Главная              Рефераты - Медицина

Влияние атропина на активность карбоксипептидазы H - статья

Влияние атропина на активность карбоксипептидазы и фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы в отделах мозга и надпочечниках крыс


Изучено влияние однократного воздействия атропина на активность карбоксипептидазы Н и фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы – ферментов, участвующих в конечной стадии образования биологически активных нейропептидов из предшественников. Наблюдалось длительное, сохраняющееся по крайней мере в течение 72 ч снижение активности исследуемых ферментов. Предполагается, что снижение активности исследуемых ферментов может быть одним из механизмов снижения уровня нейропептидов при действии высоких доз атропина.

Ключевые слова: карбоксипептидаза Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза, атропин, нейропептиды, мозг.

Холинотропные препараты оказывают свое действие практически на все регуляторные системы. Особый интерес представляет изучение их взаимодействия с пептидергической системой, поскольку нейропептиды участвуют в регуляции разнообразных нейрофизиологических процессов и соматических функций, в том числе тех, которые нарушаются при отравлении холиноблокаторами [1, 2, 3]. Общепризнано, что первичная фармакологическая реакция центральных холинотропных препаратов связана с активацией или блокированием холинорецепторов [4]. Однако многообразие фармакологических эффектов (в частности, транквилизирующее, анальгезирующее влияние и т.д.) препаратов этой группы трудно объяснить только с этой позиции. Исследования показали, что действие этих препаратов на обмен медиаторов (норадреналина, серотонина, дофамина) [5], фосфолипидов и синтез белка [6] не дает возможности в полной мере объяснить механизм их действия.

Имеется большое количество литературных данных об изменении концентрации регуляторных пептидов в мозге и сыворотке крови животных при действии холинолитиков [7, 8]. Однако молекулярные механизмы действия холинотропных препаратов на уровень биологически-активных пептидов не изучены.

Активная форма регуляторных пептидов образуется в результате протеолитического процессинга пропептидов. На конечных стадиях этого процесса, в результате которого образуются биологически активные пептиды, участвуют основные карбоксипептидазы, в частности карбоксипептидаза Н (КПН, КФ 3.4.17.10) и фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза (ФМСФ-КП) [9, 10]. КПН локализована в секреторных везикулах и вовлекается в процессинг предшественников многих регуляторнгых пептидов [9, 10]. ФМСФ-КП – недавно описанный фермент [10], субстратная специфичность и тканевая локализация которого позволяет предположить возможность его вовлечения в обмен ряда биологически активных пептидов, в особенности опиоидных [10]. Однако биологическая роль этого фермента во многом остается не ясной.

В связи с этим, целью данной работы было изучение активности КПН и ФМСФ-КП при однократном введении атропина в отделах головного мозга и надпочечниках крыс, характеризующихся высоким уровнем регуляторных пептидов.

Материалы и методы

Опыты выполнены на самцах белых беспородных крыс массой 200–300 г. Атропин вводили внутрибрюшинно в физрастворе в дозе 2,5 мг/кг. Контрольной группе животных вводили равное количество физраствора. Крыс декапитировали через 0.5, 4, 24 и 72 ч после инъекции, извлекали надпочечники, головной мозг и разделяли его на соответствующие отделы. Навески ткани гомогенизировали в 50 мм натрий ацетатном буфере, содержащем 50 мМ NaCl, рН 5,6, в соотношении 1: 50 (вес: объем). В полученном гомогенате определяли активность КПН и ФМСФ-КП флюорометрическим методом L.D. FrickerandS.H. Snyder [11], содержание белка методом Лоури [12].

Активность КПН оценивали по гидролизу дансил-Phe-Ala-Arg при рН 5.6 как ингибируемую высокоспецифичным ингибитором фермента гуанидиноэтилмеркаптоянтарной кислотой (ГЭМЯК) [11], ФМСФ-КП по гидролизу дансил-Phe-Leu-Arg при рН 5.6 как ингибируемую ФМСФ [10]. Опытные пробы содержали 50 мкл гомогената и 150 мкл 50 мМ натрий ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl. В контрольные пробы вносили ГЭМЯК (в случае КПН) и ФМСФ (в случае ФМСФ-КП) в конечной концентрации 1 мкМ и 1 мМ соответственно. Пробы преинкубировали 8 мин при 37o C, затем вносили 50 мкл предварительно нагретого до 37o C раствора субстрата (концентрация в пробе 42 мкМ), приготовленного на том же буфере и инкубировали в течении 60 мин при 37o C. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора HCl. Для экстракции продукта реакции (дансил-Phe-Ala в случае КПН и дансил-Phe-Leu в случае ФМСФ-КП) к пробам приливали по 1,5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 1000 об/мин.

Флюоресценцию хлороформной фазы измеряли на флюориметре ФМЦ‑2 при λex =360 нм и λem =530 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве стандарта использовали 2 мкМ раствор дансил-фенала в хлороформе.

Активность фермента определяли как разность прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ингибитор, и выражали в нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчете на 1 мг белка.

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием t‑критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Введении атропина в дозе 2,5 мг/кг вызывало снижение активности КПН в гипофизе через 0,5 и 4 ч после инъекции (рис. 1). В обонятельном мозге активность исследуемого фермента снижалась через 24 ч на 55% и оставалась сниженной спустя 72 ч после введения (на 13%). В четверохолмии обнаружено снижение активности КПН через 0,5, 24 и 72 ч, при этом максимальное снижение активности фермента (на 55%) наблюдается через 72 ч после инъекции. В продолговатом мозге активность КПН была снижена через 4 и 72 ч на 45–50%, тогда как через 0,5 и 24 ч не отличалась от контрольной группы. Введение атропина вызывало снижение активности исследуемого фермента в гипоталамусе во всех исследуемых промежутках времени на 35–40%. В гиппокампе и стриатуме активность КПН через 0,5 ч снижалась на 30–40%, через 4 ч на 40–45% и через 72 ч примерно на 30%. В надпочечниках достоверное изменение активности отмечено только через 72 ч после введения атропина: снижение на 60% по отношению к контролю.

Таким образом, введение атропина в дозе 2,5 мг/кг вызывает длительное, сохраняющееся по крайней мере 72 ч снижение активности КПН во всех отделах мозга и надпочечниках крыс.

Результаты исследования влияния атропина (2,5 мг/кг) на активность фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы в отделах мозга и надпочечниках крыс представлены на рис. 2. В гипофизе наблюдалось снижение активности ФМСФ-КП через 0,5 ч на 70%, а через 4 ч на 95% по сравнению с контрольной группой. В надпочечниках снижение активности исследуемого фермента наблюдалось спустя те же промежутки времени: через 0,5 ч на 35% и на 70% по прошествии 4 ч. В обонятельном мозге активность ФМСФ-КП снижалась по сравнению с контрольными животными на 35% через 4 и 24 ч. В четверохолмии и стриатуме активность исследуемой карбоксипептидазы через 4 ч была на 30–35% ниже, чем у контрольной группы. Атропин не оказывал влияния на активность ФМСФ‑КП в продолговатом мозге на протяжении всего времени исследования. В гипоталамусе активность фермента снижалась только через 72 ч после инъекции. В гиппокампе активность ФМСФ-КП снижалась в два раза относительно контроля через 0,5 и 24 ч.

Таким образом, введение атропина в дозе 2,5 мг/кг вызывало снижение активности ФМСФ-КП во всех отделах мозга и надпочечниках крыс, кроме продолговатого мозга.

Несмотря на общую тенденцию снижения активности исследуемых ферментов в мозге и надпочечниках при введении атропина, имеют место и некоторые различия в степени снижения активности карбоксипептидазо-В-подобных ферментов. Так, наиболее существенное снижение активности в гипофизе при действии атропина наблюдалось для ФМСФ-КП – на 75% через 0,5 ч после инъекции и на 95% через 4 ч после введения, в то время как для КПН отмечено снижение активности лишь на 30%. Гипофиз является отделом, синтезирующим и / или секретирующим большой спектр регуляторных пептидов [10, 11]. По-видимому, КПН принадлежит преобладающая роль в процессинге большинства пептидов – тропных гормонов, окситоцина, вазопрессина, атриального натрийуретического пептида, вещества Р и др. [10, 11]. ФМСФ-КП, вероятно, участвует в процессинге опиоидных пептидов, синтезирующихся в гипофизе – энкефалинов и β-эндорфина – уровень которых по данным других авторов [5, 7] значительно снижается при введении атропина. Снижение активности ФМСФ-КП в наших опытах при введении атропина может свидетельствовать о вовлечении данного фермента преимущественно в обмен энкефалинов.

Обращает на себя внимание тот факт, что в надпочечниках наиболее существенное снижение активности отмечено для ФМСФ-КП, в то время как для гипоталамуса и стриатума наиболее выраженные изменения активности наблюдались для КПН. Вероятно, снижение активности ферментов процессинга регуляторных пептидов может быть одним из механизмов снижения уровня энкефалинов и β-эндорфина при введении атропина [5, 7, 13, 14]. Учитывая преимущественную локализацию ФМСФ-КП в надпочечниках можно предположить, что именно здесь данный фермент участвует в генезе регуляторных пептидов, в то время как в стриатуме эта роль принадлежит КПН. В гипоталамусе синтез и секреция биологически активных пептидов этого отдела (аргинин-вазопрессин, окситоцин и др.) также подвержена влиянию холинергической системы [13, 14]. Значительное снижение активности КПН, участвующей в образовании активных форм этих пептидов из предшественников [9, 10], по всей видимости, обеспечивает снижение уровня аргинин-вазопрессина и окситоцина атропином [7].

Таким образом, ФМСФ-КП, как и КПН, вероятно, принадлежит важная роль в регуляции уровня активных форм нейропептидов при введении атропина. При этом КПН и ФМСФ-КП, по-видимому, участвуют в процессинге не только разных биологических пептидов, но и вовлекаются в процессинг одних и тех же нейропептидов в разных отделах нервной системы.


Список литературы

1. Судаков С.К. // Успехи совр. биол. 1988. 105 ., №1. С. 100 – 106.

2. Laubie M., Schmitt H. // J. Pharmacol. 1985. 16 ., №2. P. 69 – 94.

3. Charpali S. at al. // Brain Res. 1988. 450 ., №1 – 2. P. 124 – 130.

4. Caulfield M. P, Nigel J.M. // Pharm. Reviews. – 1998. – 50. №2. – P. 279–290.

5. Громов Л.А., Лохвицкая К.Н. // Фармакология и токсикология. – К.: Здоров’я, 1971. Т. 6. – С. 24–26.

6. Елаев Н.Р., Иванова А.И., Крылов С.С. // Докл. АН СССР. – 1973. – 213, №5. – С. 1201–1202.

7. Крылов С.С., Ливанов Г.А., Петров А.Н., Семенов Е.В., Спринц А.М., Бучко В.М. Клиническая токсикология лекарственных средств. Холинотроп-ные препараты. Санкт-Петербург.: Лань, 1999. 160 с.

8. Громов Л.А., Жила В.А. // Укр. биохим. журн. 1986. 58 ., №6. С. 61 – 63.

9. Beinfeld M.C. // Endocrine. 1998. 8 ., №1. P. 1 – 5.

10. Вернигора А.Н., Генгин М.Т. // Укр. биохим. журн. 1998. 70 ., №2. С. 3 – 4.

11. Fricker L.D., Snyder S.H. // J. Biol. Chem. – 1983. – 258, №18. – P. 10950–10955.

12. Lowry O.H., Rosebrought N.J., Farr A.G., Randall R.J. // J. Biol. Chem. – 1951. – V. 193, №1. – P. 265–275.

13. Andersson K., Eneroth P., Fuxe K., Harfstrand A. // Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. – 1998. – 337, №2. – P. 131–139.

14. Pitkдnen A., Beal M.F., Sirviц J., Swartz K.J., Mдnnistц P.T., Riekkinen P.J. // Neuropeptides. – 1989. – 14. – P. 197–207.


Effect of single atropine administration on the carboxypeptidase h and phenylmethylsulphonilfluoride-inhibited carboxypeptidase activities in rat brain departments and sdrenal