В настоящих методических рекомендациях приводится описание методики определения биологической активности торфов и сапропелей по изменению показателей обратимой агрегации эритроцитов (ОАЭ) при внесении исследуемого препарата in vitro в пробу цельной крови лабораторных жвотных.
Регистрацию показателей ОАЭ осуществляется фотометрическим вибрационным методом. Расчетным путем определяется индекс агрегации – Ja = Ud / t, характеризующий соотношение агрегационных и дезагрегационных процессов.
Объектами исследования являются экстракты торфов, сапропелей и других сырьевых источников.
Методические рекомендации разработаны: д. б. наук Р. Т. Тухватулиным1
, д.с.х.н. Л.И. Инишевой2
, к.фарм.н. М.В.Гостищевой2
1
Обособленное структурное подразделение «Научно - исследовательский институт биологии и биофизики Томского государственного университета», 604050, г. Томск, пр. Ленина, 36, тел. (382 2) 529616, e-mail: tukhvatulin@mail.tsu.ru.
2
Томский государственный педагогический университет, 634041, г. Томск, пр-т Комсомольский, 75, тел. (382 2)520099, e-mail: agroecol@tspu. Edu.ru
Настоящий документ устанавливает методику количественного определения степени биологического активности торфов и сапропелей с использованием в качестве тест – системы агрегатов эритроцитов крови лабораторных животных.
Объектами исследования являются экстракты торфов и сапропелей.
Результаты работ могут быть использованы в практике мониторинга биологической активности торфов и сапропелей государственными, коммерческими, общественными и другими организациями.
проведение анализов по определению биологической активности с помощью живых организмов.
Обратимая агрегация эритроцитов (ОАЭ)
-
способность эритроцитов (красных кровяных телец) спонтанно образовывать агрегаты типа монетных столбиков после их механического разрушения (дезагрегации)
Степень биологической активности торфов и сапропелей
изменение любого показателя жизнедеятельности или функций организма под воздействием экстрактов торфов и сапропелей
Тест-реакция
-
изменение какого-либо биохимического, морфологического, поведенческого или другого функционального показателя на воздействие
Тест-система
-
биологическая, химическая, физическая и информационная системы или их комбинации, используемые при проведении исследований
Тест-функция
-
жизненная функция, используемая в биотестировании для характеристики отклика тест-системы на воздействие
Методика основана на определении изменений показателей обратимой агрегации эритроцитов по изменениям оптической плотности крови в присутствии экстрактов торфов и сапропелей в анализируемой пробе, по сравнению с контрольными значениями в пробах не содержащих экстрактов торфов и сапропелей.
Принцип действия прибора основан на свойстве крови изменять свою оптическую плотность в зависимости от степени агрегированности эритроцитов. При измерении интенсивности света, проходящего через исследуемую пробу крови, с одновременной регистрацией величины механического активности, разрушающего агрегаты эритроцитов, определяются показатели, характеризующие минимальную и максимальную механическую прочность агрегатов эритроцитов. При измерении прозрачности крови во время спонтанной агрегации определяются показатели, характеризующие скорость спонтанной агрегации эритроцитов и количество клеток, принимающих участие в процессе агрегации.
Критерием биологического активности экстрактов торфов и сапропелей являются изменения параметров ОАЭ в исследуемой пробе по сравнению с таковой для пробы, не содержащей экстрактов торфов и сапропелей (контролем). По степени отклонения параметров ОАЭ в исследуемой пробе от контрольных значений судят о степени активности экстрактов торфов и сапропелей.
проведение анализов по определению степени активности экстрактов торфов и сапропелей на изменение параметров тест – системы под воздействием экстрактов торфов и сапропелей или их смесей
Критерий активности
-
достоверное количественное изменение параметров тест – системы
Тест- система
-
агрегаты эритроцитов крови лабораторных животных - in vitro
Тест - реакция (параметр)
-
изменение параметров тест – системы под воздействием экстрактов торфов и сапропелей или их смесей
Тест-функция
-
процесс обратимой агрегации эритроцитов, используемый в биотестировании для характеристики отклика крови на воздействие экстрактов торфов и сапропелей
Тест – система
– агрегаты эритроцитов крови лабораторных животных – in vitro [1]. Забор крови для исследования производят стандартным способом [2, 3, 4]. Кровь смешивают с гепарином в пробирке в объемном соотношении 9 : 1 (концентрация гепарина 50 ЕД на 1 мл крови) в количестве достаточном для измерения не менее 20 проб. Для измерения 1 пробы необходимо 50 мкл крови. Содержание тест - системы при температуре + 1 - 2 °С (в холодильной камере и (или) на тающем льду), позволяет сохранить параметры ОАЭ в течение 6 часов.
«Стационарный световой анализатор параметров обратимой агрегации эритроцитов» ТКМА 94.1112.001 является измерительным прибором, предназначенным для оценки степени биологического активности экстрактов торфов и сапропелей с использованием агрегатов эритроцитов крови лабораторных животных в лабораторных условиях. Прибор в автоматическом режиме регистрируют с высокой достоверностью чрезвычайно малые количественные изменения значений четырёх параметров ОАЭ, на основании анализа которых возможно оценить степень активности экстрактов торфов и сапропелей.
Количественная оценка тест - реакции выражается в изменении параметров ОАЭ тест – системы под воздействием экстрактов торфов и сапропелей или их смесей.
На исследуемую пробу крови подаются нарастающие сдвиговые усилия. Величина локальных сдвиговых усилий, непосредственно разрушающих агрегаты, пропорциональна амплитуде колебаний стенки кюветы, которая, в свою очередь, пропорциональна величине напряжения питания вибратора, являющегося источником колебаний.
На рисунке 1 приведена схема, поясняющая принцип определения показателей ОАЭ по фотометрической кривой и зависимости напряжения питания вибратора от времени. В случае, когда эритроциты полностью агрегированы, оптическая плотность исследуемой пробы крови минимальна и постоянна во времени (участок 0 -1). При включении напряжения и начале вибрации увеличение оптической плотности крови происходит не сразу (участок 1-2), а начиная с некоторой величины - Uо (точка - 2).
Микроскопированием установлено, что увеличение оптической плотности обусловлено началом разрушения агрегатов и, следовательно, по величине Uо можно судить об их минимальной механической прочности. Дальнейшее увеличение напряжения питания вибратора приводит к еще большему разрушению агрегатов и связанному с этим уменьшению прозрачности исследуемой пробы крови (участок 2 - 3). Величина напряжения Ud, начиная с которой дальнейшее возрастание разрушающих усилий не приводит к увеличению оптической плотности исследуемой пробы крови (точка 3), характеризует максимальную механическую прочность эритроцитарных агрегатов. Это обусловлено тем, что при Ud все агрегаты разрушены до отдельных эритроцитов, фотометрическая кривая при этом выходит на плато, соответствующее полной дезагрегации эритроцитов (участок 3 - 4). После прекращения разрушающих воздействий (точка 4) начинается процесс спонтанной агрегации эритроцитов (участок 4-5), который заканчивается полной их агрегацией. Фотометрическая кривая при этом выходит на плато (участок 5 - 6).
Скорость спонтанной агрегации эритроцитов характеризуется величиной, обратной полупериоду агрегации эритроцитов - t. Величина полупериода агрегации определяется временем, в течение которого амплитуда фотометрического сигнала изменяется на 50 % [5]. За 100 % изменение амплитуды фотометрического сигнала принимается расстояние - А (мм) от плато на фотометрической кривой, соответствующее полной дезагрегации (участок 3 - 4), до плато, соответствующего полной агрегации эритроцитов (участок 5 - 6).
Рис. 1. Схема, поясняющая принцип определения показателей обратимой агрегации эритроцитов. I - зависимость оптической прозрачности крови от времени в процессе дезагрегации и спонтанной агрегации эритроцитов; II - зависимость напряжения питания вибратора от времени.
На основании измеренных значений показателей ОАЭ расчетным путем определяют индекс агрегации - Ia = Ud / t, характеризующий соотношение агрегационных и дезагрегационных процессов и интегральный коэффициент агрегации - К = Uo Ud A / t.
Количественную оценку биологической активности экстрактов торфов и сапропелей выражают в виде безразмерной величины - степени биологической активности (СБА) экстрактов торфов и сапропелей. СБА = 100 (Рк – Ро)/Рк, где соответственно Рк и Ро - значения тест - параметра контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы.
СБА определяют по изменению параметров ОАЭ за 10-ти минутный (в экспрессном варианте) период экспозиции.
Перечень необходимого оборудования для количественного определения биологического активности экстрактов торфов и сапропелей в лабораторных условиях представлен в таблице 1
Таблица 1 Перечень необходимого оборудования для количественного определения биологического активности НЧ в лабораторных условиях
Перечень необходимых вспомогательных устройств и лабораторной посуды для количественного определения биологической активности экстрактов торфов и сапропелей представлен в таблице 2.
Таблица 2 Перечень необходимых вспомогательных устройств и лабораторной посуды для количественного определения биологической активности экстрактов торфов и сапропелей
№ п.п.
Оборудование
ТУ, ГОСТ
Количество
1.
Пробирка типа Эппендорф коническая микроцентрифужная с крышкой на 1.5 мл. используется для всех видов лабораторных исследований как транспортно сохраняющая тара при отсроченных отборах проб
200
2.
Штатив-бокс для пробирок типа Эппендорф 1,5 мл (72 гнезда)
1
3.
Пипетка вместимостью 1.0 мл ± 1,0% (1000 мкл)
ГОСТ 29227
1
4.
Пипетка автоматическая дозатор любого типа объемом 0.02 мл ± 1,0% (200 мкл)
1
5.
Пипетка автоматическая дозатор любого типа объемом 0.002 мл ± 1,0%; (20 мкл)
1
6.
Бюксы с притертой пробкой для отбора и хранения проб и реактивов вместимостью 10, 50, 100мл
Перечень необходимых реактивов и материалов для количественного определения биологической активности экстрактов торфов и сапропелей в лабораторных условиях представлен в таблице 3.
Таблица 3 Перечень необходимых реактивов и материалов для количественного определения биологического активности НЧ
10.1. При работе с химическими веществами необходимо соблюдать требования техники безопасности по ГОСТ 12.4.021.
10.2. Рабочие столы и поверхности должны содержаться в чистоте. В конце дня проводится влажная уборка рабочих поверхностей.
10.3. Безопасность при работе с электроустановками обеспечивается по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с требованиями инструкций к оборудованию.
10.4. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
10.5. Используемая в качестве тест - системы кровь лабораторных животных не патогенна, однако после каждого анализа необходимо промыть всю использованную посуду, ополоснув дистиллированной водой.
10.6. Хранить тест-систему в холодильнике при температуре от +2 до - +4° С (следует беречь тест-систему от замораживания, нагревания и резкой смены температуры).
Определение степени биологической активности экстрактов торфов и сапропелей по настоящей методике выполняется оператором с квалификацией лаборант, имеющим опыт работы с лабораторными животными.
Настоящий документ устанавливает методику количественного определения биологической активности экстрактов торфов и сапропелей с использованием в качестве тест – системы агрегатов эритроцитов крови лабораторных животных.
11\1. Содержание лабораторных животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных. Животные содержались на стандартном лабораторном рационе в условиях свободного доступа к пище и воде. Все манипуляции с животными осуществлялись в осенне-зимний период, в первой половине дня. Экспериментальные исследования проведены в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г «Об утверждении правил лабораторной практики», Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2005 г).
В лабораторных условиях биотестирование проводят в соответствии с требованиями по эксплуатации прибора «Стационарный световой анализатор параметров обратимой агрегации эритроцитов» ТКМА 94.1112.001 и с ГОСТ 15150. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов. Температура окружающего воздуха в лаборатории от 18 до 25°С. Относительная влажность воздуха 80±5%. Атмосферное давление 84-106 кПа (630-800 мм рт. ст.). При использовании электроприборов частота переменного тока 50 ± 1 Гц. Напряжение сети 220 ± 10 В. Освещение помещения естественное или искусственное, не ограничивается особыми требованиями.
Предварительная подготовка к отбору проб и выполнению биотестирования должна обеспечивать подготовку посуды, мест хранения отобранных проб, а также подготовку рабочего места для обработки доставленных в лабораторию проб и определения степени их биологического активности. Все процедуры предварительной подготовки должны исключить попадание токсичных, органических и каких-либо других веществ в исследуемую пробу.
Обычно используют посуду из стекла, либо одноразовые пробирки типа Эппендорф. Посуда для отбора проб и биотестирования должна быть химически чистой. Стенки посуды осторожно смачивают хромовой смесью (смесью бихромата калия и серной кислоты), через 2 - 3 часа тщательно промывают водой, нейтрализуют раствором пищевой соды и промывают 3 - 4 раза дистиллированной водой. Для мытья посуды не допустимо использование синтетических поверхностно-активных веществ и органических растворителей. Посуду сушат на воздухе, а используемую для биотестирования, за исключением мерной - в сушильном шкафу при + 105° С в течение 1 часа.
Химически чистая посуда для биотестирования должна храниться с закрытыми стеклянными притертыми пробками или завинчивающими крышками в защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах и т.п.
13.2.1 Для исследования берутся репрезентативные торф и сапропель.
Гуминовые кислоты (ГК) выделяются 0.1 н раствором NaOH и нейтральным 0.1 М раствором Na4
P2
O7
(далее соответственно щелочные и пирофосфатные вытяжки ГК). Для щелочных и пирофосфатных вытяжек ГК контролем служит соответственно 0.1 н раствор NaOH и 0.1 М раствор Na4
P2
O7
Все последующие этапы оценки биологического активности экстрактов торфов и сапропелей желательно проводить в максимально сжатые сроки.
13.2.2 До проведения тестирования экстракт нагревают до температуры 20 ± 2° С. После чего отбирают определенный объем жидкости и проводят анализ.
13.2.3 Аналогичную процедуру проводят с жидкостью, которую используют в качестве контрольного раствора.
Забор крови для исследования производят стандартным способом [2, 3, 4]. Кровь смешивают с гепарином в пробирке в соотношении 9 : 1 (концентрация гепарина 50 ед. на 1 мл крови) в количестве достаточном для измерения не менее 20 проб. Для измерения 1 пробы необходимо 50 мкл крови. Содержание крови при температуре + 1 - 2 °С (в холодильной камере и (или) на тающем льду), позволяет сохранить параметры ОАЭ в течение 6 часов. Перед использованием кровь в пробирке оксигенируют путем перемешивания её стеклянной палочкой.
13.3.2 Способы и пути введения исследуемого и контрольного образца
Исследуемый образец.
Экстракт с исследуемым объектом смешивают в чистой пластиковой пробирке стеклянной палочкой с пробой крови. Время с момента смешивания крови с экстрактом до начала измерений параметров ОАЭ составляет 10 минут. Выбор времени определялся минимальным временем, позволяющим проводить измерения без технических задержек.
Контрольный образец
. В качестве контроля используют кровь того же животного к которой добавляют контрольную жидкость. Время с момента смешивания до начала измерений параметров ОАЭ составляет 10 минут.
13.3.3 Подготовка прибора
Подготовку приборов «Световой анализатор параметров обратимой агрегации эритроцитов»» проводят в соответствии с руководством по эксплуатации.
При определении степени биологической активности экстрактов торфов и сапропелей необходимо проводить параллельное измерение контрольных и опытных проб. Рекомендуется иметь не менее 10 (десяти) повторностей измерений каждой серии. Для получения большей достоверности результатов измерений число повторностей может быть увеличено. Последовательно измеряют не менее 10 (десяти) пар контроль – опыт.
В стандартном анализе отбирают в пробирку типа Эппендорф 45.0 микролитров стабилизированной гепарином крови лабораторных животных, добавляют исследуемый объект – экстракт торфов и сапропелей в количестве 5.0 микролитров. Смесь перемешивают стеклянной палочкой и через 10 минут измеряют значения параметров ОАЭ в опытной
пробе.
14.1.1 Измерение значений параметров ОАЭ проводят согласно руководству по эксплуатации прибора. В стандартном варианте через 10 минут экспозиции при температуре 20 ± 2°С. При необходимости допустимо проведение анализа через другой интервал времени.
14.1.2 В стандартном анализе измерение значений параметров ОАЭ в контрольной
пробе проводят аналогично п. 14.1 и п. 14.1.1 с тем отличием, что вместо экстракта торфов и сапропелей добавляют контрольную жидкость.
Степень биологической активности (СБА) экстрактов торфов и сапропелей оценивают по изменению показателей ОАЭ под воздействием экстрактов торфов и сапропелей в контрольной и опытной пробах. Показатель СБА исследуемого объекта вычисляют в виде безразмерной величины:
СБА = 100 (Рк – Ро) / Рк,
где соответственно Рк и Ро – усредненные значения тест - параметров контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемых проб.
При отсутствии достоверных различий регистрируемых параметров ОАЭ в опыте и контроле вычисление СБА не производится.
Обработку результатов измерений параметров ОАЭ производят путем расчета среднеарифметического значения величины соответствующего показателя по формуле:
Рn
=(P1
+P2
+…Pn
) / n,
где P1
+P2
+…Pn
- повторности проб,
Рn
- значение соответствующего тест - параметра
n – количество повторностей.
Величины P1
+P2
+…Pn
получают не менее чем из 10 параллельных измерений (n ³ 10) контроль - опыт в короткий промежуток времени.
Оценка достоверных различий результатов измерений регистрируемых показателей ОАЭ в контроле и опыте осуществляют по непараметрическому критерию Манна – Уитни [11]. С целью нивелирования индивидуальных различий исследуемых показателей, показатели, измеренные в контроле, принимают за 1.
16.1 Контроль качества оценки биологического активности проводят по определению чувствительности тест - реакции (параметров обратимой агрегации эритроцитов) к модельному "эталонному" токсиканту. Установление метрологических характеристик погрешности методики биотестирования в лабораторных условиях производится в соответствии с [8].
Регулярно проводимая проверка позволяет выявить ошибки при приготовлении исследуемых смесей и растворов, нарушения, допускаемые в условиях проведения опытов.
16.2 Процедура оценки погрешности методики.
Исследования проводят с использованием двухромовокислого калия K2
Cr2
О7
в качестве стандартного токсиканта [12]. С этой целью на дистиллированной воде готовят маточный раствор K2
Cr2
O7
в концентрации 1 ± 0,01 мг/см3
. Навеску 0,1 г K2
Cr2
O7
помещают в мерную колбу на 100 см3
и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, тщательно перемешивают и доводят до метки. Затем готовят рабочий раствор модельного токсиканта 0,1±0,002 мг/см3
разведением дистиллированной водой основного раствора в 10 раз.
16.2.1 В стандартном анализе отбирают в пробирку типа Эппендорф 45.0 микролитров стабилизированной гепарином крови лабораторных животных, добавляют исследуемый объект – рабочий раствор модельного токсиканта в количестве 5.0 микролитров. Смесь перемешивают стеклянной палочкой и через 10 минут измеряют значения показателей ОАЭ в опытной пробе. Измерение значений параметров ОАЭ в контрольной
пробе проводят аналогично п. 14.1.2.
16.3 Должно происходить достоверное
изменение хотя бы одного из регистрируемых показателей ОАЭ по сравнению с контролем. В случае если достоверных
изменений регистрируемых параметров ОАЭ по сравнению с контролем не наблюдается, то следует проверить точность приготовления исследуемых растворов или условий проведения опытов.
Форма регистрации условий и результатов биотестирования
ПРОТОКОЛ №_ определения степени биологического активности экстрактов торфов и сапропелей с использованием агрегатов эритроцитов крови лабораторных животных (таблица 1)
Таблица 1
№ п.п.
Параметр
Значение
1.
Наименование организации:
2.
Наименование пробы и место отбора
3.
Метереологические условия: (температура и влажность воздуха, направление и сила ветра, атмосферное давление)
Кост Е. А. / Ред./ Справочник по лабораторным методам исследования. - М., Медицина, 1975. - 384 с.]
3.
Меньшиков В. В. /Ред./ Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Меньшиков В. В., Делекторская Л. Н., Золотницкая и др., Под ред. В. В. Меньшикова. - М., Медицина, 1987. - 368 с.
4.
Кондрахин И.П., Курилов Н.В., Малахов А.Г., и др. Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии. Справочное издание – М.: Агропромиздат, 1985. – 287 с.
5.
Левтов В. А., Регирер С.А., Шадрина Н.Х. Реология крови. - М., 1982.- С. 105-112.
6.
Жмур Н.С. Государственный и производственный контроль токсичности вод методами биотестирования в России. - М.: Международный Дом Сотрудничества, 1997. - 115 с.
7.
Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов. Министерство природных ресурсов Российской Федерации, РЕФИА, НИА - Природа, М., 2002, 117 с.
8.
Сидоренко Е. Методы математической обработки в психологии. - СП-б.: Речь, 2004. – 350 с.