Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 38

 

  Главная      Учебники - Медицина     Лабораторные методы исследования в клинике: справочник (Меньшиков В.В.) - 1987 год

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  36  37  38  39   ..

 

 

Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 38

 

 

4.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ТРОМБОЦИТАРНО-СОСУДИСТОГО

ГЕМОСТАЗА  ( П Е Р В И Ч Н О Г О ГЕМОСТАЗА)

В эту группу входят методы исследования

взаимодействия тромбоцитов и кровеносных

сосудов in vivo при стандартизированных по-

вреждениях микрососудов кожи (разрез, про-

кол, венозный стаз) и разнообразные методы

исследования тромбоцитов и сосудов in  v i t r o .

Наибольшее клиническое значение имеют

методы определения длительности кровотечения

и резистентности капилляров, а также методы

определения количества тромбоцитов и их

функциональных активностей (адгезивно-секре-

торно-агрегационной, коагуляционной и ретрак-

тильной).

4.3.1. Время кровотечения

Общий принцип широко применяемых мето-

дов заключается в измерении длительности

кровотечения из ранки на коже мочки уха,

мякоти ногтевой фаланги пальца руки или верх-

ней трети ладонной поверхности предплечья,

наносимой автоматическим ланцетом, обычным

плоским ланцетом или скарификатором. Описа-

ны варианты теста, при проведении которых

учитывается не только длительность кровотече-

ния, но и объем теряемой крови. Ориентиро-

вочно он может быть оценен по количеству и

виличине пятен крови на фильтровальной бума-

ге, которой промокают выступающие капли

крови.

Метод Дьюка (модифицированный).  П р и н -

ц и п . Определяется длительность кровотечения

из поверхностных микрососудов мочки уха после

нарушения их целостности с помощью плоского

ланцета или скарификатора.

Р е а к т и в ы. 96 % раствор этанола (этило-

вый спирт) или эфир.

О б о р у д о в а н и е . 1. Плоский ланцет или

скарификатор с ограничителем глубины разреза.

2. Секундомер.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Мочку уха согре-

вают между пальцами в течение 1 мин. Протира-

ют спиртом (эфиром) и согревают настольной

лампой с рефлектором до полного высыхания

спирта. Производят прокол мочки уха у ее

нижненаружного края (глубиной 3,5 мм и дли-
ной линейного прокола 3 мм) и немедленно

включают секундомер. Выступающие капли

крови промокают каждые 30 с фильтровальной

бумагой, не прикасаясь к ранке и дожидаясь

момента, когда в течение очередных 30 с капля

крови уже не образуется. По окончании этих

30 с секундомер останавливают и в последую-

щем их вычитают из времени, зафиксирован-

ного на секундомере. Для большой точности

тест выполняют дважды (на обеих мочках)

и выводят среднее значение.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : 2—5 мин

(не более).

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Время кро-

вотечения удлиняется при выраженных тромбо-

цитопениях, болезни Виллебранда, тяжелых

формах некоторых тромбоцитопатий. При нару-

шениях свертываемости крови (гемофилиях)

оно обычно остается нормальным или удлиняет-

ся лишь слегка. Может быть удлинено при

тяжелых формах тромбогеморрагического

синдрома и значительной гепаринемии.

П р и м е ч а н и я .  1 . Описаны варианты

теста без прогревания мочки уха и с глубиной

прокола от 3 до 4 мм. 2. За рубежом распростра-

нен также метод Айви, при котором опреде-

ляется длительность кровотечения из надрезов

кожи ладонной поверхности предплечья в усло-

виях повышенного венозного давления.

Л и т е р а т у р а . Балуда В. П., Баркаган

3. С., Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные

методы исследования системы гемостаза.—

Томск, 1980, с. 65—66; Caen J., Larrieu M. 1.,

Samama M. L hemostase. Methodes d'explora-

tion et diagnostic pratique.— Paris, 1968, p. 44—

47; Markwardt F. Therapie der  B l u t s t i i l u n g s -

storungen. 2. Auflage.— Leipzig:  J o h a n n Ambro-

sius Barth, 1976, S. 38—39.

4.3.2. Резистентность (ломкость)

капилляров

Тест, как правило, выполняется вне лабора-

тории, но имеет важное значение для диагности-

ки тромбоцитарно-сосудистых нарушений. Обычно

применяются различные варианты манжеточной

(турникетной) пробы, заключающейся в опреде-

лении образования точечных кровоизлияний на

коже в области кратковременного повышения

венозного давления, или варианты баночной

пробы, которая основана на подсчете числа

петехий на коже в зоне локально создаваемого

отрицательного давления.

Манжеточная проба Румпеля — Лееде —

Кончаловского.  П р и н ц и п . Подсчитывается

количество петехий на ограниченном участке

кожи ладонной поверхности предплечья, обра-

зующихся при дозированном повышении веноз-

ного давления.

Р е а к т и в ы .  Н е требуются.

О б о р у д о в а н и е . Сфигмоманометр.

Х о д  о п р е д е л е н и я . На коже верхней

части ладонной поверхности предплечья очерчи-

вают круг диаметром 5 см. Накладывают на

плечо этой же руки манжету сфигмоманометра

и поддерживают в ней в течение 5 мин давление

90 мм рт. ст. Снимают манжету и через 5 мин

после восстановления кровообращения в руке

подсчитывают число петехий в очерченном круге.

Обращают также внимание на размеры крово-

излияний.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Число пе-

техий не превышает 10, а их диаметр составляет

не более 1 мм.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . При выра-

женных тромбоцитопениях, некоторых тромбо-

151

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

цитопатиях и ангиопатиях количество петехий

на той же площади достигает 20 и более, нередко

регистрируются кровоизлияния диаметром более

1 мм.

Л и т е р а т у р а . Borchgrevink С. F. In:

Thrombosis and bleeding disorders. Theory and

methods.— Stuttgart: Georg Thieme Verlag,

1971, p. 429.

4.3.3. Количество (подсчет)

тромбоцитов

Подсчет тромбоцитов см. в разделе 3.5.

4.3.4. Ретенция (адгезивность)

тромбоцитов

Известны прямые и непрямые методы оценки

ретенции (адгезивности) тромбоцитов. Прямые

заключаются в подсчете тромбоцитов, фикси-

рующихся на стандартной пластине (обычно

стеклянной) при нанесении на нее крови или

погружении ее в кровь. Непрямые методы

основаны на установлении разницы между

количествами тромбоцитов в венозной крови и

в крови, вытекающей из ранки на коже пальца

руки (или предплечья; адгезивность тромбоци-

тов in vivo), или в венозной крови до и после

ее контакта с какой-либо поверхностью (ад-

гезивность тромбоцитов in vitro). Наибольшее

распространение получили методы определения

ретенции (адгезивности) тромбоцитов in vitro.

Метод определения ретенции тромбоцитов

на стеклянных шариках (модифицированный).

П р и н ц и п . Определяется количество тромбо-

цитов, задерживаемых в колонке со стеклян-

н ы м и шариками при пропускании через нее

со стандартной скоростью определенного объема

крови.

Р е а к т и в ы . 1. 3,8 % раствор цитрата

натрия. 2. 1 % раствор оксалата аммония.

О б о р у д о в а н и е . 1. Все, что необходимо

для подсчета тромбоцитов в крови фазово-

контрастным методом (см. 3.5). 2. Инфузион-

ный насос, позволяющий опорожнять шприц

на 5—10 мл со скоростью 2 мл/мин. 3. Поли-

хлорвиниловая трубка с внутренним диаметром

3—3,5 мм. 4. Полиэтиленовые (пластиковые)

или стеклянные силиконированные шприцы

вместимостью 5—10 мл. 5. Зажимы для поли-

хлорвиниловой трубки или канюли от инъекцион-

ных игл. 6. Стеклянные шарики диаметром 0,2—

0,4 мм. Шарики диаметром 0,1 — 1 мм, выпускае-

мые Уфимским заводом текстильного стекло-

волокна, просеивают через сито, задерживаю-

щее шарики диаметром более 0,4 мм, а затем

оказавшиеся под ситом шарики просеивают

через второе сито, которое пропускает шарики

диаметром менее 0,2 мм. Оставшиеся на втором

сите шарики требуемого диаметра промывают

ацетоном и высушивают.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Свежевзятая цитратная кровь. За 7—10 дней

до обследования лекарственные препараты от-

меняют, так как многие из них угнетают агре-

гацию тромбоцитов (см. 4.3.5) и могут исказить

результаты.

П о д г о т о в к а  к о л о н к и . Отрезок поли-

хлорвиниловой трубки длиной 23—25 см за-

крывают с одного конца зажимом для трубки

или канюлей от иглы (с расчетом, чтобы они

пропускали кровь, но задерживали шарики),

а с другого конца насыпают в трубку через

микроворонку 2,5 г шариков.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Берут пробу крови

для подсчета тромбоцитов. Набирают в шприц

2 мл крови, присоединяют к нему колонку со

стеклянными шариками (незакрытым концом)

и устанавливают шприц в инфузионный насос.

Включают насос и пропускают кровь через

колонку за 1 мин. Вытекающую из колонки

кровь собирают в пластиковую или стеклянную

силиконированную пробирку, перемешивают и

снова берут пробу для подсчета тромбоцитов.

Индекс ретенции (адгезивности) тромбоцитов

вычисляют по формуле:

Индекс ретенции (адгезивности) =

где А — количество тромбоцитов в крови до

пропускания; В — количество тромбоцитов в

крови после пропускания через колонку.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : 20—55  % .

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Уменьше-

ние индекса ретенции (адгезивности) тромбо-

цитов вплоть до 0 % наблюдается при ряде

врожденных тромбоцитопатий и при болезни

Виллебранда (табл. 35).

П р и м е ч а н и я . 1. При отсутствии инфу-

зионного насоса можно воспользоваться ваку-

умным насосом или компрессором. 2. Ретенция

тромбоцитов может быть исследована и с при-

менением стеклоткани.

Л и т е р а т у р а . Одесская Т. А., Шитико-

ва А. С., Папаян Л. П. К методике определения

адгезивной активности тромбоцитов in vitro.—

Лаб. дело, 1971, № 7, с. 395—398; Смоляниц-

кий А. Я., Детинкина Г. Н., Дынкина И. М.

Определение адгезивности (ретенции) тромбо-

цитов с применением стеклянных шариков.—

Лаб. дело, 1985, № 2, с. 90—94.

4.3.5. Агрегация тромбоцитов

Наиболее распространенные способы оценки

агрегации тромбоцитов заключаются в исследо-

вании скорости и степени уменьшения оптиче-

ской плотности (увеличения светопропускающей

способности) тромбоцитарнои плазмы при пере-

мешивании с индукторами агрегации (при

изучении спонтанной агрегации они не до-

бавляются). Образование агрегатов тромбоци-

тов под действием стимуляторов может быть

оценено также визуально или с помощью микро-

скопа.

152

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Т а б л и ц а 35. Наиболее частые формы врожденных нарушений функций тромбоцитов

Болезнь

(синдром)

Тромбастения

Гланцманна

Аспириноподоб-

ный синдром

Болезнь (недо-

статочность) пу-

ла хранения

Болезнь (синд-

ром) Бернара —

Сулье

Болезнь (синд-

ром) Виллебран-

да

Ретенция

тромбо-

цитов

Нарушена

Нормаль-

ная или

нарушена

Нарушена

»

»

Агрегация под действием

АДФ, адреналина

первая

волна

Нарушена

Нормаль-

ная

То же

Нормаль-

ная или

нарушена

Нормаль-

ная

вторая

волна

Нарушена

»

»

Нормаль-

ная или

нарушена

Нормаль-

ная

колла -

гена

Нарушена

»

»

Нормаль-

ная

»

бычьего

фибрино-

гена

Нормаль-

ная

»

»

Нарушена

Нормаль-

ная

ристоцети-

на (ристо-

мицина)

Нормаль-

ная

>

>

Нарушена

»

Ретракция

сгустка

Нарушена

Нормаль-

ная

»

»

»

Качественный макроскопический метод.  П р и н -

ц и п . Определяется визуально наличие или

отсутствие агрегатов тромбоцитов в пробирке,

где исследуемая тромбоцитарная плазма пере-

мешивается со стимулятором агрегации.

Р е а к т и в ы . 1. 3,8 % раствор цитрата

натрия. 2. Раствор АДФ в изотоническом раст-

воре натрия хлорида или буфере Михаэлиса

рН 7,35 в концентрации 20 мкг/мл. 3. 0,85 %

раствор хлорида натрия или буфер Михаэлиса

рН 7,35. Веронал-ацетатный буфер Михаэлиса

(пропись Оврена — Коллера): раствор А—ди-

этилбарбитуровокислый натрий — 7,35 г, ацетат

натрия — 4,86 г, дистиллированная вода —

250 мл; буфер: раствор А — 250 мл, 4,25%

раствор натрия хлорида — 200 мл; 0,1 моль/л

раствор НС1 — 217 мл, дистиллированная во-

да

 — 683 мл.

О б о р у д о в а н и е . 1. Водяная баня на

37 °С. 2. Секундомер.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Тромбоцитарная плазма, лучше со стандартным

содержанием тромбоцитов (250000 в 1 мкл).

За 7—10 дней до обследования лекарственные

препараты отменяют, так как многие из них

(дипиридамол и его производные, ацетилсали-

циловая кислота и ее производные, индомета-

цин, гироксихлорохин, фенилбутазон, сульфин-

пиразон, низкомолекулярные декстраны, три-

циклические антидепрессанты и др.) угнетают

агрегацию тромбоцитов.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Набирают в про-

бирку 0,2 мл плазмы и ставят ее в водяную

баню при 37 °С. Через 1 мин добавляют 0,1 мл

раствора АДФ и немедленно включают секундо-

мер. Покачивая или потряхивая пробирку, отме-

чают время образования в смеси крупных агре-

гатов тромбоцитов.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . 10—60  с .

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . При тром-

бастении Гланцманна агрегация тромбоцитов

не наступает.

П р и м е ч а н и е . Макроскопическим мето-

дом может быть исследована также агрега-

ция под действием коллагена (в конечных

концентрациях 20—50 мкг/мл), ристоцетина

(ристомицина) и бычьего фибриногена (оба

в конечных концентрациях 1 —1,5  м г / м л ) .

В случае нарушения реакции высвобождения

тромбоцитов агрегация не развивается при

перемешивании с коллагеном; для болезни

Виллебранда характерен дефект ристоми-

цин-агрегации; болезнь Бернара — Сулье

распознается по отсутствию одновременно

ристомицин- и фибриноген-агрегации (см.

табл. 35).
Л и т е р а т у р а . Caen J., Larrieu M. 1.,

Samama M. Lhemostase. Methodes d'explora-

tion et diagnostic pratique.— Paris, 1968, p. 58—

59: Human blood coagulation, haemostasis and

thrombosis / Ed. Biggs R. M.— Oxford, 1976,

p. 738.

Количественный фотометрический метод.

П р и н ц и п . С помощью агрегометра (агре-

гатометра), представляющего собой фотометр

с присоединенным к нему самописцем, непре-

рывно регистрируются изменения светопропускаю-

щей способности тромбоцитарной плазмы при

перемешивании с агрегирующими агентами.

Р е а к т и в ы . 1. Раствор АДФ в конечных

концентрациях 10~7 —10~

4

 моль/л. 2. Суспензия

коллагена в конечных концентрациях 20—

50 мкг/мл. 3. Раствор ристоцетина (ристомици-

на) в конечных концентрациях 1 —1,5 мг/мл.

4. Раствор бычьего фибриногена в конечных

концентрациях 1 —1,5 мг/мл. 5. Раствор адре-

налина (неампулированного) в конечных кон-

центрациях 10 ~ —10 ~

4

 моль/л. 6. Раствор

тромбина в конечных концентрациях

0,1—0,5 ЕД/мл. 7. Раствор арахидоновой кисло-

ты в конечных концентрациях 0,1 — 1 ммоль/л.

О б о р у д о в а н и е . Агрегометр (агрегато-

метр).

153

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Тромбоцитарная и бестромбоцитарная плазмы.

В тромбоцитарной плазме подсчитывают тромбо-

циты (см. 3.5) и разводят ее бестромбоцитарной

плазмой до концентрации 200 000—300 000 в

1 мкл (200 • 10

 9

—300 • 10

9

/л). За 7—10 дней

до обследования лекарственные препараты от-

меняют (см. макроскопический метод).

Х о д  о п р е д е л е н и я . В соответствии с

инструкцией.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Зависят  о т

типа агрегометра, приводятся в инструкции.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Описы-

вается в инструкции.

В целом при анализе агрегатограмм обра-

щают внимание на общий характер агрегации

(одноволновая, двухволновая; полная, непол-

ная; обратимая, необратимая), разницу между

светопропускающей способностью плазмы до

начала агрегации и после достижения макси-

мальной агрегации (характеризует интенсив-

ность агрегации), а также увеличение свето-

пропускающей способности плазмы за первую

минуту агрегации или угол наклона кривой

на этапе бурной агрегации (характеризует

скорость агрегации). При применении в качестве

стимулятора коллагена учитывается также дли-

тельность латентного периода в его действии

(время от момента добавления раствора кол-

лагена к исследуемому образцу до начала

агрегации).

Важно отметить, что появление двухволно-

вой агрегации при стимуляции АДФ и адренали-

ном в концентрациях, вызывающих в норме

обратимую агрегацию (обычно 1 • 10 ~'

5 • 10 моль/л), указывает на повышение

чувствительности тромбоцитов к этим индукто-

рам, а развитие одноволновой неполной (а часто

и обратимой) агрегации при стимуляции ими

в концентрациях 10 ~

4

 моль/л и больше — на

нарушение реакции высвобождения (реакции

дегрануляции, секреторной реакции) тромбоци-

тов.

При обследовании больных с врожденной

кровоточивостью микроциркуляторного и микро-

циркуляторно-гематомного типов следует иметь

в виду дифференциально-диагностическое зна-

чение сочетаний нарушений агрегации при при-

менении набора стимуляторов (см. табл. 35).

Л и т е р а т у р а . Баркаган 3. С. Геморраги-

ческие заболевания и синдромы.— М., 1980,

с. 85; Папаян А. В., Шабалов Н. П. Геморраги-

ческие диатезы у детей. Руководство для вра-

чей.—Л., 1982, с. 186—187; Ingram G. I. С.,

Brozovic M., Slater N. G. P. Bleeding disorders

investigation and management.— Blackwell sci-

e n t i f i c publications, 1982, p. 270—276.

4.3.6. Коагуляционная (коагулянтная,

прокоагулянтная) активность тромбоцитов

Чаще всего определяется в тесте генерации

тромбопластина (см. 4.4.10), но может быть

оценена и более простым методом, например

путем сравнительного исследования ускоряюще-

го  в л и я н и я активированных каолином тромбо-

154

цитов обследуемого и здорового человека на

свертывание бестромбоцитарной нормальной

плазмы.

Л и т е р а т у р а . 1. Human blood coagula-

tion, haemostasis and thrombosis / Ed. Biggs

R. M.— Oxford, 1976, p. 745—746.

4.3.7. Ретракция сгустка крови

Описаны прямые и непрямые методы оценки

ретракции сгустка крови. Прямые основаны на

применении специальных устройств, позво-

ляющих измерить величину ретрактильных сил,

развивающихся в сгустке при его самопроиз-

вольном сокращении. Непрямые методы заклю-

чаются в измерении объема сыворотки, выделяе-

мой из сгустка крови при его ретракции,

или в оценке степени уменьшения объема сгуст-

ка разведенной плазмы со стандартным содер-

жанием тромбоцитов в процессе его спонтан-

ного сжатия. В клинике наибольшее распростра-

нение получили непрямые методы.

Качественный метод.  П р и н ц и п . Через

стандартное время после инкубации пробирки

с цельной нестабилизированной кровью при

37 °С оценивают визуально наличие или отсут-

ствие ретракции сгустков крови.

Р е а к т и в ы . Не требуются.

О б о р у д о в а н и е . Водяная баня на 37 °С.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Цельная нестабилизированная кровь.

Х о д  о п р е д е л е н и я .  В З пробирки наби-

рают по 1 мл исследуемой крови и помещают

их в водяную баню. Через 2 ч смотрят, наступила

ли ретракция сгустков крови.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . Сгустки

крови здоровых людей начинают ретрагировать

через 30—60 мин. Результат считается положи-

тельным, т. е. учитывается как «1», если ре-

тракция сгустка наблюдается хотя бы в одной

пробирке. При отсутствии ретракции во всех

пробирках проба считается отрицательной и

учитывается как «О».

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Отсутствие

ретракции сгустков крови наблюдается при вы-

раженных тромбоцитопениях и тромбастении.

Количественный метод.  П р и н ц и п . Опре-

деляется объем сыворотки, выделяемой при ре-

тракции сгустка крови, по отношению к объему

плазмы в исследуемой крови.

Р е а к т и в ы . Не требуются.

О б о р у д о в а н и е . 1. Водяная баня на

37 °С. 2. Центрифуга лабораторная. 3. Центри-

фуга гематокритная. 4. Градуированная центри-

фужная пробирка вместимостью 5 мл с деле-

ниями по 0,1 мл.

М а т е р и а л  д л я  и с с л е д о в а н и я .

Цельная нестабилизированная кровь.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В градуированную

центрифужную пробирку набирают 5 мл крови,

помещают ее в водяную баню и опускают в

кровь деревянную палочку. Одновременно опре-

деляют показатель гематокрита в исследуемой

крови. Через 1 ч после свертывания крови

сгусток, прикрепившийся к палочке, удаляют,

дав жидкой части стечь обратно в пробирку.

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  36  37  38  39   ..