| Введение
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ИДЭ- -индекс деформируемости эритроцитов
ИАЭ -индекс агрегации эритроцитов
В- -относительная вязкость суспензии эритроцитов
ВП -вязкость плазмы
ВСЭ -вязкость внутреннего содержимого эритроцитов
Д -средний диаметр эритроцитов
МГК - максимум гемолизированных клеток
ВМГ - время наступления максимума гемолиза
ПГ - продолжительность гемолиза
НЬ -количественное содержание гемоглобина в клетках
Htc -показатель гематокрита
-6-
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы
Проблема структурной и функциональной изменчивости в жизненном цикле клетки является одной из актуальнейших проблем современной клеточной биологии. Анализ современного состояния литературы указывает на большое число работ, посвященных изучению структурно-функциональных свойств эукариотических клеток на отдельных этапах их жизненного цикла [28,50,82,83,85].
Особое место в ряду таких работ занимают исследования эритроцитов, как клеток высоко специализированной активности [104,111,178]. Интерес к изучению кровяных телец обусловлен рядом факторов: 1) важностью выполняемой ими функцией в жизнедеятельности многоклеточных организмов, в том числе организма человека; 2)вовлечённостью эритроцитов в патогенез многих заболеваний; 3)относительной простотой строения, позволяющей изучать функцию и структуру мембран красных клеток; 4) доступностью эритроцитов в большом количестве для работы, а также доступностью их отделения от других клеток.
При изучении клеточных мембран красных кровяных телец используются разнообразные методы [119,130,140,146]. Особое место среди них занимает исследование реологических свойств эритроцитов [68,103,128,148], изменчивость которых оказывает существенное влияние на выполняемые ими жизненно важные функции, а также является одним из патогенетических факторов в формировании многих тяжёлых заболеваний, таких как,
-7-
сахарный диабет, гипертоническая болезнь, лейкемия, гемолитическая анемия, ишемическая болезнь сердца, ожоги и шоки различной этиологии [13,27,40,107,147,231]. В литературе имеются многочисленные данные о влиянии изменчивости реологических свойств эритроцитов на симптоматику заболеваний, формирование клинической картины, а также о роли реологических характеристик в контроле эффективности лечения больных [121,160,218,230].
Следует отметить, что при наличии большого числа работ по изучению реологических свойств эритроцитов в норме [31,68,158] и при патологии [59,63,65,192,201], исследования динамики этих свойств в жизненном цикле клетки по сути не проводились, хотя очевидным является тот факт, что результаты таких исследований могли бы способствовать более корректной оценке изменчивости реологических характеристик при патологии, более оптимальному влиянию на формирование количественных характеристик реологических свойств, обеспечивать эффективный контроль за лечением и
определением его тактики.
Отсутствие в доступной нам литературе данных по оценке динамики реологических свойств на различных этапах жизненного цикла эритроцита, а также их значимость в понимании процессов, происходящих в жизненном цикле красных кровяных телец, побудили нас к проведению настоящего исследования.
-8-
Цель исследования:
Оценить изменчивость реологических свойств эритроцитов человека в процессе их жизненного цикла и изучить вклад генетических и средовых факторов в её формирование.
Задачи исследования:
1.Изучить реологические свойства красных клеток крови у человека в общей эритроцитарной популяции и оценить особенности их взаимосвязей между собой.
2.Провести оценку изменчивости реологических характеристик на различных возрастных этапах жизни кровяных телец и изучить возрастную динамику сопряжённости этих характеристик.
3.Оценить связь устойчивости отдельных белков клеточной мембраны эритроцитов с изменчивостью реологических свойств клеток в процессе их жизнедеятельности.
4.Установить вклад наследственности и среды в формирование реологических свойств эритроцитов.
5.Определить изменчивость соотносительной роли наследственности и среды в детерминации реологических свойств кровяных телец на различных этапах их функционирования в кровеносном русле.
Научная новизна работы.
Впервые проведена оценка характера взаимного варьирования реологических свойств эритроцитов в выборках человека, различающихся по полу и по возрасту. Определена оценка изменчивости этих свойств на различных возрастных этапах жизни кровяных телец и изучена возрастная динамика их сопряжённости. Установлена связь устойчивости отдельных
-9-
белков клеточной мембраны эритроцитов с изменчивостью реологических свойств клеток в процессе их жизнедеятельности. Впервые проведена оценка роли генетических и средовых компонент в формировании общих фенотипических дисперсий количественных показателей реологических характеристик эритроцитов. Изучена роль генетических факторов в детерминации этих характеристик и определена выраженность взаимосвязей между ними.
Практическая значимость работы.
Полученные результаты формируют представления о реологических свойствах эритроцитов на различных этапах их функционирования в кровеносном русле, открывая перспективы для более глубокого изучения изменения функциональной активности клеток в процессе их старения. Получены новые знания о соотносительной роли среды и наследственности в формировании количественных показателей реологических свойств эритроцитов человека. Результаты работы могут быть использованы как показатели нормы в практической медицине при проведении дифференциальной диагностики заболеваний, связанных с клеточной патологией.
На основе полученных данных возможна разработка научно-обоснованных методических рекомендаций при изучении курсов физиологии, биофизики, цитологии, медицинской генетики в высших медицинских и биологических заведениях.
Положения, выносимые на защиту
1. Количественные показатели реологических свойств эритроцитов общего пула характеризуются статистически значимыми взаимосвязями различной степени выраженности.
-10-
Структура этих взаимосвязей обладает статистически достоверной мерой сходства среди родственников I степени генетического родства.
2. Реологические свойства эритроцитов в процессе их жизнедеятельности характеризуются увеличением вязкости клеток и количественного содержания в них гемоглобина, ослаблением гемолитической резистентности, усилением агрегации и вязкости внутреннего содержимого клеток, а также снижением деформируемости, уменьшением диаметра эритроцитов. При этом, возрастная динамика сопряжённости реологических характеристик проявляется в ослаблении и дезинтеграции взаимосвязей.
3. Динамика показателей вязкости и деформируемости эритроцитов при температурной денатурации спектрина имеет свои статистические особенности на каждом из этапов жизненного цикла клеток. Стабилизация белка полосы 3 оказывает существенное влияние на повышение детергентустойчивости клеток средней фракции.
4. Соотносительная роль генетических и средовых факторов в формировании фенотипических дисперсий реологических свойств красных клеток крови меняется в процессе их жизнедеятельности, что выражается в усилении влияния средовой компоненты на заключительной стадии жизненного цикла эритроцитов. Между генетическими факторами, обеспечивающими контроль за формированием количественных показателей реологических свойств эритроцитов человека, установлена достаточно выраженная сопряжённость, которая сохраняется на протяжении всего
-11-
жизненного цикла клеток, за исключением показателя продолжительности гемолиза кровяных телец.
Апробация работы и публикации
Результаты работы доложены на конференции студентов и молодых ученых (Курск,2002, 2004 гг.), на 58-й межвузовской конференции молодых ученых и студентов
(Екатеринбург,2003г.), на межвузовской конференции молодых ученых (Томск,2004г.), на 3-й Всероссийской конференции молодых ученых по медицине (Тула,2004г.), на межкаферральном совещании сотрудников КГМУ (2004г.), межлабораторном семинаре сотрудников КГСХА (2004г.)
По материалам диссертации опубликовано 9 работ. Объём и структура диссертации
Работа изложена на 164 страницах машинописного текста, иллюстрирована 35 таблицами, 1 рисунком; состоит из введения, 6 глав, обсуждения и выводов. Список литературы включает 238 источника, в том числе 148 источников зарубежной литературы.
-12-
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Морфофункциональная характеристика эритрона в
норме
Важная роль в изучении изменчивости структурно- функциональных свойств эукариотических клеток в их жизненном цикле отводится исследованию эритроцитов. Именно эти кровяные тельца служили объектом ранних исследований, в результате которых сформировались представления о структурной организации клетки. В настоящее время эритроциты широко используются для проверки и доказательств новых идей и гипотез клеточной биологии. Кроме того, проблема структурно- функциональной изменчивости эритроцитов привлекает ученых в связи с установлением различных нарушений в строении и количественном соотношении белковых компонент мембран, приводящих к наследственным заболеваниям. Так, современные данные указывают на вовлеченность клеточных мембран в патогенез ряда наследственных патологий: гемолитической анемии [20,67,113], миодистрофии [16], псориаза [77], гипертонической болезни [34,223] и других.
Эритроциты циркулируют в кровеносном русле в течение 120 дней (в среднем), после чего они выводятся из кровотока. Эритропоэз представляет собой постоянный и непрерывный процесс образования и восстановления клеток эритрона, главной функцией которых является снабжение тканей кислородом. Эри-трон — совокупность всех эритроидных клеток костного мозга и крови. Эта клеточная система выполняет высокоспециализированную функцию переноса кислорода из альвеолярного воздуха
-13-
в ткани и включает в себя 4 категории клеток: 1) ядросодержа-щие эритроидные клетки костного мозга; 2) ретикулоциты костного мозга; 3) ретикулоциты крови; 4) зрелые эритроциты [21,57,64].
Клеточная основа эритропоэза состоит из дифференциации, пролиферации и созревания эритроидных предшественников в костном мозге с последующим выходом эритроцитов в циркуляцию крови[89,181,182,206,229].
Продолжающееся на протяжении всей жизни организма обновление клеток эритрона контролируется механизмами регуляции, которые поддерживают динамически устойчивое эритроци-тарное равновесие. Центральное место в регуляции эритропоэза занимает эритропоэтин - почечный гормон гликопротеиновой природы [168,181,182,210]. Инициируя синтез всех классов РНК, специфических для эритрона, эритропоэтин действует так же, как и другие «классические» гормоны, приводя к образованию белков, составляющих структурную и функциональную основу эритроидных клеток [181,229].
Белки в мембранах эритроцитов распределены особым образом, обеспечивая осуществление эритроцитарной мембраной основных функций. В связи со способом расположения макромолекул в мембране эритроцита белки подразделяют на периферические и интегральные[6,24,34,55,119].
Интегральные белки характеризуются высоким содержанием неполярных аминокислотных остатков, с помощью которых они удерживаются в мембране за счет сил гидрофобного взаимодействия с жирнокислотными цепями фосфолипидного матрикса [6,84,153]. В состав интегральных белков входят гликопротеины
-14-
и протеолипиды [55,86]. Гликопротеины - белки, к определенным аминокислотным остаткам которых присоединены олигоса-харидные цепи. Размеры углеводной цепи колеблются от диса-харидного звена до структур, содержащих 18 моносахаридов и более. В количественном отношении представленность углеводов также различна: от 5-8% (белок полосы 3) до 60% (гликофо-рин А) [34]. Углеводные цепи гликопротеинов играют важную роль в формировании антигенной структуры мембран эритроцитов. Протеолипиды взаимодействуют с липидным слоем более прочно, чем гликопротеины. Функции интегральных белков многообразны: они выступают в роли гидролитических ферментов, рецепторов клеточной поверхности, окислительно-восстановительных компонентов транспортной системы электронов и в качестве белков-переносчиков [234,236,237].
Периферические белки по аминокислотному составу напоминают «водорастворимые» и удерживаются в мембране относительно слабыми нековалентными связями , не вступая с липида-ми в гидрофобные взаимодействия. Основная часть периферических белков эритроцитов входит в состав цитоскелета, который представляет собой двумерную сеть, соединенную непосредственно с мембраной эритроцита через взаимодействие с интегральными белками [24,84,88]. Кроме того, к периферическим белкам относится ряд эритроцитарных ферментов [6,34,86].
Эритроцитарные мембраны проявляют функциональную и структурную ассиметричность [3,6,34]. На поверхности мембраны эритроцита находятся центры связывания биологически активных веществ, таких как инсулин, соматотропный гормон, В-адренэргические агенты, простагландины [1,24,55,86], что сви-
-15-
детельствует об участии мембраны эритроцита в передаче сигналов, поступающих от организма.
Важнейшими функциями мембран эритроцитов являются также барьерная и транспортная [4,5,6,26]. В цитоплазме эритроцитов в больших количествах содержится гемоглобин, карбо-ангидраза, ферменты гликолитического цикла, органические соединения и неорганические ионы, состав которых в эритроцитах значительно отличается от состава плазмы [1,3,84,88].
Форма эритроцитов и их реологические свойства (деформируемость, способность к агрегации) играют важную роль в процессах переноса кровью кислорода и углекислого газа между легкими и тканями [2,31,42,68,128].
Находясь постоянно в одной и той же окружающей среде, эритроциты в то же время в течение своего жизненного периода испытывают различные по своей природе механические воздействия, что требует от их мембраны прочности и гибкости. Это предполагает, что механические свойства эритроцитарной мембраны регулируются. Считается, что эластичность и прочность мембраны в основном определяется свойствами белков эритроцитов, формирующих цитоскелет. Именно взаимодействие цито-скелетных белков могут быть мишенями при регулировании реологических свойств эритроцитарной мембраны [106,114,140,148,172]. Такими механизмами, влияющими на взаимодействие белков, могут быть фосфорилирование, изменение уровня внутриклеточного магния и 2,3-дифосфоглицерата, окислительно- восстановительного потенциала, а также действие кальмодулина, связанное с повышением уровня кальция [165,166].
-16-
Белок-белковые взаимодействия между отдельными полипептидами мембраны эритроцита позволяют организоваться им в упорядоченную структуру- мембранный скелет, связанный с фосфолипидным матриксом через белок полосы 3. Цитоскелет эритроцитов состоит из периферических белков, расположенных на цитоплазматической стороне мембраны. Молекулы спектрина, образуя длинные гибкие стержни длиной 100-200 нм, связываются с микрофиламентами актина [34,55]. В стабилизации взаимодействия спектрина с актином принимают участие белок полосы 4.1 и белок полосы 4.9 [6,24].
Клеточный скелет способствует сохранению формы эритроцитов, а также обеспечивает значительную гибкость, позволяющую клетке проходить через капилляры, соответствующие ее собственному диаметру [1,3,88]. Так, спектрин, взаимодействуя с интегральными белками эритроцитов, регулирует деформа-бельность мембраны, [31,34,84,148,237]. Количество белка анки-рина определяет степень изгиба цитоскелета, а, следовательно, и ригидность клеток. Через взаимодействие белка 4.1 с гликофо-ринами и цитоскелетом осуществляется регулирование механической стабильности и эластичности эритроцита [88]. Цитоплаз-матический домен белка полосы 3, включающий около 380 аминокислотных остатков, играет важную роль в поддержании формы красной клетки крови и его метаболизма [114,119,236]. Белок полосы 4.2-паллидин определяет поддержание формы эритроцита и его механические свойства [1,6,34,84].
В тонкой мембранной оболочке (не более 100 нм) мембранные белки высоко концентрированы. Упорядоченность структуры достигается оптимальным соотношением метаболитов (в ос-
-17-
новном АТФ) и содержанием одновалентных (К+ и Na+) и двухвалентных (Са2 и Mg2) катионов [86]. Понижение концентрации АТФ внутри эритроцита до уровня ниже 15% от нормального вызывает также структурные перестройки мембранного скелета, нарушающие его функционирование и реологические свойства [55].
Фосфорилирование анкирина и белка полосы 4.1 уменьшает сродство этих белков к спектрину и, таким образом, ослабляет связь спектрин-актиновой сети с мембраной, а также актин-спектриновое взаимодействие. Дефосфорилирование белков, которое происходит при истощении запасов АТФ, напротив, усиливает эти взаимодействия [6,24].
Процесс старения эритроцита - это процесс комплексный и затрагивает практически все компоненты этих клеток. Старение сопровождается изменением активности метаболизма, ионного и водного состава клетки, изменением функциональных и структурных свойств мембраны [95,109,111,117,213]. Многие исследователи первопричину гибели эритроцитов видят в изменении поверхностной структуры мембраны, что приводит к распознаванию и разрушению таких «старых» клеток макрофагами и лимфоцитами [109,112,116]. В связи с этим отмечается важная роль в мембране сиаловой кислоты, содержание которой уменьшается с возрастом эритроцита [120,149]. В литературе приводятся сведения о том, что на эритроцитарной мембране появляются в ходе старения рецепторы, являющиеся фрагментами анкирина. К ним прикрепляются иммуноглобулины класса G, которые способствуют фагоцитозу эритроцитов макрофагами
|