталонно-

го раствора свинца (10 ррт Рb) Р

вместо испы-

туемого образца. К 10 мл полученного раствора
прибавляют 2 мл испытуемого раствора.

Проверочный раствор

. Готовят аналогично

испытуемому раствору, прибавляя к испытуемо-
му образцу указанный в частной статье объем

эталонного раствора свинца (10 ррт Рb) Р

для

приготовления раствора сравнения. К 10 мл по-
лученного раствора прибавляют 2 мл испытуе-
мого раствора.

Контрольный раствор

. Смесь из 10 мл

воды Р

и 2 мл испытуемого раствора.

К 12 мл каждого раствора прибавляют по

2 мл

буферного раствора рН 3,5 Р

и перемеши-

вают. Полученные растворы прибавляют к пор-
циям по 1,2 мл

тиоацетамидного реактива Р

немедленно перемешивают. Сравнение раство-
ров проводят через 2 мин.

Испытание считают недействительным,

если раствор сравнения не имеет светло-
коричневой окраски в сравнении с контрольным
раствором или если окраска проверочного раст-
вора менее интенсивная, чем окраска раствора
сравнения.

Испытуемый образец выдерживает испыта-

ние, если коричневая окраска испытуемого раст-
вора не интенсивнее окраски эталона.

Если невозможно дать однозначную оценку

МЕТОД D

Испытуемый раствор

. Количество испыту-

емого образца, указанное в частной статье, по-
мещают в кварцевый тигель и тщательно сме-
шивают с 0,5 г

магния оксида Р1.

Сжигают при

слабом красном калении (# около 600°С) до
образования однородного остатка белого или
серовато-белого цвета. Если после 30 мин сжи-
гания смесь остается окрашенной, тигель остав-
ляют до охлаждения, содержимое перемеши-
вают тонкой стеклянной палочкой и повторяют
сжигание. При необходимости операцию повто-
ряют. Нагревают при температуре 800°С около
1 ч. Остаток из тигля количественно переносят в
пробирку двумя порциями по 5 мл смеси равных
объемов

раствора кислоты хлористоводород-

ной Р1

воды Р.

Прибавляют 0,1 мл

раствора

фенолфталеина Р

, затем подщелачивают

рас-

твором аммиака концентрированным Р

до по-

явления розовой окраски. Охлаждают, подкис-
ляют

кислотой уксусной ледяной Р

до обесцве-

чивания раствора и прибавляют еще 0,5 мл

кис-

лоты уксусной ледяной Р.

При необходимости

фильтруют и промывают фильтр

водой Р.

Дово-

дят объем раствора

водой Р

до 20 мл и переме-

шивают.

Раствор сравнения (эталон)

. Готовят ана-

логично испытуемому раствору, используя ука-
занное в частной статье количество

эталонно-

го раствора свинца (10 ррт Рb) Р

вместо испы-

туемого образца, и нагревая при температуре от
100°С до 105°С. К 10 мл полученного раствора
прибавляют 2 мл испытуемого раствора.

Проверочный раствор

. Готовят аналогично

испытуемому раствору, прибавляя к испытуемо-
му образцу указанный в частной статье объем

эталонного раствора свинца (10 ррт Рb) Р

для

приготовления раствора сравнения и нагревая
при температуре от 100°С до 105°С. К 10 мл по-
лученного раствора прибавляют 2 мл испытуе-
мого раствора.

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2.4.8. Тяжелые металлы

Контрольный раствор

. Смесь из 10 мл

воды Р

и 2 мл испытуемого раствора.

К 12 мл каждого раствора прибавляют по

2 мл

буферного раствора рН 3,5 Р

и перемеши-

вают. Полученные растворы прибавляют к пор-
циям по 1,2 мл

тиоацетамидного реактива Р

немедленно перемешивают. Сравнение раство-
ров проводят через 2 мин.

Испытание считают недействительным,

Испытуемый образец выдерживает испыта-

ние, если коричневая окраска испытуемого раст-
вора не интенсивнее окраски эталона.

Если невозможно дать однозначную оценку

МЕТОД Е

Испытуемый раствор

. Количество испыту-

емого образца, указанное в частной статье, раст-
воряют в 30 мл или в указанном объеме

воды Р.

Раствор сравнения (эталон)

. Количество

эталонного раствора свинца (1 ррт Рb) Р

, ука-

занное в частной статье, разводят

водой Р

до

объема испытуемого раствора.

В держатель устройства для стерильного

фильтрования, на подложку которого помещен
мембранный фильтр (размер пор 3 мкм), а над
ним — предфильтр (рисунок 2.4.8.-1), устанавли-
вают шприц вместимостью 50 мл без поршня.

Испытуемый раствор помещают в шприц

и вводят поршень, развивая такое давление,
чтобы профильтровался весь раствор. Откры-
вают держатель, вынимают предфильтр и про-
веряют отсутствие примесей на мембранном
фильтре. В случае обнаружения примесей его
заменяют другим мембранным фильтром и опе-
рацию повторяют в тех же условиях.

К фильтрату или к указанному в частной

статье объему фильтрата прибавляют 2 мл

бу-

ферного раствора рН 3,5 Р

и перемешивают.

Полученные растворы прибавляют к порциям
по 1,2 мл

реактива тиоацетамида Р

и переме-

шивают, оставляют на 10 мин и вновь фильтру-
ют, как описано выше, но расположение филь-
тров изменяют таким образом, чтобы жидкость
проходила вначале через мембранный фильтр,
а затем — через предфильтр (рисунок 2.4.8.-1).
Давление поршня шприца должно быть умерен-
ным и постоянным для обеспечения медленно-
го и равномерного фильтрования. После оконча-
ния фильтрования держатель открывают, мем-
бранный фильтр вынимают и высушивают при
помощи фильтровальной бумаги.

Параллельно проводят аналогичное испы-

тание с раствором сравнения

Окраска мембранного фильтра, полученная

в опыте с испытуемым раствором, должна быть
не интенсивнее окраски мембранного фильтра,
полученной в опыте с раствором сравнения.

Рисунок 2.4.8.-1.

Прибор для испытания на соли тяжелых металлов.

(Размеры указаны в миллиметрах)

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

МЕТОД F

Испытуемый раствор

. Количество испы-

туемого образца, указанное в частной статье,
помещают в чистую сухую колбу Кьельдаля
вместимостью 100 мл (в случае интенсивного
пенообразования следует использовать колбу
вместимостью 300 мл). Колбу закрепляют под
углом 45° и, если испытуемый образец пред-
ставляет собой твердое вещество, прибавля-
ют смесь из 8 мл

кислоты серной Р

и 10 мл

кислоты азотной Р

в количестве, достаточ-

ном для полного смачивания испытуемого об-
разца; если испытуемый образец представ-
ляет собой жидкость, прибавляют несколько
миллилитров смеси из 8 мл

кислоты серной

и 10 мл

кислоты азотной Р

. Осторожно на-

гревают до начала реакции. После прекра-
щения реакции прибавляют дополнительные
порции этой же смеси кислот, нагревая после
каждого прибавления. Операцию повторяют
до тех пор, пока объем прибавленной смеси
кислот не достигнет 18 мл. Увеличивают тем-
пературу нагревания и осторожно кипятят до
потемнения раствора. Охлаждают, прибавля-
ют 2 мл

кислоты азотной Р

и вновь нагре-

вают до потемнения раствора. Продолжают
прибавление

кислоты азотной Р

с последую-

щим нагреванием до тех пор, пока раствор не
перестанет темнеть, затем сильно нагревают
до появления плотных белых паров. Охлаж-
дают, осторожно прибавляют 5 мл

воды Р

, ки-

пятят с предосторожностями до появления
плотных белых паров и продолжают нагрева-
ние до получения остатка объемом от 2 мл до
3 мл. Охлаждают, осторожно прибавляют 5 мл

воды Р

и определяют окраску раствора. Если

раствор имеет желтую окраску, прибавляют по
каплям 1 мл

раствора водорода пероксида

концентрированного Р

, вновь нагревают до

появления плотных белых паров и продолжа-
ют нагревание до получения остатка объемом
от 2 мл до 3 мл. Если окраска раствора все
еще остается желтой, повторно прибавляют
5 мл

воды Р

и 1 мл

раствора водорода перок-

сида концентрированного Р

до обесцвечива-

ния раствора. Охлаждают и осторожно разво-
дят

водой Р

. Ополаскивая колбу

водой Р

, по-

лученный раствор переносят в пробирку вме-
стимостью 50 мл и доводят до объема 25 мл
этим же растворителем.

Доводят рН раствора до 3,0—4,0

рас-

твором аммиака концентрированным Р1

(при приближении к указанному значению
рН можно применять

раствор аммиака раз-

веденный Р1

), используя в качестве внешне-

го индикатора индикаторную бумагу, действу-
ющую в узком интервале рН, затем доводят
объем раствора

водой Р

до 40 мл и перемеши-

вают. Прибавляют 2 мл

буферного раствора

рН 3,5 Р

и перемешивают. Полученные рас-

творы прибавляют к порциям по 1,2 мл

тио-

ацетамидного реактива Р

и немедленно пе-

ремешивают. Доводят объем раствора

водой

до 50 мл и перемешивают.

Раствор сравнения (эталон)

. Готовят па-

раллельно с теми же количествами реактивов и
в тех же условиях, используя вместо испытуе-
мого образца указанный в частной статье объем

эталонного раствора свинца (10 ррт Рb) Р.

Проверочный раствор

. Готовят аналогич-

но испытуемому раствору, прибавляя к испы-
туемому образцу указанный в частной статье
объем

эталонного раствора свинца (10 ррт

Рb) Р

для приготовления раствора сравнения.

Контрольный раствор

. Готовят аналогич-

но испытуемому раствору, но без прибавления
испытуемого образца.

Просматривают растворы вертикально на-

против белого фона.

Через 2 мин коричневая окраска испыту-

емого раствора должна быть не интенсив нее
окраски эталона.

Испытание считают недействительным,

если раствор сравнения не имеет светло-
коричневой окраски в сравнении с контроль-
ным раствором или если окраска проверочно-
го раствора менее интенсивная, чем окраска
раствора сравнения.

Если невозможно дать однозначную

оценку результату испытания, растворы филь-
труют через мембранный фильтр (размер
пор 3 мкм; рисунок 2.4.8.-1, без использова-
ния предфильтра). Давление поршня шприца
должно быть умеренным и постоянным для
обеспечения медленного и равномерного
фильтрования. Сравнивают окраски мембран-
ных фильтров, полученные в опытах с разны-
ми растворами.

МЕТОД G

ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: при использовании

сосудов для сжигания при высоком давлении не-
обходимо соблюдать требования по технике
безопасности, указанные производителем обо-
рудования. Циклы сжигания должны соответ-
ствовать типу используемой микроволновой
печи (например, микроволновые печи с контро-
лем мощности, печи с контролем температу-
ры или печи с контролем давления). Кроме того,
циклы сжигания должны соответствовать ин-
струкции по эксплуатации используемого обо-
рудования. Циклы сжигания применяют в случае
образования прозрачных растворов.

Испытуемый раствор

. Количество испыту-

емого образца, указанное в частной статье (не
более 0,5 г), помещают в подходящий чистый
лабораторный стакан с магнитной мешалкой,
прибавляют последовательно 2,7 мл

кислоты

серной Р

, 3,3 мл

кислоты азотной Р

и 2,0 мл

раствора водорода пероксида концентрирован-
ного Р

, прибавляя каждый реактив после завер-

шения реакции между испытуемым образцом и
предыдущим реактивом. Полученную смесь ко-
личественно переносят в сухой, устойчивый к

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2.4.30. Этиленгликоль и диэтиленгликоль в этоксилированных субстанциях

высокому давлению сосуд для сжигания (фтор-
содержащий полимер или кварцевое стекло).

Раствор сравнения

. Готовят аналогично ис-

пытуемому раствору, используя вместо испытуе-
мого образца указанный в частной статье объем

эталонного раствора свинца (10 ррт Рb) Р.

Проверочный раствор

. Готовят аналогично

испытуемому раствору, прибавляя к испытуемо-
му образцу указанный в частной статье объем

эталонного раствора свинца (10 ррт Рb) Р

для

приготовления раствора сравнения.

Контрольный раствор

. Готовят аналогично

испытуемому раствору, но без прибавления ис-
пытуемого образца.

Сосуды укупоривают и помещают в лабора-

торную микроволновую печь. Процедуру сжига-
ния проводят, последовательно используя две
подходящие программы. В зависимости от типа
используемой микроволновой печи (следят за
давлением, температурой или мощностью) раз-
рабатывают многоступенчатые программы сжи-
гания для адекватного контроля над протекани-
ем реакции. После завершения первой програм-
мы оставляют сосуды до охлаждения перед их
вскрытием. Затем в каждый сосуд прибавляют
по 2,0 мл

раствора водорода пероксида концен-

трированного Р

и сжигают, используя вторую

программу. После завершения второй програм-
мы оставляют сосуды до охлаждения перед их
вскрытием. При необходимости для получе-
ния прозрачного раствора повторно прибавляют

раствор водорода пероксида концентрирован-
ного Р

и проводят вторую программу сжигания.

Охлаждают и осторожно разводят

водой Р

Ополаскивая сосуд

водой Р

, полученный раст-

вор переносят в колбу и доводят до объема
25 мл этим же растворителем.

Доводят рН растворов до 3,0—4,0

раствором

аммиака концентрированным Р1

(при приближе-

нии к указанному значению рН можно применять

раствор аммиака разведенный Р1

), используя

в качестве внешнего индикатора индикаторную
бумагу, действующую в узком интервале рН. Для
предотвращения нагревания растворов использу-
ют ледяную баню и магнитную мешалку. Доводят
объем растворов до 40 мл

водой Р

и перемешива-

ют. Прибавляют 2 мл

буферного раствора рН 3,5

перемешивают. Полученные растворы прибав-

ляют к порциям по 1,2 мл

тиоацетамидного ре-

актива Р

и немедленно перемешивают. Доводят

объем растворов

водой Р

до 50 мл, перемешива-

ют и выдерживают в течение 2 мин.

Растворы фильтруют через мембранный

фильтр (размер пор 3 мкм; рисунок 2.4.8.-1, без
использования предфильтра). Давление поршня
шприца должно быть умеренным и постоянным
для обеспечения медленного и равномерного
фильтрования. Сравнивают окраски мембран-
ных фильтров, полученные в опытах с разными
растворами.

Коричневая окраска мембранного фильтра,

полученная в опыте с испытуемым раствором,

должна быть не интенсивнее окраски мембран-
ного фильтра, полученной в опыте с раствором
сравнения.

Испытание считают недействительным,

если на фильтре, полученном в опыте с раство-
ром сравнения, отсутствует коричневая окраска
в сравнении с фильтром, полученным в опыте с
контрольным раствором, или если окраска филь-
тра, полученного в опыте с проверочным раство-
ром, менее интенсивная, чем окраска фильтра,
полученного в опыте с раствором сравнения.

2.4.30. ЭТИЛЕНГЛИКОЛЬ И

ДИЭТИЛЕНГЛИКОЛЬ В
ЭТОКСИЛИРОВАННЫХ
СУБСТАНЦИЯХ

В зависимости от процесса производства

этоксилированые субстанции могут содер-
жать различные количества этиленгликоля и
диэтиленгликоля. Этот метод может быть
использован для количественного определения
данных примесей, в том числе и в следующих
поверхностно-активных веществах: макрогол-
глицерина рицинолеате, макроголглицерина
гидроксистеарате, макрогол 15 гидроксисте-
арате, ноноксиноле 9 и макрогола цетостеа-
риловом эфире

Газовая хроматография (

2.2.28

Раствор внутреннего стандарта

. 30,0 мг

1,2-пентандиола Р

растворяют в

ацетоне Р

доводят до объема 30,0 мл этим же растворите-
лем. 1,0 мл полученного раствора доводят

аце-

тоном Р

до объема 20,0 мл.

Испытуемый раствор

. 0,500 г испытуемо-

го образца растворяют в растворе внутреннего
стандарта и доводят до объема 10,0 мл этим же
растворителем.

Раствор сравнения (а)

. 30,0 мг

этиленгли-

коля Р

смешивают с

ацетоном Р

и доводят до

объема 100,0 мл этим же растворителем. 1,0 мл
полученного раствора доводят раствором вну-
треннего стандарта до объема 10,0 мл.

Раствор сравнения (b)

. Раствор

диэтилен-

гликоля Р

с концентрацией, соответствующей

предписанному предельному содержанию, го-
товят с использованием тех же растворителей,
которые использовали при приготовлении раст-
вора сравнения (а).

Условия хроматографирования:

–

колонка

капиллярная кварцевая длиной

30 м и внутренним диаметром 0,53 мм;

–

неподвижная фаза

макрогол 20 000 Р

(толщина слоя 1 мкм);

–

детектор

: пламенно-ионизационный;

–

газ-носитель

гелий для хроматографии Р

;

–

скорость газа-носителя

: 10 мл/мин;

–

деление потока

: 1:3;

–

объем вводимой пробы

: 2 мкл;

–

температура

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Время (мин)

Температура (°С)

Колонка

0—40

80 → 200

40—45

200 → 230

45—65

230

Блок
ввода
проб

250

Детектор

250

Относительное удерживание

(по отно-

шению к 1,2-пентандиолу; время удержива-
ния — около 19 мин): этиленгликоль — около
0,7; диэтиленгликоль — около 1,3.

2.5. МЕТОДЫ

КОЛИЧЕСТВЕННОГО
ОПРЕДЕЛЕНИЯ

2.5.36. АНИЗИДИНОВОЕ ЧИСЛО

Анизидиновое число представляет собой

100-кратную оптическую плотность раст-
вора, содержащего 1 г испытуемого образ-
ца в 100 мл смеси из реактивов, измеренную
в кювете с толщиной слоя 1 см.

Все приготовления и измерения не-

обходимо проводить насколько возможно
быстро, избегая воздействия света, спо-
собного вызывать фотохимические превра-
щения.

Испытуемый раствор (а)

. 0,500 г испы-

туемого образца растворяют в

триметилпен-

тане Р

и доводят до объема 25,0 мл этим же

растворителем.

Испытуемый раствор (b)

. К 5,0 мл испы-

туемого раствора (а) прибавляют 1,0 мл раст-
вора 2,5 г/л

п-анизидина Р

кислоте уксусной

ледяной Р

, встряхивают и хранят в защищен-

ном от света месте.

Раствор сравнения

. К 5,0 мл

триметил-

пентана Р

прибавляют 1,0 мл раствора 2,5 г/л

п-анизидина Р

кислоте уксусной ледяной Р

встряхивают и хранят в защищенном от света
месте.

Измеряют оптическую плотность (

2.2.25

)

испытуемого раствора (а) при 350 нм, ис-
пользуя

триметилпентан Р

в качестве ком-

пенсационного раствора. Измеряют оптиче-
скую плотность испытуемого раствора (b) при
350 нм ровно через 10 мин после его приго-
товления, используя раствор сравнения в ка-
честве компенсационного раствора.

Анизидиновое число рассчитывают по

формуле:

)

(

−

⋅

где:

— оптическая плотность испытуемого

раствора (b) при 350 нм;

— оптическая плотность испытуемого

раствора (а) при 350 нм;

— масса навески испытуемого образца, в

граммах.

2.6. БИОЛОГИЧЕСКИЕ

ИСПЫТАНИЯ

2.6.27. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ

КОНТРОЛЬ КЛЕТОЧНЫХ
ПРОДУКТОВ

Данное испытание для определенных кле-

точных продуктов имеет преимущества по срав-
нению с испытанием на стерильность (

2.6.1

), по-

скольку имеет большую чувствительность, более
широкий спектр определения и требует меньше-
го времени на проведение. В случае если это ого-
ворено в частной статье, оно может быть исполь-
зовано вместо испытания на стерильность (

2.6.1

Испытание может проводиться вручную либо с
использованием автоматизированной системы.

Аэробная среда

Staphylococcus aureus

например, ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518

Bacillus subtilis

например, ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054

Pseudomonas aeruginosa

например, ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118

Candida albicans

например, ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179

Aspergillus niger

например, ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007

Анаэробная среда

Clostridium sporogenes

например, ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 или ATCC 11437

Bacteroides fragilis

например, ATCC 25285, CIP 77.16, NCTC 9343

Таблица 2.6.27.-1

Микроорганизмы, используемые для определения свойства усиления роста

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

403

# Метилурацил

пользуя в качестве индикатора 2 мл

раствора

крахмала Р

, который прибавляют в конце ти-

трования.

Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл

0,1 М раствора натрия тиосульфата

соответствует 10,66 мг C

ClN

ХРАНЕНИЕ

В воздухонепроницаемом контейнере в за-

щищенном от света месте.

ПРИМЕСИ

Специфицированные примеси: А.

А. 3-(Диметиламино)-7-(метиламино)фено-

тиазин-5-илия хлорид.

# МЕТИЛУРАЦИЛ

Methyluracilum

METHYLURACIL

М.м. 126,1

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Метилурацил содержит не менее 99,0 % не

более 100,5 % 2,4-диоксо-6-метил-1,2,3,4-тетрагидро-
пиримидина в пересчете на сухое вещество.

ОПИСАНИЕ (СВОЙСТВА)

Белый или почти белый кристаллический

порошок.

Малорастворим в воде и в 96

% спирте,

практически нерастворим в хлороформе.

ПОДЛИННОСТЬ (ИДЕНТИФИКАЦИЯ)

А.

Абсорбционная спектрофотометрия в ин-

фракрасной области (

2.2.24

Приготовление

: в дисках.

Сравнение

ФСО метилурацила

или спектр,

представленный на рисунке 1.

В.

Абсорбционная спектрофотометрия в

ультрафиолетовой и видимой областях (

2.2.25

)

1 мг испытуемого образца растворяют в

воде Р

доводят до объема 100 мл этим же растворите-
лем. Спектр поглощения полученного раствора
в области от 220 до 300 нм имеет максимум при
260 нм и минимум при 231 нм.

С.

К 0,1 г испытуемого образца прибавляют

10 мл

бромной воды Р

и встряхивают. Бромная

вода обесцвечивается в течение 5 мин.

ИСПЫТАНИЯ

Сопутствующие примеси

Тонкослойная

хроматография (

2.2.27

Испытуемый раствор.

100 мг испытуемо-

го образца растворяют в 10,0 мл смеси

ацетон

Р — вода Р

(1:1,

об/об

) при интенсивном встря-

хивании.

100

Пропускание

1000

1500

2000

3000

Волновое число (см

-1

)

Рисунок 1.

Инфракрасный спектр поглощения ФСО метилурацила в дисках с калия бромидом Р.

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

404

Раствор сравнения.

2,5 мг

мочевины Р

2,5 мг испытуемого образца растворяют в смеси

ацетон Р — вода Р

(1:1,

об/об

) при интенсивном

встряхивании и доводят до объема 25,0 мл этим
же растворителем.

Пластинка

ТСХ пластинка со слоем сили-

кагеля F

254

Подвижная фаза

хлороформ Р — мета-

нол

Р — кислота уксусная ледяная Р

(90:8:8,

об/об/об

Наносимый объем пробы

: по10 мкл испыту-

емого раствора и по 3 мкл раствора сравнения.

Фронт подвижной фазы

: не менее 10 см от

линии старта.

Высушивание

: на воздухе в течение 15 мин,

затем при температуре от 100°С до 105°С в те-
чение 5 мин.

Проявление

: пластинку просматривают

в ультрафиолетовом свете при длине волны
254 нм (отмечают пятна метилурацила), опры-
скивают раствором 10 г/л

диметиламинобен-

зальдегида Р

в смеси

кислота хлористово-

дородная Р

—

метанол Р

(1:3,

об/об

), сушат в

потоке воздуха в течение 10 мин и при темпера-
туре от 110°С до 115°С в течение 2 мин.

Пригодность хроматографической систе-

мы

: раствор сравнения:

– на хроматограмме обнаруживаются два

полностью разделенных пятна.

Результаты

: на хроматограмме испытуе-

мого раствора не должно обнаруживаться до-
полнительных пятен.

Хлориды

(

2.4.4

). Не более 0,008 % (80 ppm).

25 г испытуемого образца встряхивают со 100 мл

воды Р

в течение 1 мин и фильтруют. 2,5 мл

фильтрата доводят

водой Р

до объема 15 мл.

Полученный раствор должен выдерживать ис-
пытание на хлориды.

Тяжелые металлы

(

2.4.8, метод С

). Не

более 0,001 % (10 ppm). Определение проводят
из 1,0 г испытуемого образца. Эталон готовят
с использованием 1 мл

эталонного раствора

свинца (10 ppm Pb).

Потеря в массе при высушивании

(

2.2.32

Не более 0,3 %. 2,000 г испытуемого образца
сушат при температуре от 100°С до 105°С.

Сульфатная зола

(

2.4.14, метод А

). Не

более 0,1 %. Определение проводят из 1,0 г ис-
пытуемого образца.

Остаточные количества органических

растворителей

(

2.4.24

). Испытуемый образец

должен выдерживать требования статьи (

5.4

Микробиологическая чистота

(

2.6.12,

2.6.13, 5.1.4

). Метилурацил в условиях испыта-

ния не обладает антимикробным действием.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

0,150 г испытуемого образца растворяют в

25 мл

диметилформамида Р

, предварительно

нейтрализованного по раствору 10 г/л

тимоло-

вого синего Р

диметилформамиде Р

, прибав-

ляют 0,15 мл раствора 10 г/л

тимолового синего

диметилформамиде Р

и титруют

0,1 М рас-

твором натрия гидроксида в смеси метанола
и бензола

до появления сине-голубого окраши-

вания, не исчезающего в течение 30 с.

1 мл

0,1 М раствора натрия гидрокси-

да в смеси метанола и бензола

соответствует

12,61 мг C

ХРАНЕНИЕ

В защищенном от влаги месте при темпера-

туре от 15°С до 25°С.

МЕТИЛЦЕЛЛЮЛОЗА

Methylcellulosum

METHYLCELLULOSE

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Метилцеллюлоза представляет собой ча-

стично

-метилированную целлюлозу.

ОПИСАНИЕ (СВОЙСТВА)

Белый, желтовато-белый или серовато-

белый порошок либо гранулы. Гигроскопична
после высушивания.

Практически нерастворима в горячей воде,

в ацетоне, в этаноле и в толуоле. Растворяет-
ся в холодной воде с образованием коллоидно-
го раствора.

ПОДЛИННОСТЬ (ИДЕНТИФИКАЦИЯ)

А.

В лабораторный стакан помещают 100 мл

воды Р

, равномерно насыпают на поверхность

воды 1,0 г испытуемого образца и выдерживают
в течение 1—2 мин. Порошок агрегирует на по-
верхности.

В.

В лабораторный стакан помещают 100 мл

горячей

воды Р

, равномерно насыпают на по-

верхность воды 1,0 г испытуемого образца и пе-
ремешивают на магнитной мешалке с переме-
шивающим элементом длиной 25 мм. Образует-
ся взвесь, частицы не растворяются. Получен-
ную взвесь охлаждают до температуры 5°С и пе-
ремешивают на магнитной мешалке. Образует-
ся прозрачный или слегка мутный (в зависимо-
сти от вязкости) раствор.

С.

К 0,1 мл раствора, полученного в иден-

тификации В, прибавляют 9 мл 90 % (

об/об

)

кислоты серной Р

, встряхивают, нагревают на

водяной бане в течение ровно 3 мин, быстро
охлаждают в ледяной бане, осторожно при-
бавляют 0,6 мл раствора 20 г/л

нингидрина Р

встряхивают и выдерживают при температу-
ре 25°С. Появляется красное окрашивание, не
переходящее в красно-фиолетовое в течение
100 мин.

2—3 мл раствора, полученного в иден-

тификации В, помещают тонким слоем на сте-
клянную пластинку и выдерживают до испаре-
ния воды. Образуется прозрачная пленка.

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

содержание .. 2 3 4 5 ..