Н.С. Морозкина, Н.С. Шпаковская

Иммунодиагностика Туберкулеза

Минск 2003

МИНИСТЕРСТВО Здравоохранения РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

Белорусский государственный медицинский университет

Кафедра фтизиопульмонологии

Н.С. Морозкина, Н.С. Шпаковская

Иммунодиагностика туберкулеза

Методические рекомендации

Минск 2003

УДК- 616-002.5-02:616.98 (075.8)

ББК – 55.4я73

Т81

А в т о р ы: канд. мед. наук, асс. Морозкина Н.С., канд. биол. наук, вед. научный сотрудник ГУНИИ пульмонологии и фтизиатрии Министерства здравоохранения Республики Беларусь Шпаковская Н.С.

Р е ц е н з е н т ы: научный руководитель отдела иммуноморфологических методов исследования НИИ ПиФ МЗ РБ, доктор мед. наук, Л.К. Суркова

Утверждено Научно-методическим советом университета в качестве методических рекомендаций _________ 2003 г., протокол № _____

Морозкина Н.С., Шпаковская Н.С.

Иммунодиагностика туберкулеза : метод. рекомендации. – Мн.: БГМУ. 2003 – 19 с.

Приводится краткое описание тестов оценки иммунного статуса человека. Излагаются отдельные варианты иммунологической реактивности больных туберкулезом в зависимости от формы и стадии болезни. Особое внимание уделяется методам иммунодиагностики туберкулеза.

Предназначается для студентов IV-V-VI курсов педиатрического, лечебного и медико-профилактического факультетов, а также для врачей-стажеров.

УДК- 616-002.5-02:616.98 (075.8)

ББК – 55.4я73

Белорусский государственный медицинский университет 2003г.

Общее время занятия: 3 часа

Мотивационная характеристика темы

Тема «Иммунодиагностика туберкулеза» является одним из разделов темы занятия: туберкулинодиагностика; методы определения специфической сенсибилизации организма; значение иммунологических тестов в диагностике, определении активности туберкулезного процесса и оценке эффективности лечения.

Современная диагностика любого инфекционного заболевания, в том числе и туберкулеза, основывается на обнаружении возбудителя болезни или его специфических маркеров (антигенов, антител). От сроков установления правильного клинического диагноза, назначения адекватного лечения зависят эффективность терапии, прогноз заболевания и часто - жизнь больного. Нередко общепринятый доступный комплекс клинико-рентгенологических и лабораторных исследований не позволяет выявить туберкулезную этиологию процесса и провести дифференциальную диагностику туберкулеза. В таких случаях большую практическую ценность приобретают дополнительные специальные методы исследования, результаты которых подтверждают или отрицают предполагаемый диагноз. Среди этих методов важнейшими являются иммунологические.

Цель занятия : изучить современные методы иммунодиагностики туберкулеза.

Задачи занятия:

1. Закрепить знания по оценке иммунного статуса человека (тесты гуморального и клеточного иммунитета, факторы неспецифической резистентности).

2. Изучить методы иммунологической диагностики туберкулеза.

3. Изучить методы оценки противотуберкулезного иммунитета.

4. Изучить показания к проведению ИФА

5. Научиться давать клиническую оценку результатов иммунологических исследований различных сред организма у больных туберкулезом.

Требования к исходному уровню знаний

Повторить из патологической анатомии: особенности туберкулезного воспаления; нормальной анатомии: строение иммунной системы человека; иммунологии: иммунокомпетентные клетки, специфические, неспецифические факторы защиты, иммунологические реакции клеточного и гуморального типов.

Контрольные вопросы из смежных дисциплин

1. Центральные и периферические органы иммунной системы человека.

2. Лимфоциты, макрофаги, нейтрофилы: их субпопуляции, основные функции.

3. Этапы фагоцитоза.

4. Иммуноглобулины классов М, G, А, секреторный иммуноглобулин А , их биологическая функция.

5. Иммунологические реакции клеточного и гуморального типов.

6. Методы выявления антител в биологических жидкостях организма (РПК, РПГА, ИФА).

Контрольные вопросы по теме

1. Иммунокомпетентные клетки и их роль в противотуберкулезном иммунитете.

2. Гуморальный противотуберкулезный иммунитет.

3. Неспецифические факторы защиты организма от инфекции.

4. Тесты I и II уровня оценки иммунного статуса человека.

5. Цели иммунологических исследований во фтизиатрии.

6. Характеристика нарушений иммунитета у больных туберкулезом.

7. Влияние нарушений иммунного статуса больного на течение туберкулезного процесса, прогноз заболевания.

8. Методы иммунодиагностики туберкулеза.

9. Провокационные тесты с антигеном возбудителя в иммунодиагностике туберкулеза (ИФА, РПК, РПГА, РТМЛ).

Учебный материал

Иммунная система – это система контроля, обеспечивающая индивидуальность и целостность организма за счет способности отличать собственные структуры от генетически чужеродных, перерабатывать и элиминировать последние. Иммунная система обеспечивает прежде всего защиту организма от инфекции. Ключевым этапом в развитии иммунного ответа являются представление распознавание чужеродного антигена (АГ) иммунокомпетентными клетками.

Центральным звеном в проявлении резистентности к возбудителю туберкулеза (МБТ) являются СД4⁺ Т -лимфоциты, специфически сенсибилизированные к микобактериальным АГ (антигенным компонентом МБТ, индуцирующим ГЗТ, являются белки; полисахариды и жиры такое действие не оказывают). Вместе с тем, Т -лимфоциты не действуют непосредственно на МБТ. СД4⁺ Т -лимфоциты активируют фагоцитозную и бактериоцидную активность макрофагов, а СД8⁺ Т -клетки способны оказывать прямое цитотоксическое действие на клетки, инфицированные МБТ. Эффекторным звеном противотуберкулезной резистентности служат макрофаги.

Туберкулез – классический пример хронического инфекционного заболевания, протекающего с внутриклеточным (в макрофагах) паразитированием МБТ; микобактерии размножаются и гибнут именно в макрофагах. Защитные системы этих клеток лишь ингибируют размножение микроорганизмов, поскольку МБТ, располагаясь внутриклеточно, уклоняются от разрушения лизоцимами, радикалами и реактивными производными азота.

Взаимодействие макрофагов с МБТ неспецифическое и требует иммунологического усиления. Такое усиление активности макрофагов контролируется Т -лимфоцитами посредством синтезируемых ими медиаторов. Сенсибилизированные Т -лимфоциты стимулируют миграцию макрофагов в очаги воспаления, повышают фагоцитарную активность и ингибицию МБТ внутри макрофагов.

При распространенных формах туберкулеза выявляется дефект антигенспецифического Т -клеточного ответа Это проявляется в угнетении пролиферации периферических Т- лимфоцитов, снижении содержания Т -хелперных лимфоцитов I типа и интенсивности продуцирования ими интерлейкина-2, g -интерферона при стимуляции ППД. Это предопределяет развитие регуляторной, а при углублении патологического процесса – и структурно-функциональной вторичной иммунной недостаточности клеточного типа. Иммунодефициты у больных, при распространенном и прогрессирующем течении патологического процесса, связаны с цитолизом (некрозом) иммунокомпетентных клеток (макрофагов и СД4⁺ Т- лимфоцитов). Не последнюю роль при этом играет апоптоз лимфоцитов (запрограммированная гибель клеток), особенно СД4⁺ .

Иммунный статус больных туберкулезом

Изучать иммунный статус (ИС) больных туберкулезом необходимо для решения ряда практических задач, в частности, для:

1.Диагностики и дифференциальной диагностики туберкулеза.

2.Определения активности процесса и прогноза заболевания.

3.Контроля за эффективностью лечения.

4.Выявление глубины нарушений иммунитета с целью иммунокоррекции.

ИС человека можно охарактеризовать комплексом информативных показателей, отражающих состояние различных звеньев системы иммунитета в момент исследования при конкретном заболевании. Оценка ИС организма заключается в поиске основного дефекта, который может локализоваться в различных звеньях лимфоидной системы (Т - и В- лимфоцитах и их субпопуляциях, медиаторах, иммуноглобулинах, в мононуклеарно-фагоцитарной системе, в факторах комплемента и др.). Оценку ИС проводят в два этапа.

На первом этапе (уровне) выявляются обобщенные характеристики или грубые дефекты (ориентирующие тесты).

К тестам первого уровня оценки Т-системы иммунитета (клеточного звена) можно отнести определение:

- общего числа лимфоцитов (N-18-38%, при общем количестве лейкоцитов 4,5-9,5х10⁹ /_л );

- процентного и абсолютного числа зрелых Т -лимфоцитов (СД3⁺ ), это фенотипическая характеристика иммунокомпетентных клеток с помощью моноклональных антител к соответствующим антигенам (N-50-76%, 800-1216/мкл);

- двух основных субпопуляций - хелперов/индукторов (СД4⁺ ) и киллеров/супрессоров (СД8⁺ ).

Применяется также тест розеткообразования с бараньими эритроцитами (Е-РОК) и определение Е-РОК активных (N-ЕРОКа-30-40%).

К тестам первого уровня оценки В-системы иммунитета (гуморального звена) можно отнести определение:

- процента и абсолютного количества В -лимфоцитов (СД 20⁺ , N-11-16%, 200-400/мкл) в тесте розеткообразования с эритроцитами мыши;

- иммуноглобулинов классов G , A , M - в сыворотке крови (норма 8,0-16,0; 1,0-4,0; 0,6-1,9 ^г /_л соответственно);

- Ig Е (N-20-100 КЕ/л);

- секреторного Ig А - в слюне и бронхоальвеолярных смывах.

К тестам первого уровня для оценки фагоцитоза можно отнести определение:

- числа нейтрофилов (N-50-77%) и моноцитов (N-2-10%);

- интенсивности поглощения микробов нейтрофилами и моноцитами (фагоцитарный показатель нейтрофильных гранулоцитов, N-48-88%);

- бактерицидности - по тесту восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест, N-70-120 ед/млнклеток, N-10-20% формазанположительных нейтрофилов).

На первом этапе определяются также циркулирующие иммунные комплексы -ЦИК (N 20-80 усл. ед.), уровень комплемента по 50%-ному гемолизу (N - 56-66 гемолитических единиц).

На втором этапе (уровне) выявляют механизм поломок в иммунной системе, определенных на первом этапе.

К тестам второго уровня для оценки Т-системы иммунитета (функциональная активность) можно отнести определение:

- g -интерферона;

- фактора некроза опухоли (a-ФНО);

- содержание активационных молекул на поверхностной мембране Т -лимфоцитов (СД 25⁺ - с рецепторами к ИЛ-2, N –13-24%, HLA - Д R );

- пролиферативную активность на Т -митогены – ФГА и КонА в реакции бласттрансформации и на специфический антиген;

- содержание цитокинов – ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6.

На втором этапе проводят также кожные пробы с антигенами.

К тестам второго уровня для оценки В-системы иммунитета можно отнести определение:

- субклассов иммуноглобулинов, особенно IgG ;

- секреторного IgA ;

- специфических антител; способности клеток к пролиферативному ответу на В-митогены (липополисахарид).

Среди методов оценки фагоцитоза к тестам второго уровня можно отнести также определение хемотаксиса фагоцитов, экспрессии адгезии молекул на поверхностной мембране нейтрофилов.

К тестам второго уровня относят и определение компонентов комплемента (С Iq , С3, С3а, С4, С5а, С1 ингибитора).

Оценку иммунного статуса больного надо начинать, прежде всего с квалифицированной интерпретации клинического анализа крови. При этом следует обратить внимание на относительное и абсолютное содержание иммунокомпетентных клеток в 1 мкл периферической крови (для лимфоцитов – не ниже 1500-2000 клеток, нейтрофилов - не ниже 2000-2500, моноцитов – не менее 90).

Если количество лимфоцитов снижено, необходимо перейти к обследованию больного по тестам первого уровня. Только когда отмечается несоответствие между клинической картиной и нормальными значениями тестов первого уровня или возникает необходимость назначить иммунорегуляторные препараты, нужно использовать тесты второго уровня.

Нарушение иммунитета у больных туберкулезом

В клинической картине туберкулеза доминируют нарушения Т -клеточного иммунитета.

Таблица

Нарушения иммунологической реактивности и их влияние на течение туберкулезного процесса

Изучение иммунного статуса и неспецифической реактивности больных туберкулезом показало, что при активном прогрессирующем распространенном процессе с распадом легочной ткани и бактериовыделением имеют место: депрессия Т -клеточного иммунитета, сдвиг соотношения СД4/СД8 в сторону уменьшения, повышение интенсивности продуцирования ИЛ I, ФНО-a, ИЛ-6, подавление клеточного противотуберкулезного иммунитета, активация процесса продуцирования противотуберкулезных антител. При благоприятном течении туберкулеза, абациллировании, при закрытии полостей распада увеличивается соотношение СД4/СД8 , снижается интенсивность продуцирования макрофагальных интерлейкинов и антител, увеличивается продуциролвание g-ИНФ, при этом специфический клеточный иммунитет активируется.

У больных остропрогрессирующими формами туберкулеза в развитии казеозного распада существенную роль может играть иммунодефицит. Для последнего характерны структурно-метаболические нарушения в иммунокомпетентных клетках и их апоптоз, ведущие к резкому снижению в крови количества Т -лимфоцитов, их регуляторных субпопуляций и снижение функциональной и синтетической способности Т -лимфоцитов. Одним из патогенетических механизмов прогрессирования данной формы туберкулеза являются также структурно-метаболические повреждения клеток моноцитарно-макрофагальной системы. Это ведет к резкому снижению их функции, жизнеспособности, быстрому разрушению в зоне поражения, в результате чего в легких формируются обширные казеозно-деструктивных изменения.

При нарушениях Т -клеточного и специфического клеточного противотуберкулезного форм иммунитета повышается риск развития послеоперационных осложнений, существенно увеличивается число случаев перехода впервые выявленного инфильтративного туберкулеза в хронический фиброзно-кавернозный туберкулез.

Супрессия иммунного ответа при туберкулезе представляет собой сложный процесс, в котором участвуют макрофаги и Т -лимфоциты (вероятно, и В -лимфоциты, и иммунные комплексы), действующие в разных ситуациях на различные этапы иммуногенеза. В тех случаях, когда имеют место нарушения Т -клеточного иммунитета, введение иммунокорригирующих средств (Т-активина, левамизола, тимозина, диуцифона, ронколейкина, ликопида, рибомунила и др., действующих преимущественно на Т -клеточный иммунитет), восстанавливает нормальное функционирование Т -системы и вместе с тем оказывает положительное влияние на течение туберкулезной инфекции.

Иммунодиагностические тесты

Современная диагностика туберкулеза, как и любого другого инфекционного заболевания, основывается на обнаружении в разных средах организма больного возбудителя болезни, в данном случае МБТ видов humanis или bovis (это - прямое доказательство заболевания туберкулезом) или специфических маркеров к возбудителю – антигенов либо антител. Однако бактериологическая диагностика при всех ее усовершенствованиях не дает больше 50% положительных результатов даже у бесспорно больных туберкулезом.

Иммунодиагностика представляет собой самостоятельный раздел иммунологии, основной целью которого служит выявление изменений клеточного и гуморального звеньев иммунитета при инфицировании и заболевании туберкулезом с помощью соответствующих методов.

«Прямым» методом иммунодиагностики туберкулеза выявляют антигены МБТ, причем как целые МБТ (иммунологическими методами), так и растворимые, например, циркулирующие в крови, антигены.

Специфическим, но «не прямым», методом выявляют иммунный ответ организма человека на воздействие МБТ (как клеточный, так и гуморальный). С той же целью применяют так называемые туберкулино-провокационные тесты, подкожно вводят туберкулин и изучают различные показатели до и после провокации. Сама провокация - сугубо иммунологический фактор, так как ее результат может быть положительным только в сенсибилизированном организме.

Определение состояния клеточного иммунитета с помощью клинических и функциональных тестов «само по себе» (без провокации) в дифференциально-диагностическом плане также используется в определенных ситуациях. Например, при округлых образованиях в легких: при туберкулезе депрессия Т- системы, как правило, выражена в меньшей степени, чем при новообразованиях; при аденопатиях внутригрудных лимфатических узлов и легочных диссеминациях важно учитывать более существенную депрессию Т -клеточного иммунитета у больных саркоидозом, чем туберкулезом. В то же время провокационные тесты мало подходят для массовой диагностики туберкулеза из-за технических сложностей и необходимости проведения повторного (через 48 и/ или 72 часа) исследования, что очень трудно осуществить при обследовании больших контингентов, тем более «здоровых» людей. При скрининговом обследовании взрослых сегодня можно использовать только ИФА (из методов микроанализа с автоматизированным учетом).

При иммунодиагностике туберкулеза необходимо различать два ее основных аспекта: 1) скрининг населения с целью выявления лиц с подозрением на туберкулез для последующего их дообследования и 2) дифференциальную диагностику туберкулеза. Последнее является важной и сложной практической проблемой, во-первых, потому, что известен целый ряд заболеваний, клинико-рентгенологическая симптоматика которых сходна с таковой туберкулеза; во-вторых, вакцинация БЦЖ, а также инфицирование атипичными микобактериями и другими микроорганизмами, имеющими перекрестные антигены с МБТ, затрудняют интерпретацию ее результата. При скрининг-диагностике важнейшее значение имеет чувствительность метода, при дифференциальной диагностике главное – высокая специфичность метода.

Серологические реакции

Серологические реакции направлены на поиск специфических противотуберкулезных антител (ПТАТ). Они применяются с диагностической и дифференциально-диагностической целью.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) : противотуберкулезные гемагглютинины, (АТ преимущественно класса Ig M ), взаимодействуют с туберкулином, адсорбированным на эритроцитах барана или человека; в результате образуется комплекс «антиген - антитело», вследствие чего происходит агглютинация эритроцитов, что поддается визуальной оценке. При отсутствии АТ эритроцитов не склеиваются. Диагностический титр РНГА для взрослых > 1:8++, для детей >1:4++; РНГА чаще бывает положительной при процессах продуктивного характера.

Реакция пассивного гемолиза (РПГ): выявляются гемолизины, АТ - преимущественно класса IgG , иногда - IgM . В результате реакции образуется комплекс антиген – антитело – комплемент, что обусловливает лизис эритроцитов-носителей, который оценивается колориметрически. Диагностический титр РПГ для взрослых - 8 у.е; для детей – 5 у.е. Гемолизины чаще обнаруживаются при деструктивных процессах.

Реакция потребления комплемента (РПК): выявляются комплементсвязывающие АТ - главным образом IgG . РПК ставят в два этапа: на первом происходит фиксация комплемента, на втором (при добавлении гемолитической системы) – лизис и фиксация степени потребления комплемента на первом этапе. Диагностический уровень ПТАТ в РПК для взрослых 17 у.е.; для детей - 11 у.е.

Полноценная диагностика туберкулеза основана на одновременной постановке и комплексном учете результатов всех трех реакций (РНГА+РПГ+РПК). Частота обнаружения с помощью данного комплекса специфических АТ варьирует в пределах от 30 до 80%, специфичность метода около 85 - 90%.

ИФА

Современным и перспективным методом серодиагностики туберкулеза является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Он применяется для выявления АГ МБТ и спектра АТ к ним. Обнаружение АТ к возбудителю туберкулеза в ИФА основано на их специфическом взаимодействии с иммобилизованным туберкулезным АГ.

Показания к проведению ИФА:

1.Диагностика и дифференциальная диагностика туберкулеза (диагностика этиологии шаровидных, очаговых, инфильтративных и полостных образований легких).

2.Выявление скрытой активности туберкулеза.

3.Выявление реактивации туберкулеза у лиц с остаточными посттуберкулезными изменениями.

4.При скрининговом обследовании на туберкулез.

5.При обследовании лиц из группы риска по заболеванию туберкулезом, подвергшихся воздействию радиации.

6.Выявление этиологической значимости смешанной инфекции у больных туберкулезом (бактериальной, грибковой).

Положительный результат ИФА означает, что в образце содержатся антитела к МБТ. Однако в ряде случаев могут иметь место ложно-положительные результаты из-за наличия общих антигенных детерминант у различных возбудителей. Отрицательный результат означает отсутствие в образце антител к МБТ. Если отрицательный результат получен при тестировании образца сыворотки больного с клиническими проявлениями туберкулеза, необходимо провести повторный анализ в динамике (через месяц). Отсутствие в сыворотке больных антител может объясняться нахождением их в составе циркулирующих иммунных комплексов.

Положительные реакции сыворотки в ИФА при скрининговых исследования не являются основным показателем для постановки диагноза «туберкулез». Однако лица с положительной реакцией подлежат углубленному обследованию на туберкулез.

Иммунологические методы исследования бронхоальвеолярного смыва

Бронхоальвеолярный смыв (БАС) является высокоинформативным материалом на основе клеточных элементов, иммунных, белковых, липидных и сурфактантных компонентов. Он использовался для изучения процессов, происходящих в легких при развитии заболевания, а также при дифференциальной диагностике болезней органов дыхания и определении их активности.

Общее количество клеток в норме в БАС составляет 0,55 - 0,83х10⁶ в/мл. Они представлены в основном альвеолярными макрофагами (85 - 98%), жизнеспособность которых составляет 63,6±5,6%. На долю лимфоцитов в БАС приходится 7 - 12%, нейтрофилов – около 1%.

При туберкулезе легких значительно повышено содержание нейтрофилов; при саркоидозе характерен лимфоцитоз (чем активнее процесс, тем выше процентное содержание лимфоцитов), при неспецифических воспалительных заболеваниях - увеличение общего количества клеток в БАС и содержания нейтрофилов на фоне снижения уровня альвеолярных макрофагов до 20 - 40%; при экзогенном аллергическом альвеолите – значительное возрастание общего количества клеток, в том числе лимфоцитов.

При исследовании бронхоальвеолярного смыва с целью диагностики, выявления нарушений и дисбаланса в местном иммунном ответе, а также дифференциальной диагностике туберкулеза проводят следующие тесты:

1. Подсчет общего количества Т -лимфоцитов (СД3 ⁺ , Е-РОК), Т -хелперов (СД4+), Т -супрессоров (СД8 +).

2. Определение уровня сывороточных иммуноглобулинов (IgA , Ig , M , IgG )

3. Определение уровня секреторного IgA , ( SIg ,А )

4. Определение содержания фибронектина (ФН)

5. Выявление противотуберкулезных антител (ПТАТ)

6. Выявление иммунных комплексов (ИК)

Иммунологические показатели БАЛ здоровых лиц: Т -лимфоциты 70 - 88%; Т -хелперы (СД4⁺ ) – 50%, Т -супрессоры (СД8⁺ ) 28 - 30%, соотношение Т-х/Т-с (СД4⁺ / СД8 ⁺ )- 1/1,5-2; содержание Ig в среднем: IgA - 2 г/л; Ig , M - 0-8 г/л; Ig - 6 - 8 г/л, секреторного IgA , 2 - 2,5 г/л, ФН –60-80 нг/мг.

При активном туберкулезе легких в БАЛ отмечаются снижение общего количества Т- лимфоцитов, СД4 +, СД8 +кл, уровня сывороточных иммуноглобулинов, в значительной мере - уровня секреторного IgA ; выявляются специфические АТ к возбудителю туберкулеза.

В процессе комплексной химиотерапии заметно нарастает содержание sIgA и ФН.

При саркоидозе возрастает общее количество Т -лимфоцитов и Т -хелперов, причем при активном процессе соотношение Т -хелперов и Т -супрессоров увеличивается в 3-4 раза больше.

Задания для самостоятельной работы студентов

1. По представленным учебным историям болезни оценить иммунный статус больных различными клиническими формами туберкулеза.

2. По представленным учебным историям болезни определить степень влияния нарушений иммунологической реактивности на клиническое течение туберкулеза органов дыхания.

3. Назначить оптимальную схему обследования больного туберкулезом с использованием тестов первого уровня оценки иммунного статуса.

4. Назначить схему дообследования больного туберкулезом с использованием тестов второго уровня.

5. По представленным учебным историям болезни оценить местный иммунитет больного туберкулезом органов дыхания по результатам исследования БАС.

ЛИТЕРАТУРА

Основная

1. Перельман М.И., Корякин В.А . Фтизиатрия: Учебник для студентов медицинских вузов. – М.,1996.

Дополнительная

Туберкулез: