Хроническое заболевание печени и гепатоцеллюлярная карцинома, ассоциированные с хронической hbv-инфекцией, представляют собой серьезнейшую проблему для здоровья человека, особенно в высокоэндемичных регионах. - реферат

Иммунотерапия хронического гепатита В анти-HBV вакцинами: от настоящего к будущему.

M.-L. Michel ^{a, *} , S. Pol ^b , C. Brechot ^c , P. Tiollais ^a

^a Unite´ de Recombinaison et Expression Ge´ne´tiqu e, INSERM U 163, Institut Pasteu r, 75724 Paris Ce´dex 15, France

^b Se r6ice d ’He´patologi e, Hoˆ pital Necker Enfants Malade s, 75730 Paris Ce´dex 15, France

^c INSERM U 370, Institut Necke r, CHU Necker Enfants Malade s, 75730 Paris Ce´dex 15, France

Реферат

Хроническое заболевание печени и гепатоцеллюлярная карцинома, ассоциированные с хронической HBV-инфекцией, представляют собой серьезнейшую проблему для здоровья человека, особенно в высокоэндемичных регионах. Существующие на сегодняшний день способы терапии хронического гепатита с помощью интерферона-a и ламивудина не приносят желаемых результатов. Вакцинация могла бы выступать в качестве достаточно эффективной терапевтической процедуры, имеющей к тому же более низкую стоимость. В настоящее время исследование на животных моделях, а также клинические испытания проходят вакцины на основе антигенов оболочки и капсида HBV с целью изучения их иммуногенности в плане индукции или расширения Т- и В-клеточного иммунного ответа, дефицит которого наблюдается у хронических носителей HBV. © 2001 Elsevier Science Ltd.

Ключевые слова: Гепатит В; Иммунотерапия; ДНК вакцина

1. Введение

Инфекция, вызываемая вирусом гепатита В (HBV) – одно из наиболее часто встречаемых инфекционных заболеваний. По последним оценкам число хронических HBV-носителей в мире составляет 350 миллионов человек [1]. У пациентов с хроническим гепатитом В существует высокая вероятность развития цирроза печени, который, в свою очередь, часто становится причиной смерти от гепатоцеллюлярной карциномы или некарциноматозных осложнений (портальная гипертензия или печеночная недостаточность) [2, 3].

В большинстве случаев исходом острого гепатита В у взрослых является спонтанное и полное выздоровление. Только небольшой процент (3-5%) HBV-инфицированных взрослых становятся хроническими носителями поверхностного антигена (HBsAg), который является маркером хронической инфекции. В отличие от взрослых, до 90% детей, рожденных HBV-инфицированными матерями, или детей, зараженных в первые годы жизни, становятся хронически больными [4].

Одна треть пациентов с хронической HBV-инфекцией является здоровыми носителями, в то время как у двух других – развивается хроническое заболевание печени.

В настоящее время единственным способом терапии, оказывающим стойкий эффект, является систематическое лечение интерфероном-a; однако на a-интерферонотерапию “отвечает” только одна треть пациентов с хроническим гепатитом В [3]. Терапевтической альтернативой служат нуклеозидные аналоги, такие как ламивудин, приводящие к быстрому снижению уровня HBV ДНК в сыворотке и улучшению гистопатологической картины в печени. Однако, кратковременное лечение приводит к быстрому рецидиву заболевания, а результатом длительного курса часто является селекция резистентных вариантов вируса [5]. Таким образом, очевидной является необходимость разработки новых терапевтических подходов.

HBV – нецитопатогенный вирус, и повреждения печени в основном опосредованы иммунологическими реакциями хозяина, направленными против вирус-инфицированных клеток печени, а также действием воспалительных цитокинов. Мощный поликлональный и мультиспецифический ответ цитотоксических (CTL) и хелперных T-клеток (Th) на HBV чаще всего регистрируется в периферической крови пациентов с острым самоограничивающимся гепатитом В, в то время как у больных с хронической формой инфекции иммунный ответ слабый, антиген-рестриктированный или вообще не выявляется [6] (см. Рис.1). Считается, что Т-клеточный ответ играет основную роль в элиминации вируса или контроле за HBV. Более того, было показано, что при хроническом гепатите В, в противоположность тому, что наблюдается при острой HBV-инфекции, продукция Th1 цитокинов (g-IFN) вслед за антигенной стимуляцией Т-клеток на периферии очень слабая или отсутствует [7-9] (см. Рис.1). Таким образом, можно предположить, что активация Т-клеточного ответа преимущественно по Th1 пути представляет собой эффективную стратегию, способствующую избавлению от хронической HBV-инфекции.

Специфические иммунотерапевтические способы усиления или расширения дефективного Т-клеточного ответа у хронически инфицированных больных могут стать альтернативой интерферонотерапии или применению антивирусных препаратов.

Рис.1 Связь иммунного ответа с исходом HBV-инфекции.

Специфическая вакцинотерапия с использованием либо доступных на сегодняшний день рекомбинантных анти-HBV вакцин [10], липопептидных Т-клеточных вакцин, индуцирующих нуклеокапсид-специфический CTL-ответ, либо вновь разрабатываемых генетических вакцин [12, 13] изучалась в экспериментах на животных моделях и в клинических исследованиях (см. Рис.2).

Рис.2 Новые направления в терапии хронической HBV-инфекции. Доступные на сегодня методы лечения (интерферон-a и ламивудин) могут быть объединены с новыми иммунотерапевтическими страгегиями.

2. Иммунотерапия с использованием рекомбинантных анти-HBV вакцин

Используя трансгенных мышей (Tg), экспессирующих HВsAg в печени, как модель асимптоматического хронического HBV-носительства, мы обнаружили, что иммунизация может приводить к функциональной толерантности к HВsAg путем индукции специфического иммунного ответа [14]. Полученные данные легли в основу пробного клинического исследования, в результате которого нам удалось показать, что специфическая вакцинотерапия стандартными анти-HBV вакцинами способствует снижению репликации HBV у 50% хронических вирусоносителей [15, 16]. Проведенное нами мультицентровое контролируемое исследование выявило и сильные и слабые стороны этого подхода. В исследовании принимали участие 118 “наивных” пациентов, ранее не получавших анти-HBV терапии, в сыворотке которых стандартным жидким гибридизационным методом было показано присутствие HBV ДНК; диагноз хронического гепатита был подтвержден результатами биопсии. В течение 12 месяцев участвующим в исследованиях больным 5 раз внутримышечно вводили 20 mg PreS2/S (GenHevac B ® Pasteur-Me´rieux) (группа C, n=47) или S вакцины (Recombivax® Merck, Sharp and Dhome) (группа B, n=34). Контрольная группа (группа А, n=37) состояла из больных, не получавших никакого лечения. На шестом месяце исследования, т.е. через три месяца после первых трех инъекций вакцины, процент отрицательных результатов при исследовании сыворотки на наличие HBV ДНК был выше в группах, прошедших вакцинотерапию, (15.5%) по сравнению с контролем (2.7%) (р – 0.038, c² тест Пирсона), особенно у пациентов с виремией перед началом лечения ³200 pg/ml ( ни одного в контрольной группе против 16.7% в провакцинированных) (р = 0.025) и низкой «отвечаемостью» на a-IFN. Через год (5 инъекций вакцины) различий по этому критерию не наблюдалось, однако вакцинотерапия привела к значительному снижению вирусной нагрузки в интервале между 6 и 12 месяцем (р = 0.04), в отличие от контроля. Уровень HBe/анти-HВe сероконверсии не отличался статистически достоверно в вакцинированных и не вакцинированных группах, однако раннее исчезновение HBeAg и появление анти-HВe через шесть месяцев после начала терапии наблюдалось только у вакцинируемых пациентов (8 и 15% в группах В (Recombivax®) и С (GenHevac B ®), соответственно, по сравнению с 0% в контроле).

Кроме того, во время этого исследования мы анализировали вакцин-индуцируемый иммунный ответ у 40% больных хроническим гепатитом В [10]. Вакцинация вызвала пролиферативный ответ мононуклеаров периферической крови (PBMC) у 7 из 27 пациентов, получавших HВsAg, и ни у одного из не получавших. Эти реакции, специфические по отношению к антигену оболочки (нами были обнаружены по крайне мере три различных эпитопа), опосредуются CD4+Т-лимфоцитами. HBV-специфические Т-лимфоциты продуцировали g-IFN и принадлежали к Th1-подтипу. Снижение уровня HBV ДНК в сыворотке этих пациентов позволяет предполагать, что индукция CD4+Т-клеточного ответа в ходе вакцинотерапии хронической HBV-инфекции может играть существенную роль в контроле над виремией. Таким образом, мы впервые получили прямые доказательства (в ходе контролируемого исследования) того, что HBV-вакцины могут снижать HBV репликацию, однако эффективность современных вакцин ограничена. Предметом будущих исследований должны стать различные схемы иммунизации, в том числе включающие различные нуклеозидные аналоги, что позволит объединить иммуномодуляторное и антивирусное направление терапии.

3. Т-клеточные вакцины в терапии хронического

гепатита В

Еще один терапевтический подход с использованием Т-клеточной вакцины для лечения больных хроническим гепатитом В, разрабатывался Heathcote at al.[17]. Вакцина представляет собой липопептид, состоящий из ковалентно связанных компонентов: цитотоксического Т-клеточного эпитопа, полученного из сердцевинного белка HBV (18-27 аминокислоты), Т-хелперного эпитопа, выделенного из столбнячного токсоида, и двух молекул пальмитиновой кислоты. В исследованиях с участием 26 здоровых людей была продемонстрирована безопасность вакцины и ее способность индуцировать первичный HBV core-специфичный CTL-ответ [11]. Была построена дозо-зависимая кривая, и пять из пяти испытуемых “ответили” на самую высокую дозировку (500 mg). В пробном исследовании вакцина вводилась 19 пациентам с хроническим гепатитом В с целью инициировать in vivo CTL -реакцию, ответственную за клиренс вируса [17]. Вакцинация самой высокой дозой (5 mg за 6 инъекций) вызывала ответную реакцию CTL, которая была в 10 раз слабее аналогичной у здоровых испытуемых [18]. Никаких значительных изменений в “печеночной”биохимии или вирусной серологии (HВeAg, a-HВeAb, HBV-ДНК) не наблюдалось. Представляет интерес тот факт, что также не было отмечено серьезных побочных эффектов. В целом, введение одно-эпитопной вакцины инициирует активность CTL у хронических носителей HBV, однако в значительно меньшей степени, чем у пациентов, выздоровевших после перенесенной острой HBV-инфекции. Было сделано предположение, что нарушение функции хелперных Т-лимфоцитов, ассоциированное с хронической HBV-инфекцией, возможно является причиной неудачных попыток индуцировать с помощью вакцины стойкий и эффективный CTL-ответ у хронически инфицированных больных. Было обнаружено, что секреция Th1-лимфокинов - g-IFN и IL-12 – снижается с одновременным повышением продукции Th0/Th2-лимфокина – IL-5 [19]. Последние исследования показали, что антивирусная терапия (ламивудин) может восстанавливать функции Th-клеток у пациентов с хронической HBV-инфекцией [20]. Эти данные говорят в пользу комбинированного подхода к терапии с использованием либо специфических, либо неспецифических иммуностимуляторов (IL-12, IFN-g) и антивирусных препаратов для восстановления нарушенной Th функции.

4. ДНК вакцины и HBV-инфекция

Недавно нами было разработано новое направление вакцинотерапии HBV-инфекции, основанное на внутримышечном введении плазмидной ДНК, кодирующей HBV-антиген [21, 22]. Так называемые “ДНК-вакцины” вызывают иммунный ответ против антигенов, синтезируемых in vivo после непосредственного введения ДНК, кодирующих антигенные последовательности. Этот новый подход к иммунизации позволит избежать недостатков традиционного «антигенного» подхода и обеспечит безопасность и эффективность профилактических и терапевтических вакцин.

Систематическая иммунизация мышей путем внутримышечного введения плазмидной ДНК, экспрессирующей белки оболочки HBV и HВsAg, индуцирует быстрый, мощный и стойкий гуморальный и клеточный иммунный ответ. Антитела, первоначально IgM, а затем IgG изотипов (преимущественно IgG2a), распознают несколько В-клеточных эпитопов, представленных на S, preS2 или preS1 доменах белков оболочки [22, 23]. Высокие титры анти-HBs наблюдаются к 4-8 неделе и сохраняются в течение, по меньшей мере, 17 месяцев после однократной ДНК-инъекции, в то время как второе введение вакцины приводит к их десятикратному увеличению. Несколько слабее эффект оказывает введение рекомбинантного HВsAg [24]. ДНК-иммунизация приводит к развитию мощного клеточного иммунного ответа с высоким уровнем CTL и их предшественников, выявляемых уже через неделю и сохраняющихся в течение нескольких месяцев [25, 26]. ДНК-вакцины выступают также в качестве собственных адьювантов, благодаря присутствию бактериальных CpG мотивов, обладающих иммуностимуляторными свойствами. Подобные последовательности, присутствующие в плазмидном каркасе, активируют Th1-лимфоциты с преобладающим синтезом IL-12 и g-IFN и незначительной секрецией Th2-цитокинов [27].

Иммунизация мышей, трансгенных по HLA A2.1 и с “выключенными” (knock-out) молекулами класса I MHC, ДНК, кодирующей HВsAg, показала, что эпитопы, присутствующие после процессинга in vivo у HLA A2 Tg мышей очень близки тем, что появляются у человека в ходе HBV-инфекции [30].

Благодаря эндогенному синтезу антигена, процессированию в соответствующие эпитопы и индукции CD8+ CTL ДНК-вакцины могут использоваться для лечения больных хроническим гепатитом В. В качестве модели для изучения возможности с помощью ДНК-вакцин индуцировать иммунный ответ у хронических HBV-носителей мы использовали Tg, экспрессирующих HВsAg только в печени. Исследуемые трансгенные мыши секретировали в огромном количестве HВsAg без образования антител и заметной печеночной патологии. Используя плазмидную ДНК, кодирующую малый и средний поверхностные белки HBV, мы добились появления анти-HBs антител у Tg мышей, которые в свою очередь способствовали клиренсу циркулирующего HВsAg. Элиминация антигена, носящая стойкий характер, коррелировала также со снижением уровня или исчезновением информационной HBV РНК из печени [28]. Эксперименты по переносу фракционированных HВsAg-примированных спленоцитов, полученных от ДНК-иммунизированных мышей, Tg мышам показали, что и CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты в состоянии контролировать трансгенную экспрессию даже в отсутствии антител. Результаты, полученные в экспериментах с мышами, трансгенными по HВsAg, с “выключенным” геном рецептора для g-IFN показали, что регуляция матричной РНК оболочки HBV осуществляется цитокинами 1 типа, продуцируемыми активированными Т-лимфоцитами [29].

Полученные результаты указывают на возможность разработки более эффективных способов предупреждения и терапии HBV-инфекции. Однако, немало базовых вопросов, касающихся вакцинотерапии, еще не имеет ответов, например безопасность введения ДНК-вакцин и потенциально возможные побочные эффекты от чрезмерно сильной цитотоксической реакции, направленной против инфицированных клеток печени.

5. Заключение

Цель исследований, описанных выше, состоит в создании терапевтической вакцины против персистирующей HBV-инфекции, что представляет огромное значение для людей, имеющих хронические заболевания печени с высоким риском развития гепатоцеллюлярной карциномы. Вакцинация, таким образом, может стать достаточно эффективной терапевтической процедурой, имеющей к тому же более низкую стоимость. Так как хронические носители – это основной источник распространения инфекции, контроль над заболеванием в их среде будет способствовать контролю над HBV-инфекцией в целом.

Цитируемая литература

[1] Lee WM. Hepatitis B virus infection. New Engl J Med 1997;337:1733–45.

[2] Hoofnagle JH, Lau D. New therapies for chronic hepatitis B. J Viral Hepat 1997;4:41–50.

[3] Hoofnagle JH, di Bisceglie AM. The treatment of chronic viral hepatitis. New Engl J Med 1997;336:347–56.

[4] Peters M, Vierling J, Gershwin ME, Milich D, Chisari FV, Hoofnagle JH. Immunology and the liver. Hepatology 1991;13:977–94.

[5] Lai CL, Chien RN, Leung NW, Chang TT, Guan R, Tai DI, Ng KY, Wu PC, Dent JC, Barber J, Stephenson SL, Gray DF. A one-year trial of lamivudine for chronic hepatitis B. Asia Hepatitis Lamivudine Study Group. New Engl J Med 1998;339:61–8.

[6] Chisari FV. Hepatitis B virus immunopathogenesis. Annu Rev Immunol 1995;13:29–60.

[7] Bertoletti A, D’Elios MM, Boni C, De Carli M, Zignego AL, Durazzo M, Missale G, Penna A, Fiaccadori F, Del Prete G, Ferrari C. Different cytokine profiles of intraphepatic T cells in chronic hepatitis B and hepatitis C virus infections. Gastroenterology 1997;112:193–9.

[8] Jung MC, Hartmann B, Gerlach JT, Diepolder H, Gruber R, Schraut W, Gruner N, Zachoval R, Hoffmann R, Santantonio T, Wachtler M, Pape GR. Virus-specific lymphokine production differs quantitatively but not qualitatively in acute and chronic hepatitis B infection. Virology 1999;261:165–72.

[9] Penna A, Del Prete G, Cavalli A, Bertoletti A, D’Elios MM, Sorrentino R, D’Amato M, Boni C, Pilli M, Fiaccadori F, Ferrari C. Predominant T-helper 1 cytokine profile of hepatitis B virus nucleocapsid-specific T cells in acute self-limited hepatitis B. Hepatology 1997;25:1022–7.

[10] Couillin I, Pol S, Mancini M, Driss F, Brechot C, Tiollais P, Michel ML. Specific vaccine therapy in chronic hepatitis B: induction of T cell proliferative responses specific for envelope antigens. J Infect Dis 1999;180:15–26 published erratum appears in J. Infect. Dis. 1999 Nov;180(5):1756.

[11] Vitiello A, Ishioka G, Grey HM, Rose R, Farness P, LaFond R, Yuan L, Chisari FV, Furze J, Bartholomeuz R, et al. Development of a lipopeptide-based therapeutic vaccine to treat chronic HBV infection. I. Induction of a primary cytotoxic T lymphocyte response in humans. J Clin Invest 1995;95:341–9.

[12] Donnelly JJ, Ulmer JB, Shiver JW, Liu MA. DNA vaccines. Annu Rev Immunol 1997;15:617–48.

[13] Michel M-L. Les vaccins a` base d’ADN. Virologie 1997;1:283– 90.

[14] Mancini M, Hadchouel M, Tiollais P, Pourcel C, Michel M-L. Induction of anti-hepatitis B surface antigen (HBsAg) antibodies in HBsAg transgenic mice: a possible way of circumventing ‘nonresponse’ to HbsAg. J Med Virol 1993;39:67–74.

[15] Pol S, Driss F, Michel M-L, Nalpas B, Berthelot P, Brechot C. Specific vaccine therapy in chronic hepatitis B infection. Lancet 1994;344:342.

[16] Pol S, Couillin I, Michel ML, Driss F, Nalpas B, Carnot F, Berthelot P, Brechot C. Immunotherapy of chronic hepatitis B by anti HBV vaccine. Acta Gastro-Enterol Belg 1998;61:228–33.

[17] Heathcote J, McHutchison J, Lee S, Tong M, Benner K, Minuk G, Wright T, Fikes J, Livingston B, Sette A, Chestnut R. A pilot study of the CY- T-cell vaccine in subjects chronically infected with hepatitis B virus. The CY1899 T Cell Vaccine Study Group. Hepatology 1999;30:531–6.

[18] Livingston BD, Crimi C, Grey H, Ishioka G, Chisari FV, Fikes J, Chesnut RW, Sette A. The hepatitis B virus-specific CTL responses induced in humans by lipopeptide vaccination are comparable to those elicited by acute viral infection. J Immunol 1997;159:1383–92.

[19] Livingston BD, Alexander J, Crimi C, Oseroff C, Celis E, Daly K, Guidotti LG, Chisari FV, Fikes J, Chesnut RW, Sette A. Altered helper T lymphocyte function associated with chronic hepatitis B virus infection and its role in response to therapeutic vaccination in humans. J Immunol 1999;162:3088–95.

[20] Boni C, Bertoletti A, Penna A, Cavalli A, Pilli M, Urbani S, Scognamiglio P, Boehme R, Panebianco R, Fiaccadori F, Ferrari C. Lamivudine treatment can restore T cell responsiveness in chronic hepatitis B. J Clin Invest 1998;102:968–75.

[21] Davis HL, Michel M-L, Whalen RG. DNA based immunization for hepatitis B induces continuous secretion of antigen and high levels of circulating antibody. Hum Mol Genet 1993;2:1847–51.

[22] Michel M-L, Davis HL, Schleef M, Mancini M, Tiollais P, Whalen RG. DNA-mediated immunization to the hepatitis B surface antigen in mice: aspects of the humoral response mimic hepatitis B viral infection in humans. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:5307–11.

[23] Mancini M, Davis HL, Tiollais P, Michel M-L. DNA-based immunization against the envelope proteins of the hepatitis B virus. J Biotechnol 1996;44:47–57.

[24] Davis HL, Mancini M, Michel M-L, Whalen RG. DNA-mediated immunization to hepatitis B surface antigen: longevity of primary response and effect of boost. Vaccine 1996;14:910–5.

[25] Davis HL, Schirmbeck R, Reimann J, Whalen RG. DNA-mediated immunization in mice induces a potent MHC class I-restricted cytotoxic T lymphocyte response to the hepatitis B envelope protein. Hum Gene Ther 1995;6:1447–56.

[26] Loirat D, Li Z, Mancini M, Tiollais P, Paulin D, Michel ML. Muscle-specific expression of hepatitis B surface antigen: no effect on DNA-raised immune responses. Virology 1999;260:74–83.

[27] Sato Y, Roman M, Tighe H, Lee D, Corr M, Nguyen MD, Silverman GJ, Lotz M, Carson DA, Raz E. Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization. Science 1996;273:352–4.

[28] Mancini M, Hadchouel M, Davis HL, Whalen RG, Tiollais P, Michel ML. DNA-mediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface antigen chronic carrier state. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:12496–124501.

[29] Mancini M, Hadchouel M, Tiollais P, Michel ML. Regulation of hepatitis B virus mRNA expression in a hepatitis B surface antigen transgenic mouse model by IFN-gamma-secreting T cells after DNA-based immunization. J Immunol 1998;161:5564–70.

[30] Loirat D, Lemonnier FA, Michel ML. Multiepitopic HLA-A* 0201-restricted immune response against hepatitis B surface antigen after DNA-based immunization. J Immunol 2000;165:4748–4755.