«Совершенствование иммуноферментной диагностики туберкулеза» Работа выполнена в отделе новый технологий нииэм имени Пастера в 2008 г., научный руководитель Вербов В. Н. Содержание - реферат

Литературный обзор из дипломной работы студентки Санкт-Петербургского государственного технологического института Васильевой Е.В. на тему «Совершенствование иммуноферментной диагностики туберкулеза»

Работа выполнена в отделе новый технологий НИИЭМ имени Пастера в 2008 г., научный руководитель Вербов В.Н.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

1. Микобактерии туберкулеза

2. Методы диагностики туберкулеза

2.1 Бактериологические методы

2.2 Молекулярно – генетические методы

3. Иммуноферментный анализ

3.1 Общие этапы в различных вариантах ИФА ……………………………21

3.2 Компоненты ИФА…………………………………………………..……25

3.3 Специфичность и чувствительность ИФА………………………………38

3.4 Использование рекомбинантного антигена ESAT-6 в твердофазном ИФА……………………………………………………………………………….

Заключение

Список использованных источников

ВВЕДЕНИЕ

Туберкулез легких в настоящее время продолжает оставаться одной из наиболее острых социально-экономических проблем, без решения которой нельзя прогнозировать положительное развитие государственных стратегических программ (Перельман с соавт., 2006). Анализ эпидемиологической ситуации показывает, что заболеваемость туберкулезом в нашей стране носит характер эпидемии(Онищенко Г.Г., 2002). В России показатель заболеваемости туберкулезом всего населения в 2006 году составил 83,1 на 100 000 населения, смертности – 19,5 на 100 000. Особую тревогу вызывает непрекращающийся рост заболеваемости и смерности от туберкулеза среди трудоспособного населения.

На данный момент существуют следующие методы диагностики туберкулеза:

1. Туберкулинодиагностика

2. Флюрография

3. Рентгенография

4. Бронхоскопия

5. Бактериологические методы

6. Молекулярно-генетические методы

7. Культивирование

8. ИФА

1.МИКОБАКТЕРИИ ТУБЕРКУЛЕЗА

Микобактерии туберкулеза (МБТ) – факультативные внутриклеточные паразиты. Относятся к семейству бактерий Micobacteriacae , порядку Actinomycetalis , роду Mycobacterium .

МБТ относятся к прокариотам; в их цитоплазме нет высокоорганизованных органелл (митохондрий, аппарата Гольджи, лизосом).

Форма - слегка изогнутая или прямая палочка 1—10 мкм × 0,2—0,6 мкм. Концы слегка закруглены. Обычно они длинные и тонкие, но возбудители бычьего вида более толстые и короткие. В зависимости от возраста, состава среды форма и размеры клетки могут меняться. МБТ неподвижны, не образуют эндоспор и капсул.

В бактериальной клетке дифференцируется:

1. микрокапсула — стенка из 3—4 слоев толщиной 200—250 нм, прочно связана с клеточной стенкой, состоит из полисахаридов, защищает микобактерию от воздействия внешней среды, не обладает антигенными свойствами, но проявляет серологическую активность;

2. клеточная стенка — ограничивает микобактерию снаружи, обеспечивает стабильность размеров и формы клетки, механическую, осмотическую и химическую защиту, включает факторы вирулентности — липиды, с фосфатидной фракцией которых связывают вирулентность микобактерий;

3. гомогенная цитоплазма;

4. цитоплазматическая мембрана — включает липопротеиновые комплексы, ферментные системы, формирует внутрицитоплазматическую мембранную систему (мезосому);

5. ядерная субстанция — включает хромосомы и плазмиды.

Белки (туберкулопротеиды) являются главными носителями антигенных свойств МБТ и проявляют специфичность в реакциях повышенной чувствительности замедленного типа. К этим белкам относится туберкулин. С полисахаридами связано обнаружение антител в сыворотке крови больных туберкулёзом. Липидные фракции способствуют устойчивости микобактерий к кислотам и щелочам .

Mycobacterium tuberculosis — аэробные, Mycobacterium bovis и Mycobacterium africanum — аэрофилы.

Микобактерии туберкулеза медленно растут на искусственных питательных средах (2-3 недели).

2.МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

Существуют различные методы диагностики туберкулеза. Далее будут рассмотрены некоторые из них.

2.1 Бактериологические методы

Микроскопия мазка

В соответствии с современными программами ВОЗ, основой выявления туберкулёза за рубежом считают проведение микроскопии мазков мокроты, полученной от кашляющих больных, обратившихся к врачам общей практики; мазки окрашивают по Цилю-Нильсену. Эта методика входит в отечественный поликлинический и клинический минимум обследования пациента, выделяющего мокроту. В 1995 г. Минздравмедпром России в приказе № 8 "О развитии и совершенствовании деятельности лабораторной клинической микробиологии (бактериологии) лечебно-профилактических учреждений" подтвердил эту обязанность клинико-диагностических лабораторий. Обязательное бактериологическое исследование мокроты на М. tuberculosis должно быть организовано для нетранспортабельных больных, больных хроническими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящей системы, а также для работников неблагополучных по туберкулёзу животноводческих хозяйств. Этот старейший метод полностью сохраняет свое значение вследствие доступности для практических клинико-диагностических лабораторий, низкой стоимости и быстроты выполнения .

При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 - 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии, что и является большим минусом этого метода. Только при идеальном выполнении всех требуемых условий, указанных в Приказе № 109 МЗ РФ,-исследование не менее трех проб диагностического материала, правильный сбор мокроты, наличие современного бинокулярного микроскопа и высококачественных реактивов, просмотр до 300 полей зрения – возможно повышение чувствительности до 10000 микробных клеток.

Микобактерии туберкулёза имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке (рисунок 1,а) Окрашенные по Цилю-Нильсену мазки микроскопируют с иммерсионной системой не менее 10 мин.

Люминесцентная микроскопия.

Метод основан на проникновении в микробную клетку карболового производного флюоресцентного красителя (аурамина, родамина). При окраске флюоресцентным красителем аурамином-родамином микобактерии можно видеть при неиммерсионном 100-кратном увеличении. Более точен результат при окраске по Цилю-Нильсену карболфуксином и иммерсионной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Именно окраска мазка по Цилю-Нильсену рекомендована при применении технологий DOTS. Микобактерии в этом случае выглядят светящимися желтыми палочками (рисунок 1, б). Метод имеет неоспоримые преимущества, так как позволяет при меньшем увеличении микроскопа просмотреть фактически весь мазок, так же этот метод экономически более эффективен, так как уменьшается время, затрачиваемое на просмотр мазков.

К недостаткам метода ЛМ следует отнести значительно более высокую стоимость люминесцентного микроскопа, при процедуре окрашивания- соблюдение и коррекция pH мазка, а также освобождение микобактерий в диагностическом материале (особенно в мокроте) от окружающей их слизи, которая препятствует проникновению флуоресцентного красителя в микробную клетку. Поэтому нецелесообразно использование ЛМ для нативной мокроты, но применять этот метод рекомендуется при исследовании мазков, приготовленных после центрифугирования из осадка материала, обработанного для культурального исследования и нейтрализованного после деконтаминации. Поэтому метод ЛМ следует применять в бактериологических лабораториях, где культуральное и микроскопическое исследование может быть произведено из одной и той же порции диагностического материала.

При гистологическом или цитологическом исследовании иногда можно обнаружить характерные для туберкулёза клетки, являющиеся результатом защитной реакции организма на внедрение туберкулёзной палочки. Наличие в цитограмме гигантских клеток Лангханса с несомненностью решает диагноз туберкулёза. Эти клетки имеют очень большие размеры (80 - 90 мкм и более в диаметре). Цитоплазма окрашена в серо-голубой цвет. По её периферии расположено в ряд большое количество ядер (до 20), расположенных в форме кольца (рисунок 1, в).

Другим признаком туберкулёза является присутствие в препарате так называемых эпителиоидных клеток, из которых и развиваются клетки Лангханса. Это происходит при увеличении количества ядер без разделения цитоплазмы, которая только увеличивается в размерах (рисунок 1, г).

Микроскопия позволяет быстро получить результат, но обладает низкой чувствительностью и специфичностью, невозможностью дифференциации кислотоустойчивых микобактерий.

а в

б г

Рисунок 1 – Микобактерии туберкулеза

а – метод окраски по Цилю-Нельсену

б – метод люминисцентной микроскопии

в – клетки Лангхаса

г – эпителиоидные клетки

Культуральный метод

Наиболее распространенным методом выявления микобактерий туберкулеза в нашей стране является культуральный метод. Это “золотой стандарт” бактериологической диагностики туберкулеза, так как чувствительность метода существенно выше микроскопического и дает возможность получить чистую культуру микобактерий для её последующей идентификации и исследования лекарственной устойчивости. Этот метод дает положительные результаты при наличии в исследуемом материале от 20 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл. Однако он трудоемок и длителен в связи с тем, что микобактерии туберкулеза растут очень медленно и их обнаружение может быть зарегистрировано только через 3 недели культивирования.

Исторически сложилось, что питательные среды на яичной основе (Левенштейна-Йенсена, Финна-2, Огавы, Аникина, ”Новая”, Попеску) получили наибольшее распространение среди плотных питательных сред, применяемых для выделения МБТ. Посев материала на среду Левенштайна-Йенсена проводят в бактериологической лаборатории. Рост первых колоний на классических средах отмечают через 4-8 недель. Однако появившиеся в последние годы агаровые среды Миддлбрука (7Н10, 7Н11) позволяют быстрее обнаружить рост микобактерий (от двух до четырех недель) и обеспечивают лучшие возможности для изучения морфологии колоний, чем на яичных средах. Недостатком агаризованных питательных сред является необходимость инкубации посевного материала в термостате с углекислым газом, поэтому агаризованные среды в России практически не применяются.

Следует отметить, что в связи с высокой избирательностью различных штаммов микобактерий и потребностью в полноценных белках до сих пор нет универсальной питательной среды, способной заменить все остальные. В Приказе № 109МЗ РФ для посева диагностического материала на МБТ рекомендуется использовать по одной пробирке международной питательной среды Левенштейна-Йенсена и Финна-2. Однако практика показывает, что кроме указанных сред целесообразно использовать и какую-либо из дополнительных, а посев на три пробирки питательной среды также повышает эффективность культуральной диагностики.

Для полноценной культуральной диагностики туберкулеза необходимо иметь соответствующие помещения и оборудование. Особенно важно наличие центрифуги и антиаэрозольной защитой и способностью обеспечить ускорение 3000g. А также шкафов биологической безопасности для предотвращения внутрилабораторного инфицирования.

Основным недостатком культуральной диагностики туберкулеза является длительность исследования – от трех недель до трех месяцев. Поэтому остаются актуальными дальнейшие исследования по разработке методов ускорения роста микобактерий.

Системы BACTEC

Культуральная диагностика туберкулеза переживает в настоящее время принципиальные изменения, связанные с внедрением в практику полностью автоматизированных систем культивирования МБТ. Главное отличие этих методов - применение жидких питательных сред для культивирования с последующей радиометрической (BACTEC 460), колорометрической

(Mb-Bact, Вас- tALERT) и люминесцентной детекцией роста (BACTEC MGIT 960). Рост МБТ на жидкой питательной среде в этих системах удается обнаружить уже через 1-2 недели в зависимости от их исходного количества в диагностическом материале. Частота выявления микобактерий так же несколько выше, чем на плотных питательных средах. Автоматизированные системы BACTEC с использованием соответствующих флаконов, содержащих различные противотуберкулезные препараты, позволяют сократить время исследования лекарственной устойчивости микобактерий до 10-14 суток.

Из перечисленных автоматизированных систем наиболее эффективна в настоящее время система BACTEC MGIT 960BD. Флаконы MGIT с жидкой питательной средой 7Н9 содержат в придонной части под силиконом флуоресцентный индикатор, “погашенный” высокими концентрациями кислорода. При наличии роста микобактерий в процессе поглощения кислорода индикатор начинает светиться, регистрация флуоресценции в сисиеме BACTEC MGIT производится автоматически. Использование флаконов MGIT возможно и “вручную”, тогда регистрацию свечения производят с помощью трансиллюминатора на флаконах MGIT составляет 11 суток.

Основным недостатком BACTEC MGIT, как и других систем BACTEC, является высокая стоимость оборудования (до 100000 долларов США) и флаконов с питательной средой – посев одной пробы диагностического материала стоит до 400 рублей .

Посев на L –формы микобактерий

Так называемые дефектные по клеточной стенке L-формы микобактерий и других инфекционных патогенов являются результатом изменчивости и основным видом персистирования, то есть переживания в неблагоприятных условиях. Посев на L-формы особенно эффективен при внелегочном туберкулезе, поскольку вегетация МБТ в очагах ВЛТ при повышенном ацидозе и анаэробиозе приводит к снижению их жизнеспособности и ферментативной активности.

Диагноз не может быть поставлен только на основании выявления L-форм микобактерий, но их обнаружение, особенно при верификации методом ПЦР, является весомым аргументом в пользу туберкулезной природы заболевания. В очагах внелегочного туберкулеза наблюдается ранняя L-трансформация микобактерий, поэтому их обнаружение позволяет поставить диагноз на начальных стадиях заболевания.

2.2 Молекулярно–генетические методы

К прямым методам обнаружения микобактерий туберкулеза можно отнести и бурно развивающиеся в последние годы подходы, сущность которых состоит в выявлении в исследуемых образцах диагностического материала специфических фрагментов цепи ДНК возбудите­ля. Среди применяемых для этого молекулярно-биологических методик наиболее широкое распро­странение получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), в основе которого лежит много­кратное увеличение числа копий специфического участка ДНК (так называемая направленная ам­плификация ДНК): 20 циклов ПЦР приводят к увеличению исходной ДНК в 1 миллион раз, что позволяет визуализировать результаты методом электрофореза в агарозном геле. Очень высокий уровень чувст­вительности (95 % и более), являющийся главным достоинством метода, достигается за счет того, что в результате многократного копирования уровень специфиче­ской олигонуклеотидной последовательности в ре­дакционной пробе возрастает в 106 раз. По своей чувствительности метод ПЦР при туберкулезе органов дыхания в два раза превосходит эффективность культуральной диагностики.

Метод особенно актуален для туберкулеза, по­скольку эффективен в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью, определение которых требует длительно­го культивирования или сложных питательных сред.

ПЦР-диагностика туберкулеза, как правило, строится на использовании последовательностей ДНК специфичных для всех 4 видов группы туберкулеза. Часто для этих целей используют праймеры для выявления последовательностей IS-элементов, например, IS-986 или IS-6110, поскольку данные мигрирующие элементы характерны только для видов микобактерий группы туберкулеза и присутствуют в геноме микобактерий в числе нескольких копий. Выделение ДНК из чистых культур и клинических образцов (мокроты больных) возможно осуществлять любым приемлемым методом, например, методом Boom с использованием лизирующего буфера на основе гуанидина, тиоционата и двуокиси кремния в качестве носителя ДНК.

Проведение ПЦР-диагностики туберкулеза

В качестве примера праймеров [49] для идентификации микобактерий группы туберкулеза можно привести праймеры, фланкирующие фрагмент размером 245 пар нуклеотидов мигрирующего элемента IS-986, содержащегося в геноме M.tuberculosis в числе 2-8 копий. Последовательно

Последовательность:

INS1 5' - CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC - 3'
INS2 5' - GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA - 3'

Амплифицированный фрагмент выявляют электрофорезом в 1,6 % агарозном геле.

Данная пара праймеров была проверена на специфичность с использованием в качестве контроля 100 нг/проба ДНК близкородственных микроорганизмов; ДНК возбудителей легочных заболеваний; ДНК микроорганизмов, входящих в микрофлору человека (например, E.coli,

S. aureus и др.); образцов ДНК человека.

Испытания данной пары праймеров с параллельным бактериоскопическим и культуральным обследоваванием были проведены на клинических образцах мокроты, полученных от больных с различными клиническими формами туберкулеза. Методом ПЦР возбудитель был выявлен у 90,6% больных туберкулезом, в то время как значительно более длительными по времени микробиологическими методами микобактерии были выявлены только у 39,6% больного.

Роль молекулярной диагностики в клинической практике повышается, поскольку увеличивается число больных со скудным бактериовыделением.

Однако применение метода ПЦР чревато полу­чением большого количества ложноположительных результатов, обусловленных как техническими по­грешностями, так и особенностями самого метода. Кроме того, метод не позволяет определять степень жизнеспособности выявляемых микобактерий.

Основным недостатком ПЦР является опасность лабораторной контаминации микобактериальной ДНК. Поэтому в настоящее время разработаны достаточно жесткие сертификационные требования для ПЦР-лабораторий, предусматриваюшие наличие трех изолированных помещений. ПЦР - это сложная современная технология, использование которой требует помимо соответствующей аппаратуры наличия высококвалифицированного персонала.

Таким образом, при постановке диагноза результаты ПЦР являются дополнительными и должны сопоставляться с данными клинического обследования, рентгенографии, микроскопии мазка, посева и даже ответа на специфическое лечение.

3 ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ

Среди других методов диагностики туберкулеза в некоторых регионах используют иммуноферментный анализ (ИФА), несущий информацию не о заболевании, а об инфицировании. ИФА выявляет антитела к микобактериям туберкулеза.

Это одно из наиболее интенсивно развивающихся направлений химической энзимологии. В твердофазном ИФА используется комбинация высокоспецифичной иммунологической реакции с чувствительным каталитическим действием ферментного маркера. Цель ИФА – выявление разнообразных веществ в крайне малых количествах (в концентрациях вплоть до 10^-21 молей в образце), в том числе антигенов болезнетворных микроорганизмов и антител к ним.

3.1 Общие этапы в различных вариантах ИФА

В твердофазном ИФА один из специфических реагентов иммобили­зуют на твердой фазе. Затем последовательно добавляют другие специ­фические реагенты, проводя после инкубации каждого из них промывку с целью удаления несвязавшихся компонентов. Один из специфических реагентов, так называемый конъюгат, содержит ферментную метку. По­этому ферментативная активность образовавшегося на твердой фазе спе­цифического комплекса будет пропорциональна концентрации каждого компонента этого комплекса, один из которых подлежит определению.

Разработанные варианты ИФА различаются типом твердой фазы и способами присоединения к ней первого специфического реагента, числом и последовательностью добавления остальных специфических реагентов, способом промывки твердой фазы, способом получения конъюгата, при­родой фермента в конъюгате, типом используемого субстрата, способом выражения результатов анализа и т. д. Тем не менее, в каждом варианте ИФА можно выделить следующие общие этапы:

- получение иммуносорбента;

- формирование многослойного комплекса на твердой фазе за счет последовательного проведения специфических реакций;

- удаление не специфически связавшихся компонентов, а также их избытка;

- получение ферментного конъюгата;

- измерение ферментативной активности специфического комплекса на твердой фазе;

- интерпретация результатов анализа.

Получение иммуносорбента

Присоединение первого специфического реагента к твердой фазе мо­жет осуществляться путем физической сорбции, ковалентного связывания или комбинированного использования этих подходов.

Методы физической сорбции. Физическая сорбция специфического реагента на твердой фазе происходит за счет гидрофобных, донорно-акцепторных взаимодействий или водородных связей. Основные недостатки методов физической сорбции: десорбция на последующих стадиях ана­лиза и малая величина сорбционной емкости.

Методы ковалентного связывания. В такие полимеры, как полистирол вводят новые реак­ционные группы типа амино-, гидразидо- или диазогрупп. Твердые фазы из нейлона или капрона подвергают частичному кислотному гидролизу, приводящему к образованию амидных групп. Суспензионные твердые фазы уже содержат реакционноспособные гидроксильные, амидные или карбо­ксильные группы. Ковалентное присоединение к ним специфического реа­гента, содержащего аминогруппы, может быть осуществлено с помощью таких реагентов, как глутаровый альдегид, бромциан, гидразин, 1,4-диэпоксипентан, дивинилсульфон, эпихлоргидрин, гидрохинон, периодат нат­рия, водорастворимые карбодиимиды и др. Основными преимуществами ковалентного связывания сле­дует считать более высокую воспроизводимость результатов и возмож­ность многократного использования иммобилизованной твердой фазы.

Методы комбинированной сорбции. При всей привлекательности методов химической сорбции они не получили широкого распространении из-за трудоемкости проведения. Поэтому в тех случаях, когда специфиче­ский реагент плохо сорбируется на твердой фазе, используют комбинацию физической сорбции вещества с высокой сорбционной способностью и про­стейших способов ковалентного присоединения к нему нужного специ­фического реагента.

Получение специфического комплекса на твердой фазе

После получения иммуносорбента к нему последовательно добавляют другие специфические реагенты, в результате чего на твердой фазе фор­мируется многослойный комплекс. Природа специфических реагентов мо­жет быть разной. Определяющими моментами на этих стадиях ИФА яв­ляются специфичность реакции, характеризующаяся величиной константы связывания, и кинетика процессов.

В ИФА основной специфической реакцией является взаимодействие антигена с антителом.

Антитела, или иммуноглобулины представляют собой белки, реагирую­щие с антигеном, который индуцировал их образование. Они состоят из 2 пар цепей, соединенных между собой дисульфидными связями. Внутри каждой пары (легкая L и тяжелая Н) цепи между собой идентичны. В зависимости от типа Н-цепей иммуноглобулины подразделяют на 5 классов. Легкие цепи делят на 2 типа, обозначаемые χ (капа) и λ (лямбда). Оба типа L-цепей входят в состав всех 5 классов иммуно­глобулинов. Такие классы как ИгГ(IgG), ИгД(IgD), ИгЕ(IgE) находятся в виде мономе­ров, ИгМ(IgM) встречается преимущественно в виде пентамера, а ИгА (IgA) - в виде моно-, ди- и тетрамеров. По результатам протеолиза такими ферментами, как папаин и пепсин, в иммуноглобулинах выделяют Fab- и Fc-фрагменты. Специфической активностью по отношению к антигену обладают Fab-фрагменты, Fc-участок отвечает за основные эффекторные функции антител.

Антигенами называются вещества или структуры, способные вызывать иммунный ответ. Как правило, антигены имеют многочисленные детерми­нанты (эпитопы); к которым специфичны активные центры Fab-фрагментов образующихся антител. Набор детерминант определяет специфичность антигена, а их число его валентность. Для антигенной специфичности бел­ков имеет значение их конформация. Изменение конформации при дена­турации белка приводит к потере некоторых детерминант. В основе взаи­модействия перекрестно реагирующих антител с антигенами лежит струк­турное сходство с детерминантами специфического антигена.

Прочность связи Fab-фрагмента с антигенной детерминантой называется аффиностью и определяется величиной константы равновесия данной реакции. Для поликлональной сыворотки эта величина будет различной для тех молекул антител, которые являются продуктами разных В-клеток. В случае моноклональных антител такие различия исчезают. Так как антитела многовалентны (от 2 для ИгГ до 10 для ИгМ), то для характеристики прочности связывания антител с соответствующим анти­геном вводят термин авидность. Она зависит от аффинности Fab-фрагментов и валентности антител.

Наряду с реакцией анти­ген–антитело, широкое распространение в ИФА получил белок А из-за своей способности специфически взаимодействовать с Fab-фрагментами многих иммуноглобулинов.

В последние годы широкое распростра­нение в ИФА получила реакция между биотином и авидином (стрептавидином), позволяющая осуществлять связь между различными компо­нентами специфического комплекса на твердой фазе.

В ИФА используется также специфи­ческая реакция между лектинами и углеводными остатками различных гликопротеинов.

Устранение неспецифических взаимодействий на этапе промывки

После каждого этапа инкубации специфического реагента с твердой фазой следует этап промывки. Ее цель заключается в получении моно-молекулярного слоя первого специфического реагента и устранении взаи­модействий реагент — твердая фаза после инкубации последующих реа­гентов, а кроме того, в уменьшении количества перекрестно реагирующих антигенов со специфическим реагентом.

В результате сорбции первого специфического реагента происходит образование вначале мономолекулярного слоя на твердой фазе, а затем многослойной сорбции за счет белок-белковых взаимодействий. Добавление в промывной раствор неионных детергентов типа твин-20 позволяет осуществлять эффективную конкуренцию между белок-белковыми взаимодействиями за счет взаимодействия белок-детергент. Это же взаимодействие уменьшает сорбцию белка на твердой поверхности после частичного разрушения мономолекулярного слоя. Так как все эти процессы равновесные, то для более полного устранения многослойной сорбции необходима многократная промывка твердой фазы.

3.2 Компоненты ИФА

Антигены, используемые в ИФА

В ИФА в качестве иммуносорбента используются, как уже говорилось выше, антигены. Одним из важных моментов при создании диагностического теста является определение его антигенной композиции. При этом, в зависимости от цели диагностики состав антигенов может быть различным.

Известно, что для полноценной и эффективной детекции антител при диагностике инфекционного заболевания, необходимо максимально имитировать антигенный состав нативного возбудителя.

Использование смеси, состоящей из нескольких белковых молекул, для сорбции иммунологических планшетов может приводить к определенным проблемам как биотехнологического, так и экономического характера (усложнение и, следовательно, удорожание процесса производства). Белки могут конкурировать за сорбционную поверхность, а также может происходить взаимодействие белков в реакционной смеси, что может приводить к экранированию части эпитопов. Кроме того, белковые молекулы могут требовать различных условий сорбции, обеспечивающих каждому антигену наиболее полную экспрессию всех эпитопов. Современные методы позволяют конструировать искусственные рекомбинантные молекулы, объединяющие различные антигенные эпитопы, локализованные в разных белках инфекционного агента и даже принадлежащие его разным штаммам. Компьютерный анализ позволяют оценивать пространственную структуру нативных вирусных белков и точно воспроизводить ее при дизайне искусственных молекул антигенов.

Применяемые в ИФА антигены делятся на две группы:

- синтетические

- рекомбинантные

Получение рекомбинантных белков

Технология рекомбинантных ДНК (генная инженерия) – это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала (ДНК) из одного организма в другой . Чаще всего эксперименты проводят по следующей схеме.

Из организма–донора нужных генов – экстрагируют нативную ДНК либо синтезируют химически. Соединяют ее с другой ДНК – вектор для клонирования – с образованием новой рекомбинантной молекулы. Эту конструкцию вводят в клетку-хозяина, где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией. Идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК. Получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.

Бактерия Escherichia coli — один из наиболее хоро­шо изученных организмов. За последние пятьде­сят лет удалось получить исчерпывающую инфор­мацию о генетике этого микроорганизма, молекулярной биологии, биохимии, физиологии и общей биологии. Это грамотрицательная непатогенная подвижная палочка длиной менее 1 мкм. Ее средой обитания является кишечник человека, но она также может высеваться из почвы и воды. Благодаря способности размножаться простым делением на средах, содержащих только ионы Na⁺ , K⁺ , Mg²⁺ , Са²⁺ , NH₄ ⁺ , Cl^- , НРО₄ ^2- и SO₄ ^2- , микроэлементы и источник углерода (например, глюкозу), Е.coli стала излюбленным объектом научных исследований.

Е.coli можно культивировать как в аэробных (в присутствии кислорода), так и в анаэробных (без кислорода) условиях. Однако для оптимальной продукции рекомбинантных белков Е.coli и другие микроорганизмы обычно выращивают в аэробных условиях. Если целью культивирования бактерий в лаборатории является синтез и выделение определенного белка, то культуры выращивают на сложных жидких питательных средах в колбах. Для обеспечения условий, оптимальных для максимальной продукции белков, конструируют специальные ферментеры и создают системы аэрации.

Плазмиды – это внехромосомные автономно реплицирующиеся двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК. Плазмиды есть практически у всех бактерий. Одни из них содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (F-плазмиды), другие несут гены устойчивости к антибиотикам (R-плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию необычных метаболитов (плазмиды деградации). Есть плазмиды, в которых не обнаружены гены, выполняющие какие-то определенные функции (криптические плазмиды; от англ, cryptic - скрытый, латентный). Размеры плазмид варьируют от менее 1 до более 500 т.п.н. Каждая из них содержит сайт начала репликации, без которого репликация плазмиды в клетке-хозяине была бы невозможна.

Некоторые плазмиды представлены в клетке 10-100 копиями; они называются высококопийными. Низкокопийные плазмиды присутствуют в клетке в числе 1 - 4 копий. На долю плазмидной ДНК обычно приходится 0,1—5,0% суммарной клеточной ДНК [38]. Если две или более плазмиды не могут сосуществовать в одной и той же клетке, то говорят, что они принадлежат к одной группе несовместимости. Плазмиды, относящиеся к разным группам несовместимости, беспрепятственно существуют в одной клетке, независимо от числа копий. У некоторых микроорганизмов в одной клетке было обнаружено до 8—10 разных плазмид, при этом каждая из них выполняла свои функции, была представлена характерным для нее числом копий и относилась к своей собственной группе несовместимости. Одни плазмиды несут специфичный сайт инициации репликации и могут реплицироваться только в клетках одного вида. У других плазмид этот сайт менее специфичен, и они реплицируются в самых разных бактериальных клетках. Соответственно различают плазмиды с узким и с широким спектром хозяев.

Как автономно реплицирующиеся генетические элементы плазмиды обладают всеми основными свойствами, которые позволяют использовать их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК. Но довольно часто природные (немодифицированные, несконструированные) плазмиды бывают лишены некоторых обязательных для «высококачественного» вектора свойств. К таким важным свойствам относятся:

1. небольшой размер, поскольку эффективность переноса экзогенной ДНК в Е.coli значительно снижается при длине плазмиды более 15 т. п. н.;

2.наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть осуществлена вставка;

3. наличие одного или более селективных генетических маркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК. Поэтому плазмидные векторы приходится создавать с помощью генной инженерии.

Плазмидный вектор pBR322 в 80-е годы был одним из самых популярных универсальных векторов. Обычно обозначение плазмидного вектора включает строчную букву р (от англ, plasmid) и еще несколько букв, имеющих отношение к описанию вектора или к истории его создания. Так, буквы BR в обозначении плазмиды pBR322 указывают на авторство Ф. Боливара и Р. Родригеса, сконструировавших эту плазмиду, а число 322 — цифровое обозначение, взятое из их исследовательских протоколов. Длина плазмиды pBR322 — 41 п. н. Она несет два гена устойчивости к антибиотикам, ампициллину (Аmрг) и тетрациклину (Tetr), а также уникальные сайты для BamHI, Hind III и SalI в генеТеtг, один PstI-сайт в гене Атрг, один сайт для EcoRI, находящийся за пределами кодирующих последовательностей, и сигнал начала репликации, обеспечивающий репликацию исключительно в Е.coli. Плазмида реплицируется с образованием большого числа копий, в другие бактериальные клетки переносится с трудом.

Как работает клонирующий вектор pBR322? Если очищенную кольцевую плазмиду pBR322 обработать рестриктазой, расщепляющей ее в единственном сайте, расположенном в одном из генов устойчивости к тому или другому антибиотику, то образуется линейная молекула с липкими концами. Такие молекулы смешивают с донорной ДНК, содержащей нужный ген и предварительно обработанной такой же рестриктазой. Поскольку липкие концы этих двух ДНК взаимно комплементарны, они спариваются с образованием гибридных молекул. Далее смесь обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в присутствии АТФ, в результате чего образуется множество разных комбинаций фрагментов, а также нежелательные продукты, в частности объединившиеся между собой фрагменты донорной ДНК и исходные плазмидные ДНК. Чтобы уменьшить количество последних, обрабатывают рестрицированную плазмидную ДНК щелочной фосфатазой, отщепляющей от линеаризованной молекулы 5'-фосфатные группы: ДНК-лигаза не может сшить концы дефосфорилированной линейной плазмидной ДНК. Что касается собственно рекомбинантных молекул ДНК, то хотя в них и имеются два одноцепочечных разрыва, ее фрагменты удерживаются вместе двумя фосфодиэфирными связями, образовавшимися с помощью ДНК-лигазы между дефосфорилированной плазмидной ДНК и рестрицированной донорной ДНК. После репликации в трансформированной клетке одноцепочечные разрывы устраняются системой лигирования клетки-хозяина.

Ввод рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина называется трансформацией. Для ее осуществления используют специально разработанные приемы, например подвергают клетки высокотемпературному воздействию и обрабатывают их хлористым кальцием (СаС1₂ ). Однако эффективность трансформации все же остается невысокой, обычно трансформируется не более одной клетки из тысячи. Таким образом, большинство кле­ток после проведения трансформации не содержат рекомбинантной ДНК. В некоторых из них появляется воссоединившаяся кольцевая плазмидная ДНК, избежавшая дефосфорилирования щелочной фосфатазой, в других — неплазмидная ДНК и лишь в некоторых — плазмида со встроенным фрагментом чужеродной ДНК (гибридная плазмида) [37].

Внехромосомная ДНК, не содержащая точки начала репликации, не может реплицироваться в бактериальной клетке. Таким образом, проникновение в клетку экзогенной ДНК еще не означает, что она будет поддерживаться в хозяйской клетке. Далее, для сохранения рекомбинантной ДНК в клетке-хозяина в первоначальном виде, необходимо, чтобы в клетке отсутствовали гены, кодирующие синтез рестриктаз, которые могут привести к ее деградации, и чтобы клетка имела фенотип RecA- (такие клетки неспособны к общей рекомбинации, так что экзогенная ДНК не будет модифицироваться в результате гомологичной рекомбинации). Затем необходимо идентифицировать клетки, содержащие рекомбинантную ДНК. Способ идентификации должен быть как можно более простым, поскольку приходится проверять огромное число клеток. В системе pBR322, в которой чужеродная ДНК встраивается в сайт BamHI, специфическая идентификация состоит из двух этапов. Сначала клетки после трансфор­мации высевают на питательную среду, содержащую ампициллин. В таких условиях могут вы­расти только те клетки, в которых присутствует интактный ген Ampг - или в составе интактной плазмиды pBR322, или в составе гибридной плазмиды; нетрансформированные клетки чув­ствительны к ампициллину. Сайт BamHI распо­ложен в гене Tetr плазмиды pBR322, встраивание в этот ген фрагмента ДНК преры­вает кодирующую последовательность, и устой­чивость к тетрациклину утрачивается. Таким образом, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину, а клетки, получившие интактную плазмиду pBR322, несут ген Tetr и устойчивы как к ампициллину, так и к тетрациклину.

На втором этапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки, выросшие на среде с ампициллином, переносят на среду с тетрацик­лином методом перепечатки. Клетки, образую­щие колонии на чашках с тетрациклином, со­держат интактную плазмиду pBR322, поскольку они устойчивы и к ампи­циллину, и к тетрациклину. Клетки, не вырос­шие на чашках с тетрациклином, чувствительны к этому антибиотику, значит, они содержат гибридную плазмиду pBR322. Среди колоний, выросших на среде с ампи­циллином, выделяют те, которые оказались чув­ствительны к тетрациклину, и из каждой коло­нии получают индивидуальные клеточные клоны или (чаще делают именно так) объединяют все колонии, устойчивые к ампициллину и чувстви­тельные к тетрациклину, и культивируют их вместе. Далее можно провести дополнительный скрининг и идентифицировать те клетки, кото­рые несут гибридную плазмиду pBR322 со специ­фической вставкой. Присутствие сайтов Hind III и Sal I в гене Tetr и сайта Pst I в гене Ampг плазми­ды pBR322 позволяет изменить локализацию клонированных фрагментов чужеродной ДНК. Если для встраивания используется сайт Pst I, то отбор проводится по той же схеме, но в другом порядке, т. е. сначала высевают клетки на среду с тетрациклином, а затем - с ампициллином.

Ферментный коньюгат

Последним компонентом специфического комплекса на твердой фазе является коньюгат. Коньюгат – вещество (антивидовые антитела), содержащее ферментную метку и способное специфически связываться с антителом. Образующиеся иммунные комплексы антиген-антитело выявляют с помощью коньюгата пероксидазы хрена с моноклональными антителами.

Для высокочувствительных методов ИФА необходимы конъюгаты белок - фермент, в которых белок сохраняет иммунологическую активность и не происходит инактивация фермента. Таким требованиям наилучшим образом отвечает конъюгат белок - фермент состава 1:1. При увеличении числа молекул фермента существенно уменьшается иммунологическая активность белка, так как при этом возрастают стерические препятствия для протекания иммунной реакции и увеличивается вероятность того, что фермент окажется связанным с активным центром антитела или антигенной детерминантой антигена. При уменьшении числа молекул фермента, связанных с белком, значительно понижается ферментативная активность по сравнению с ростом неспецифических взаимодействий конъюгата. Из реакционной смеси конъюгаты выделяют диализом или путем гельфильтрации, а для очистки иногда применяют аффинную хроматографию.

Методы получения конъюгатов, т.е. комплексов фермента со специфическим реагентом, разделяют на химические и иммунохимические. Принцип методов третьей группы заключается в последовательном проведении двух этапов. На первом этапе, с одной стороны, фермент, а с другой стороны, специфический реагент химически модифицируются реагентами, имеющими между собой высокое значение константы связывания, например, авидин-биотин или гаптен-антитело. На втором этапе проводят реакцию между модифицированным ферментом, приводящую к образованию конъюгата по типу антиген-антитело.

Фермент реагирует с вводимым на последний стадии анализа субстратом. Ферментная активность коньюгата, а, следовательно, и концентрация будет пропорциональна концентрации остальных компонентов комплекса, один из которых подлежит определению. За счет сопряженной ферментативной реакции обуславливается высокая чувствительность ИФА (до 10-21молей). Применение ферментной метки позволяет создавать каскадные системы усиления слабых химических сигналов.

Существует достаточно большое число ферментов, используемых в ИФА. В ИФА туберкулеза в качестве фермента чаще применяется пероксидаза хрена. А субстратом для этого фермента является тетраметилбензидин (ТМБ).

Моноклональные антитела

Моноклональные антитела, использующиеся в тест – системах иммунофементного анализа, позволяет существенно повысить специфичность этого метода, поскольку они связываются с одним, строго определенным антигенным сайтом.

Для практического применения антител в качестве диагностического инструмента или компонентов терапевтических средств необходимо было создать такую линию клеток, которая росла бы в культуре и продуцировала антитела одного типа, обладающие высоким сродством к специфическому антигену-мишени, — моноклональные антитела. Подобная клеточная линия могла бы стать неиссякающим источником идентичных молекул антител. К сожалению, В-лимфоциты (В-клетки), синтезирующие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. Решение данной проблемы виделось в создании гибридной клетки. Получив генетическую составляющую от В-клетки, она могла бы вырабатывать антитела, а, приобретя способность к делению от клетки совместимого типа — расти в культуре. Было известно, что В-лимфоциты иногда перерождаются и становятся раковыми (миеломными) клетками, приобретая способность к росту в культуре и сохраняя в то же время многие свойства В-клеток. Так клетки миеломы, в первую очередь те, которые не вырабатывают антител, стали кандидатами на слияние с антителопродуцирующими В-клетками. В середине 70-х гг. эти идеи стали реальностью.

Моноклональные антитела синтезируются отдельными клонами гибридных клеток (гибридомами), которые впервые были получены в 1975 г. Келером и Мильштейном в результате соматической гибридизации клеток миеломных опухолей и В-лимфоцитов, продуцирующих антитела после иммунизации животных соответствующим антигеном.

Первый шаг в процессе получения гибридной клеточной линии, продуцирующей антитела одного типа, состоит во введении мышам антигена. После ряда иммунизаций, проведенных в течение нескольких недель, проверяют, произошло ли развитие у животных иммунного ответа. Если ответ развился, то животных умерщвляют, извлекают селезенку, промывают ее, измельчают и несильно встряхивают для высвобождения единичных клеток, среди которых находятся и антителопродуцирующие В-клетки. Взвесь клеток селезенки смешивают со взвесью миеломных клеток. Особенностью используемых для гибридизации клеток миелом является отсутствие у них фермента гипоксантинфосфорибозилтрансферазы, участвующего в синтезе ДНК. Этот фермент обеспечивает запасной путь синтеза аденозинмонофосфата в тех случаях, когда нормальная цепь ферментативных реакций заблокирована (например, в присутствии ингибитора - аминоптерина). На питательной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ-среда), такие миеломные клетки размножаться не способны. Комбинированную взвесь в течение нескольких минут инкубируют в 35%-ном полиэтиленгликоле, а затем переносят в среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ГАТ). Обработка полиэтиленгликолем облегчает слияние клеток, тем не менее слияние происходит редко и является в достаточной степени случайным событием. В смеси присутствуют клетки миеломы, селезенки, а также слившиеся клетки миеломы—селезенки, миеломы-миеломы, селезенки-селезенки. Однако в среде ГАТ растут только гибридные клетки миеломы-селезенки, все остальные типы клеток не могут в ней пролиферировать. Клетки селезенки и слившиеся клетки селезенки-селезенки вообще не растут в культуре, а миеломные клетки и слившиеся клетки миеломы-миеломы не могут использовать гипоксантин в качестве предшественника в процессе биосинтеза пуриновых оснований гуанина и аденина, без которых невозможен синтез нуклеиновых кис­лот. Но у них есть другой естественный путь синтеза пуринов — при участии дигидрофолатредуктазы, поэтому в состав среды и входит аминоптерин, ингибирующий активность этого фермента. Таким образом, миеломные клетки и слипшиеся клетки миеломы—миело­мы не могут синтезировать пурины в среде ГАТ и погибают.

Слившиеся клетки селезенки-миеломы рас­тут в среде ГАТ, поскольку: 1) клетки селезенки поставляют функциональную гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазу, которая может утилизировать экзогенный гипоксантин среды несмотря на блокирование синтеза пури­нов с участием дигидрофолатредуктазы аминоптерином;

2) клетки миеломы способны ак­тивно делиться. Тимидин необходим для устранения блокирования в синтезе пиримидинов, обусловленного ингибированием дигидро­фолатредуктазы. На 10-14-е сутки после слия­ния клеток в среде ГАТ остаются и растут только слившиеся клетки селезенки-миеломы. Их за­тем вносят в лунки пластиковых микротитровальпых плашек и выращивают на полной культуральной среде без ГАТ.

Селекция на ГАТ-среде позволяет избавиться от миеломных клеток и играет ключевую роль ввиду очень малого выхода процесса гибридизации (один гибрид на 500 тыс. клеток селезенки).

Не все клетки, растущие на ГАТ-среде, являются гибридомами - продуцентами специфических антител. Это связано с тем, что часть лимфоцитов селезенки синтезирует иммуноглобулины неизвестной исследователю специфичности. Кроме того, на первых этапах роста после слияния гибридомы теряют некоторые хромосомы, а вместе с ними и способность к синтезу специфических антител. Поэтому важным этапом получения гибридом является отбор клеток, стабильно синтезирующих антитела к антигену.

Для этого обычно проводят скрининг культуральных сред, содержащих секретируемые антитела. Тестирование гибридом должно осуществляться на самых ранних стадиях после слияния и предполагает использование таких высокочувствительных методов, как иммуноферментный анализ. Среду из тех лунок, в которых есть растущие клетки, отбирают и переносят в лунки другой микротитровальной плашки, предварительно покрытые слоем молекул антигена-мишени. Если в культуральной среде находится антитело (первое антитело), распознающее один из эпитопов данного антигена, то оно свяжется с антигеном и останется в лунках после их промывания. Затем в лунки добавляют второе антитело, специфичное к мышиным антителам. Оно будет присоединяться к любому первому антителу, связанному с антигеном.

К используемому в иммунном анализе второму антителу предварительно присоединяют фермент, который превращает неокрашенный субстрат в окрашенное соединение. Изменение цвета содержимого одной из лунок говорит о том, что исходная культуральная среда содержала антитело, специфичное к данному антигену. Если же такое антитело в среде отсутствовало, то второму антителу не с чем будет связываться и оно вымоется при втором промывании. Субстрат в таких лунках останется неокрашенным.

Однако выявленные на этой стадии антитела не обязательно являются моноклональными. Это обусловлено тем, что в ячейке, где культивируют клетки, может оказаться две и более гибридом, каждая из которых синтезирует свой тип антител. Поэтому следующим шагом после селекции является клонирование гибридом, целью которого является разделение клеток и наращивание отдельных клонов из одной клетки. Для этого клеточную суспензию разводят культуральной средой и высевают в другие лунки. После культивирования полученных клонов среды вновь тестируют, определяя, какая из клеточных линий (гибридом) продуцирует моноклональные антитела, распознающие антиген-мишень. В том случае, когда получают более одной специфичной гибридомы, проводят дальнейшие исследования, позволяющие определить, направлены ли антитела, вырабатываемые разными клонами, против одной и той же антигенной детерминанты. Каждый клон, продуцирующий моноклональное антитело, можно поддерживать в культуре практически бесконечно. Кроме того, образцы можно заморозить в жидком азоте и использовать их в дальнейшем как источник клеток.

Моноклональные антитела получают, выращивая гибридомы на культуральной среде, или из асцитной жидкости. Гибридомы, выращиваемые в сосудах для культивирования, синтезируют 5-10 мкг антител на 1 мл среды. При использовании специальных микроносителей типа "Биосилон", выпускаемых фирмой "Нунк", количество антител увеличивается до 100 мкг/мл.

Важнейшим свойством гибридом, унаследованным от миеломных клеток, представляется их способность давать асцитные опухоли при введении мышам и синтезировать при этом до 15мг антител из 1 мл асцитной жидкости.

Химическая модификация молекулы антитела при получении конъюгатов в некоторых случаях может приводить к уменьшению констант связывания в 10 раз и более. Это послужило стимулом для получения гибридных моноклональных антител, содержащих два различных антиген связывающих центра, один из которых направлен к определенному антигену, а другой – к ферменту, используемому в качестве метки.

Первой стадией при создании гибридных моноклональных антител является получение обычной гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела желаемой специфичности к одному из двух антигенов. Затем гибридому адаптируют к росту в присутствии 8-азогуанина и отбирают те клетки, которые способны размножаться на ГАТ-среде. Эти первичные гибридомы, выступающие в роли миеломного партнера, подвергают слиянию с иммунными лимфоцитами мышей, иммунизированных вторым антигеном. В результате слияния и отбора получают дочерние (вторичные) гибридомы, способные синтезировать антитела двойной специфичности. Таким способом были получены гибридные моноклональные антитела, которые одновременно связывались с пероксидазой хрена и поверхностным антигеном. Гибридные антитела оказались стабильными в процессе хранения, не изменяли своей двойственной специфичности и обладали достаточно высокими константами связывания по отношению к обоим антигенам.

3.3 Специфичность и чувствительность ИФА

Под чувствительностью понимается та минимальная концентрация определяемого реагента, при которой заметно различие в величине сигнала этой концентрации и образца, заведомо не содержащего определяемого реагента (отрицательный контроль). Эта разница в величине сигналов должна составлять 2 - 3 величины стандартного отклонения (СО) для отрицательного контроля.

Для качественной диагностики, когда важно наличие или отсутствие антител в исследуемой пробе используют положительно-отрицательный метод. Положительным значением (+) считают величину сигнала, которая в 2 - 3 раза превышает сигнал от контрольного образца, не содержащего определяемые антитела (-). Процент положительных проб представляет собой выявляемость метода.

Также на чувствительность влияет ферментативная активность коньюгата. Наряду с ферментативной актив­ностью конъюгата большое влияние на чувствительность анализа оказы­вает тип используемого субстрата. Продукт ферментативного превраще­ния субстрата должен обладать новым физико-химическим параметром, позволяющим детектировать его с высокой чувствительностью. Такими параметрами являются: поглощение света в видимой области (хромофор­ные субстраты), флуоресценция в видимой области (флуоресцентные суб­страты) и хемилюминисценция (хемилюминисцентные субстраты).

Высокая чувстви­тельность ИФА достигается также благодаря использованию различных физических методов регистрации ферментативной активности: фотометрических, флуориметрических, био- и хемилюминесцентных. Как всякий аналитический метод, ИФА имеет свои ограничения, связанные с биологической приро­дой молекул детектора (антитела) и усилителя (фермента). Применение ИФА в диагностических целях требует изучения причин неспецифических реакций и их устранения. Как вы­сокочувствительный метод ИФА чрезвычайно зависит от ка­чества реагентов и техники проведения исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Иммуноферментный анализ по сравнению с другими методами детекции антигенов обладает следующими преимуществами.

- высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл. Такая чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата;

- возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;

-стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более);

- простотой поведения реакции

Разработка методов, позволяющих сократить сроки обнаружения микобактерий туберкулеза является очень актуальной задачей в связи с сложившейся эпидемиологиечской ситуацией в нашей стране.

На данный момент в ОНТ НИИ им. Пастера разработана и выпускается иммуноферментная тест-система для обнаружения антител к возбудителю туберкулеза(ИФА-анти-ТУБ).

Данная иммуноферментная тест-система для обнаружения антител к возбудителю туберкулеза дала существенно новые возможности улучшения диагностики туберкулеза, что позволило ввести данный метод в комплекс мер по осуществлению противотуберкулезной работы в нашей стране.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1 . Биотехнология: Учеб. Пособие для вузов. В 8 кн./под ред. Н.С.Егорова, В.Д. Самуилова. Кн.8: Инженерная энзимология/ И.В. Березин, А.А. Клесов, В.К.Швядас и др.-М.: Высш.Шк., 1987.-143 с.

2. Бурков А.Н. Методология конструирования коммерческих тест – систем для диагностики инфекционных заболеваний: Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук.

//www. npods.ru/upload/1046603660.doc

3. Вербов В.Н. Принципы твердофазного иммуноферментного анализа. //Твердофазный иммуноферментный анализ. Труды института имени Пастера, т. 64. 1988. С 3-27.

4. Вершигова А.Е.Общая иммунология: Учеб. пособие. К.: Высшая школа, 1989. – 736 с.

5. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология, М.: Мир, 2002.

6. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа – М.: Высшая школа, 1991.-288 с

7. Иммунобиотехнология. Заикина Н.А., Галынкин В.А., Гарабаджиу А.В. -Спб.: Изд-во “Менделеев”, 2005-155 с.

8. Иммуноферментный анализ: Пер. с англ./Под редакцией Т.Нго, Г.Ленхоффа.-М.: Мир, 1988.-446 с.

9. Рыбчин В.Н. Основы ген. Инженерии.2-е изд., перераб. и доп.: Учебник для вузов. Спб.: Изд-во СПбГТУ, 1999- 522 с.

10. Сингер М., Берг П.Гены и геномы,-М.: Мир,1998

11.Черноусова Л.Н., Русский медицинский журнал том 10,№ 16 “Социально – значимые заболевания”, 2002 г.

12. Шебанов Ф.В. Туберкулез.-М.: Медицина, 1981-386 с.