Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 32

 

  Главная      Учебники - Медицина     Лабораторные методы исследования в клинике: справочник (Меньшиков В.В.) - 1987 год

 

поиск по сайту            правообладателям  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  30  31  32  33   ..

 

 

Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 32

 

 

ческое встряхивание для усиления травматиза-

ции клеток и увеличение количества LE-клеток.

Метод Харгревеса — Циммера.  П р и н -

ц и п . Механическое повреждение лейкоцитов

для усиления LE-феномена.

Р е а к т и в ы . 1. Метиловый спирт. 2. Краска

Романовского — Гимзы или другой гематологи-

ческий краситель.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .  1 .

Микроскоп. 2. Металлическое сито. 3. Фарфоро-

вый пестик. 4. Центрифуга.

Х о д  о п р е д е л е н и я . В пробирку наби-

рают 10 мл венозной крови и оставляют для

свертывания на 2 ч. Свернувшуюся кровь  в ы л и -

вают на металлическое сито, поставленное на

ч а ш к у Петри, и пестиком протирают сгусток

в чашку. Содержимое  ч а ш к и Петри выливают

в центрифужную пробирку и центрифугируют

при 2000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную

жидкость отсасывают и удаляют, а из осадка

(верхнего слоя) готовят мазки. Высохшие мазки

фиксируют и окрашивают гематологическим

красителем.

Метод Цинкхама — Конли в модификации

Е. Н. Новоселовой.  П р и н ц и п . Механическое

воздействие на кровь, облегчающее образование

LE-феномена.

Р е а к т и в ы . 1. Оксалат натрия. 2. Метило-

вый спирт. 3. Краска Романовского — Гимзы

или азур-эозин.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .  1 .

Микроскоп. 2. Центрифуга. 3. Стеклянные бу-

синки диаметром 3—4 мм.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . В пробирку поме-

щают 10 мг оксалата натрия и 10 мл венозной

крови. Тщательно перемешивают и оставляют

стоять на 1 —1'/2 ч. Вносят в пробирку 6—8 бу-

синок, закрывают пробирку плотно пробкой и пе-

ремешивают в течение 30 мин (опрокидывая

пробирку пробкой вниз и вверх). Затем отстаи-

вают в течение 1 ч при комнатной температуре

до разделения слоев. Плазму отсасывают пасте-

ровской пипеткой и переносят в центрифужную

пробирку. Центрифугируют при 1000 об/мин

в течение 5  м и н . Надосадочную жидкость слива-

ют, из осадка готовят мазки. Фиксируют высох-

шие мазки в метиловом спирте и окрашивают

гематологическим красителем.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . У здоровых

людей волчаночные клетки в крови отсутствуют.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Обнаруже-

ние LE-клеток — специфичный симптом систем-

ной красной волчанки. Исследование необходи-

мо производить до начала кортикостероидной

терапии. Отрицательный результат исследова-

ния не исключает возможность данного заболе-

вания, он бывает в раннем периоде болезни,

а также при выраженном нефротическом синд-

роме и потере с мочой большого количества

белка. Большую диагностическую ценность име-

ет иммунологическое исследование антинуклеи-

арного фактора (см. раздел «Иммунология»).

Л и т е р а т у р а . Коллагсновые болезни и

ревматизм/Под ред. Е. М. Тареева.— М.: Мед-

гиз, 1961; Поспелова Р. А. Лейкоконцентрация

в клинической практике.— М.: Медицина, 1973,

г. 771.

3.4.5. Цитохимические исследования

лейкоцитов

Цитохимические исследования проводят в

мазках крови, лейкоконцентрата; они основаны

на использовании специфических  х и м и ч е с к и х

реакций для определения в клетках различных

веществ. Эти исследования позволяют изучать

локализацию и ориентировочно оценивать коли-

чество определяемых веществ в различных кле-

точных элементах. Цитохимические исследова-

ния относительно несложны, дают возможность

исследовать различные виды лейкоцитов, но ус-

тупают в точности количественному анализу,

проводимому с помощью биохимических мето-

дов.

При цитохимическом исследовании чаще

пользуются полуколичественной оценкой резуль-

татов, используя  п р и н ц и п Астальди, основан-

ный на выявлении различной степени интенсив-

ности специфической окраски. В зависимости

от нее исследуемые элементы делят на 4 группы:

с отрицательной реакцией  ( — ) , слабоположи-

тельной ( + ), положительной (+ +) и резко

положительной ( + + + ). Для количественного

выражения результатов подсчитывают 100 кле-

ток определенного вида, дифференцируя их по

указанному  п р и н ц и п у , затем число клеток с оди-

наковой интенсивностью окраски умножают на

соответствующее данной группе число плюсов,

сумма этих произведений составляет условные

единицы. Например, при исследовании активно-

сти щелочной фосфатазы в нейтрофилах из 100

просмотренных клеток в 60 клетках активность

фермента не выявлена  ( — ) , в 35—специфи-

ческая окраска была слабой ( + ) и в 5— более

интенсивной ( + + ). Результат определения ак-

тивности щелочной фосфатазы в нейтрофилах

в таком случае составит (60 ХО)+(35 X 1) +

+(5 X 2) = 0 + 35+ 10 = 45 ед. Можно выразить

результат в виде среднего цитохимического по-

казателя по L.  K a p l o w (1955) или среднего

цитохимического коэффициента (СЦК). С этой

целью также дифференцируют 100 исследуемых

клеток по указанной выше системе. Полученный

процент клеток в каждой группе умножают на

соответствующее данной группе число плюсов.
Сумма этих величин, деленная на 100, пред-

ставляет собой СЦК для одной клетки. В ука-

занном примере СЦК щелочной фосфатазы ней-

трофилов равен 0,45. В тех случаях, когда изуча-

емые вещества локализуются в клетках в виде

единичных гранул (например, активность не-

специфической эстеразы в лимфоцитах и др.),

результат цитохимической реакции целесооб-

разно выражать в процентах клеток, дающих

положительную реакцию.

Метод полуколичественйой оценки является

ориентировочным, но позволяет сравнивать рас-

пределение исследуемых веществ в разных кле-

точных элементах или в одних и тех же клетках

при  р а з л и ч н ы х патологических состояниях ор-

ганизма, а также в зависимости от течения забо-

левания, степени его тяжести и в связи с прово-

димой терапией.

Наиболее распространены цитоэнзиматичес-

кие исследования, дающие возможность выя-

127

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

вить в клетках активность различных ферментов.

Для этого чаще используют методы азосочета-

ния, в которых специфический субстрат, взаимо-

действуя с ферментом, образует продукт реак-

ции, который окрашивается солями диазония;

по окраске судят о локализации фермента и его

активности.

В настоящей главе приведены наиболее рас-

пространенные в клинической практике цитохи-

мические методы исследования.

Л и т е р а т у р а . Astaldi G., Verga L. Acta

haematol., 1957, vol. 17, p. 129—136; Kaplow L.

Blood, 1955, vol. 10, № 10, p. 1023—1029.

ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА (К. Ф. 3.1.3.1.)

содержится преимущественно в зрелых нейтро-

фильных лейкоцитах; активность фермента свя-

зывают со вторичными (специфическими) гра-

нулами цитоплазмы. Относится к группе гидро-

литических ферментов с оптимумом действия

при рН 9,6, осуществляет гидролиз однозаме-

щенных эфиров ортофосфата. Наиболее распро-

странено определение активности фермента ме-

тодами азосочетания.

Метод азосочетания по Кеплоу.  П р и н ц и п .

Расщепление щелочной фосфатазой а-нафтил-

фосфата с освобождением а-нафтола, образу-

ющего с солями диазония нерастворимый окра-

шенный в коричневый цвет осадок в местах

локализации фермента.

Р е а к т и в ы . 1. 10% раствор формалина

в абсолютном метаноле. 2. 0,05 М раствор про-

пандиолового буфера (рН 9,75); готовят основ-

ной 0,2 М раствор (10,5 г 2-амино-2-метил-1,3-

пропандиола растворяют в 500 мл дистиллиро-

ванной воды), хранят его в холодильнике. Из

основного раствора готовят 0,05 М раствор

(25 мл основного раствора буфера смешивают

с 5 мл 0,1 н. раствора НС1 и доводят дистиллиро-

ванной водой до 100 мл), хранят в холодиль-

нике. 3. а-Нафтилфосфат. Можно использовать

нафтол-АS-Фосфат, нафтол-АS-ТR-фосфат или

нафтол-АS-В1-фосфат. 4. Прочный синий RR;

можно использовать отечественные красители

диазоль  с и н и й 2С и диазоль  с и н и й 0. 5. 2 %

раствор метилового зеленого. 6. Инкубационная

среда (готовят перед употреблением): 35 мг

а-нафтилфосфата, 35 мг прочного синего  R R ,

35 мл буферного раствора.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

Холодильник.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . Высохшие  н а воз-

духе мазки фиксируют в 10 % растворе фор-

малина в абсолютном метаноле при температуре

О—5 °С в течение 30 с. На высохшие мазки нано-

сят инкубационную среду после фильтрования

и оставляют мазки при комнатной температуре

на 8—10 мин. Ополаскивают в проточной воде

в течение 10 с. Докрашивают метиловым зеле-

ным в течение 15 мин или гематоксилином Май-

ера 3—4 мин.

Метод азосочетания (модификация М. Г. Шу-

бича).  П р и н ц и п см. метод азосочетания  п о

Кеплоу.

Р е а к т и в ы . I. 0,5 % раствор целлоидина

в смеси равных количеств абсолютного спирта

и эфира. Целлоидин можно готовить из кино-

и фотопленок по методике Меркулова: удалить

слой эмульсии после вымачивания в горячей во-

де или щелочи, выдержать 5—10 дней в трех

сменах хлороформа, промыть спиртом, высу-

шить, мелко нарезать и растворить в смеси

абсолютного спирта с эфиром. 2. 0,5 М раствор

тетрабората рН 9,18 [19,1 г тетрабората натрия

(бура) растворить и довести дистиллированной

водой до 1  л ] . Раствор стойкий. 3. 0,1 % рас-

твор а-нафтилфосфата в растворе тетрабората

(готовят перед употреблением). 4. 0,2 % раствор

диазоля синего 0 в растворе тетрабората (гото-

вят перед употреблением и фильтруют в защи-

щенном от света месте). 5. Гематаль 8 Бейкера:

один объем 0,1 % гематеина, приготовленного

на 50 % водном растворе этиленгликоля, смеши-

вают с одним объемом 1,6 % водного раствора

сульфата алюминия. Вместо гематаля можно

использовать гематоксилин: 1 г краски раство-

ряют в 50 мл дистиллированной воды, доводят

до кипения, доливают 50 мл дистиллированной

воды, добавляют 0,02 г йодата натрия и 5 г

алюмокалиевых квасцов, встряхивают до раст-

ворения и охлаждают. 6. Инкубационная среда

(готовят перед употреблением); равные коли-

чества реактивов 3 и 4.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е . Хо-

лодильник.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Мазки фиксируют

в 0,5 % растворе целлоидина в течение 3—5 с.

После фиксации целлоидин с обратной стороны

предметного стекла удаляют салфеткой, стекла

ставят в вертикальном положении на фильтро-

вальную бумагу и дают им высохнуть. Инкуби-

руют в инкубационной среде при комнатной

температуре в защищенном от света месте в те-

чение 30 мин. Промывают в проточной воде в те-

чение 5—10 мин и ополаскивают в дистиллиро-

ванной воде. Докрашивают ядра красителем

(реактив 5). При использовании гематаля 8 маз-

ки окрашивают 18—24 ч, затем ополаскивают

в дистиллированной и проточной воде и высу-

шивают. При использовании гематоксилина маз-

ки окрашивают 30—60 мин, ополаскивают в тет-

раборатном буфере, разведенном водопроводной

водой, промывают водой и высушивают.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . У здоровых

людей большинство сегментоядерных нейтрофи-

лов являются фосфатазоотрицательными и толь-

ко в 20—30 % клеток выявлена слабая актив-

ность фермента ( + )• По данным М. Г. Шубича

и Б. С. Нагоева, активность фосфатазы для

здоровых обоего пола составляет 26±0,6 ед.,

или СЦК 0,26 + 0,006. Выявлено достоверное

различие между показателями энзиматической

активности у мужчин и женщин (соответственно

21 ±0,7

 и 31 ±0,8 ед.).

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Наиболь-

шее диагностическое значение имеет определе-

ние активности фермента при гемобластозах;

снижение активности характерно для хроничес-

кого миелолейкоза, повышение — рассматри-

вают как один из признаков эритремии. Повы-

шение активности наблюдается также при вос-

палительных процессах, интоксикациях, опухо-

лях, коллагенозах, циррозах печени. Показатель

может быть использован как дифференциально-

128

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

диагностический признак при лейкемоидных ре-

акциях (активность фермента повышена) и хро-

ническом миелолейкозе. Снижение активности

фермента часто сопутствует вирусному гепатиту,

инфекционному мононуклеозу и другим вирус-

ным инфекциям, лучевой болезни.

Л и т е р а т у р а . Буйкис И. М., Руденс Ю. Ф.

Гистохимическое определение активности ще-

лочной фосфатазы методом одновременного

азосочетания.— Вопросы лейкозологии (Рига),
1969, № 1,с. 369—376; Шубин М. Г.— Лаб. дело,

1965, № 1, с. 10—14; Шубин М. Г., Нагоев Б. С.

Щелочная фосфатаза лейкоцитов в норме и па-

тологии.— М.: Медицина, 1980, с. 41; Kaplow L.

Blood, 1955, vol. 10, № 10, p. 1023-1029.

К И С Л А Я ФОСФАТАЗА (К. Ф. 3.1.3.2). Об-

наруживают преимущественно в нейтрофилах

и лимфоцитах крови; локализацию связывают

с лизосомами цитоплазмы клеток. Кислая фос-

фатаза является гидролитическим ферментом

с оптимумом действия рН 5,2. Для цитохими-

ческого исследования чаще используют методы

азосочетания.

Метод азосочетания Берстона (модификация

Ю. Ф. Руденса, И. М. Буйкиса).  П р и н ц и п см.

Метод азосочетания по Кеплоу.

Реактивы. 1. 0,1 М раствор цитратного буфе-

ра (рН 5,2). 2. 0,05 М раствор хлорида магния.

3. Нафтол-АS-Фосфат (можно использовать

нафтол-АS-ТR-фосфат или нафтол-АS-В1-фос-

фат. 4. Диметилформамид. 5. Диазоль синий

2С или прочный синий ВВ. 6. Краситель Рома-

новского — Гимзы. 7. Изотонический раствор

хлорида натрия. 8. Инкубационная среда: 10 мг

нафтол-АS-Фосфата, растворенного в 5 мл диме-

тилформамида; 15 мл 0,1 М цитратного буфера

рН 5,2, 45 мл дистиллированной воды, 5 мл

раствора хлорида магния, 50 мг диазоля синего.

Готовят перед употреблением и используют по-

сле фильтрования.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е . Тер-

мостат.

Х о д  и с с л е д о в а н и я . Нефиксирован-

ные мазки инкубируют в инкубационной среде

при 37 °С в течение 2 ч. Промывают изотони-

ческим раствором хлорида натрия. Докрашива-

ют красителем Романовского — Гимзы. Промы-

вают в проточной воде. Активность фермента

выявляется в виде синей окраски.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . В сегмен-

тоядерных нейтрофилах активность фермента

равна 38,6±2,82 ед., или СЦК 0,386 + 0,028, в

лимфоцитах —26,9±1,94 ед., или СЦК 0,268±

±0,019. У детей активность кислой фосфатазы

в нейтрофилах выше, чем у взрослых.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Повыше-

ние активности наблюдается в нейтрофилах при

воспалительных процессах, при туберкулезе, ин-

фаркте миокарда, острых хирургических заболе-

ваниях, злокачественных опухолях. При этом

следует учитывать, что высокие цифры актив-

ности фермента могут быть результатом повы-

шения активности щелочной фосфатазы в ней-

трофилах, так как активность последней может

выявляться и в кислой среде. Поскольку при

всех указанных выше заболеваниях наблюда-

ется повышение активности и щелочной фосфа-

тазы, а при цитохимическом методе исследова-

ния обоих ферментов используют единый суб-

страт, при получении высокой активности кис-

лой фосфатазы М. Г. Шубич и И. В. Нестерова

предлагают проводить повторное исследование

после ингибирования щелочной фосфатазы с по-

мощью ЭДТА.

Повышение активности кислой фосфатазы

в лимфоцитах отмечается при иммунизации,

различных аллергических заболеваниях.

В властных клетках при острых лейкозах

характер распределения продукта реакции раз-

личен в зависимости от формы лейкоза. При

острых лимфобластных формах активность вы-

является в гранулярной форме, при миелоб-

ластных — в диффузной форме.

Л и т е р а т у р а . Берстон М. Гистохимия

ферментов.— М.: Мир, 1965, с. 215; Руденс Ю. Ф.,

Буйкис И. М. Вопросы лейкозологии (Рига),

1969, № 1, с. 377—383; Шубич М. Г., Нестеро-

ва И. В. Лаб. дело, 1980, № 3, с. 150—154.

ПЕРОКСИДАЗА (МИЕЛОПЕРОКСИДА-

ЗА) (К. Ф. 1.11.1.7). Фермент, локализующий-

ся преимущественно в специфической зернисто-

сти цитоплазмы гранулоцитов и являющийся

маркером клеток миелоидной природы. Миелопе-

роксидаза разрушает токсическую перекись во-

дорода, образующуюся внутриклеточно в про-

цессе жизнедеятельности клеток.

Метод Грэхема — Кнолля.  П р и н ц и п .

В присутствии пероксидазы бензидин окисляется

перекисью водорода в коричневый оксибензидин.

Р е а к т и в ы .  1 .  4 % формалиново-спирто-

вой раствор (10 частей 40 % формалина и 90 ча-
стей 96 % спирта). 2. Реактив на пероксидазу:

бензидин (на кончике ножа) растворяют в 6 мл

96 % спирта, прибавляют 4 мл воды и 0,02 мл

3 % перекиси водорода. Реактив годен к упот-

реблению в течение 5—6 дней. 3. Краситель

Романовского — Гимзы.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .  Н е

требуется.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Свежие мазки  ( 1 —

2-дневной давности) фиксируют 4 % формали-

ново-спиртовым раствором в течение 30 с. Обмы-

вают в проточной воде и высушивают. Заливают

реактивом на пероксидазу на 5 мин. Тщательно

промывают в проточной воде и высушивают.

Докрашивают красителем Романовского —

Гимзы. Пероксидаза выявляется в цитоплазме

клеток в виде коричневых гранул.

Модифицированный метод Нарциссова.

П р и н ц и п см метод Грэхема — Кнолля. Для

уменьшения инактивации фермента использова-

ны соответствующий фиксатор и небольшое ко-

личество перекиси водорода.

Р е а к т и в ы . 1. 60 % водный раствор аце-

тона. 2. 0,1 М раствор бората натрия (можно

использовать фосфатный или мединаловый бу-

ферный раствор рН 7.6). 3. 5 % водный раствор

трилона Б. 4. Насыщенный водный раствор

бензидина. 5. 0,003 % раствор перекиси водо-

рода (разводят перед употреблением из 3 % рас-

твора в два этапа). 6. Инкубационная среда:

5 п/р В. В. Меньшикова

129

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

мл 5 % водного раствора трилона Б, 10 мл

раствора бората натрия, 35 мл насыщенного

раствора бензидина и 2 мл раствора перекиси

водорода. 7. 0,5 % раствор метилового зеленого

на буферном растворе (рН 5,0) или 0,1 % вод-

ный раствор метиленового синего.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

Термостат.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Свежеприготовлен-

ные мазки фиксируют в 60 % водном растворе

ацетона в течение 30 с. Промывают дистиллиро-

ванной водой. Инкубируют в инкубационной

среде в течение 1 ч в термостате при 37 °С.

Промывают дистиллированной водой. Докраши-

вают мазки метиловым зеленым или метиле-

новым синим в течение 10 мин. Можно исследо-

вать недокрашенные мазки.

Модифицированный метод [Шафран М. Г.

и соавт., 1979).  П р и н ц и п см. Метод Грэ-

хема — Кнолля. Бензидин заменен О-дианизи-

дином.

Р е а к т и в ы . 1. 10% спиртовой раствор

формалина (1 мл 10 % формалина и 9 мл этило-

вого спирта). 2. Спиртовой раствор О-дианизи-

дина (можно использовать препарат Шосткин-

ского завода химреактивов; белые или желтова-

тые кристаллы препарата быстро окисляются на

воздухе, при изменении окраски он становится

непригодным). 24 мг О-дианизидина растворяют

в 5 мл метанола и доводят дистиллированной

водой до 9,9 мл. 3. 3 % раствор перекиси водоро-

да. 4. Реакционная смесь: к спиртовому раст-

вору О-дианизидина прибавляют перед употреб-

лением 0,1 мл перекиси водорода. 5. 0,25 %

водный раствор азура А или другой ядерный

краситель.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .  Н е

требуется.

Х о д  о п р е д е л е н и я .  М а з к и

фиксируют спиртовым раствором формалина

в течение 10—15 с. Споласкивают проточной

водой. На мазки наносят реакционную смесь

на 2—3 мин при комнатной температуре. Спо-

ласкивают проточной водой. Докрашивают рас-

твором азура в течение 10—15 с. Споласкивают

проточной водой и высушивают.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . В крови

здоровых людей активность пероксидазы выяв-

ляется преимущественно в цитоплазме грануло-

цитов и в меньшей степени — моноцитов. Фер-

мент появляется в кровяных клетках на стадии

промиелоцитов и у ряда миелобластов (более

зрелых). Не содержат фермента недифференци-

рованные бласты, часть миелобластов и лимфо-

бласты; 3—16 % нейтрофилов окрашены резко

положительно (+ + +). 60—90 % — положи-

тельно (++) и остальные—слабоположитель-

но ( + ). СЦК нейтрофилов здоровых людей

равен 2,56 + 0,033. Эозинофилы характеризу-

ются резко положительной реакцией на перок-

сидазу.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Актив-

ность фермента в нейтрофилах снижена при

инфаркте миокарда, ревматизме, туберкулезе,

опухолях. У больных хроническим миелолейко-

зом, особенно в терминальной стадии, СЦК сни-

жается до 1,63 ±0,19 ед. В бластных клетках

130

активность фермента высокая при остром миело-

бластном лейкозе, слабая — при остром моно-

бластном и отсутствует — при остром лимфо-

бластном лейкозе.

Л и т е р а т у р а . Нарциссов Р. П. Лаб. де-

ло, 1964, № 3, с. 150—151; Шафран М. Г., Пига-

ревский В. Е., Блинова Э. И. Цитология, 1979,

т. 21, № 10, с. 1206—1208; Тодоров И. Клини-

ческие лабораторные исследования в педиат-

рии.— София, 1963, с. 468.

Н Е С П Е Ц И Ф И Ч Е С К И Е ЭСТЕРАЗЫ. Труп

па ферментов, гидролизующих эфиры карбоно-

вых кислот; отличаются небольшой специфич-

ностью. Локализуются в цитоплазме клеток,

главным образом в лизосомах. Наибольшая

активность обнаружена в моноцитах крови. Для

определения активности ферментов используют

различные субстраты (а-нафтилацетат, нафтол-

AS-ацетат, нафтол-АS-D-хлорацетат, b-нафтил-

ацетат и др.).

а-Нафтилацетат-эстераза (метод Леффле-

ра).  П р и н ц и п . Соединение а-нафтилацетата

при определенных рН и температуре под влия-

нием неспецифических эстераз гидролизуется

с образованием свободного нафтола, который

с солями диазония дает цветное окрашивание.

Р е а к т и в ы .  1 . Формалин промышленного

производства (40%). 2. а-Нафтилацетат. 3.

Ацетон х. ч. 4. 0,1 М раствор фосфатного буфера

(рН 7,8—8,0). 5. Прочный синий ВВ (или проч-

ный красный ТР). 6. Ядерный краситель (гема-

лаун кислый, метиловый зеленый и пр.). 7. Ин-

кубационная среда: 10 мг а-нафтилацетата, рас-

творенного в 0,2 мл ацетона; 40 мл буферного

раствора (реактив № 4), встряхивают до раст-

ворения; 50 мг соли диазония (реактив № 5),

встряхивают до растворения и фильтруют.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .  1 .

Весы. 2. Эксикатор.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Свежеприготовлен-

ные и высушенные на воздухе мазки фиксируют

в парах формалина 4 мин (фиксированные

препараты можно сохранять в холодильнике

несколько недель или 2 сут при комнатной тем-

пературе). Инкубируют в инкубационной среде

при комнатной температуре 30 мин. Промывают

в проточной воде (2—3  м и н ) . Докрашивают

кислым гемалауном 8 мин. Промывают дистил-

лированной водой 15 мин. Активность фермента

выявляется в виде коричнево-черных (при упот-

реблении прочного синего) или красно-коричне-

вых (при употреблении прочного красного) гра-

нул в цитоплазме клеток.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . В моноци-

тах периферической крови активность фермента

содержится в виде мелкой обильной зернистости.

СЦК в моноцитах составляет 0,95±0,01. Не-

большое количество лимфоцитов (18,0±0,4 %)

содержит активность фермента в виде единич-

ных гранул в цитоплазме; в тромбоцитах пери-

ферической крови фермент выявляется в виде

мелких гранул, в сегментоядерных нейтрофилах

его активность ничтожна.

Среди костномозговых элементов наиболь-

шую активность имеют промиелоциты, миело-

циты, мегакариоциты, моноциты, ретикулярные

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

 

 

 

 

 

 

 

содержание   ..  30  31  32  33   ..