РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА. Курс лекций

хромосомы, так и транскрипцию ключевого гена деления, FtsZ, и, таким образом, обеспечивающего

необходимую координацию двух процессов.

Если смотреть на бактерию под микроскопом, легко сделать наблюдение, что бактериальная

жизнь является по существу постоянным процессом роста, который в некоторый момент приводит к

делению клетки. Чтобы делиться успешно, бактерия должна удвоить свою массу, дуплицировать

хромосому и построить особую структуру, разделяющую две дочерних клетки - септу. Хотя главный

процесс деления, цитокинез, может происходить более-менее одинаково у всех бактерий, детали

деления в целом изменяются значительно в зависимости от формы бактерии и состава ее клеточной

стенки. Объект этого исследования, Escherichia coli, является грамотрицательной бактерией, которая

интенсивно изучалась генетически и биохимически и является, вероятно, организмом, о котором мы

знаем больше, чем о любом другом представителе живого мира Земли. Форма этой бактерии определена

жестким слоем пептидогликана или муреина, расположенного между внешней и внутренней

клеточными мембранами. Пептидогликан - огромная молекула, образующая подобную мешку, но

достаточно жесткую структуру, которая в сочетании с высоким внутренним осмотическим давлением

действует как экзоскелет, определяющий постоянную форму клетки и ее механическую прочность в

разнообразии окружающих сред с различной осмолярностью. Пептидогликан - уникальный полимер,

составленный из цепей гликана, поперечно сшитых короткими пептидными мостикми. Присутствие

такой жесткой структуры накладывает отпечаток на всю физиологию этой бактерии, и, в частности, на

процесс деления, который и является предметом этогй диссертации. Муреиновый саккулюс должен

быть дублирован каждый клеточный цикл, причем таким способом, который гарантирует постоянную

целостность этой структуры, являющейся абсолютно необходимой для поддержания формы и

жизнеспособности клетки. Эта цель достигается при помощи сложного комплекса белков,

включающего муреинсинтетазы, литические ферменты и множество белков, специфических для

деления, но не связанных непосредственно с метаболизмом муреина. Экспрессия этих белков

подвержена сложной системе регуляции, управляющей присутствием нужных количеств нужных

белков в нужных местах и в нужное время и координацией клеточного деления с репликацией

хромосомы и клеточным ростом.

10.1.1. Структура муреина.

Гликанoвые цепи муреина сложены из повторяющихся субъединиц, состоящих из двух

аминосахаров, N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) и N-ацетилмурамовой кислоты (MurNAc), связанных β-

1,4 гликозидными связями (Рис. 10.1). Длина этих цепей значительно варьирует со средним числом 29

дисахаридных субъединиц. Цепи гликана перекрестно сшиты короткими пептидными мостами.

Пентапептид L-Ala-D-Glu-DAP-D-Ala-D-Ala (DAP - meso-диаминопимелиновая кислота) присоединен к

лактатной группе MurNAc через амидную связь с остатком L-аланина. Присутствие двуосновной

кислоты (DAP в E. coli) необходимо для формирования перекрестных сшивок между соседними цепями

гликана. Кросс-сшивка осуществляется транспептидазой, которая отщепляет концевой D-аланин и

образует пептидную связь между остающимся D-аланином и свободной амино группой DAP из

пентапептида, связанного с другой цепью гликана. Формирование пептидного моста все еще оставляет

свободную амино группу в одном из остатков DAP, что делает возможным присоединение

дополнительной цепи гликана. Такие связи, соединяющее три цепи гликана, обнаруживаются

приблизительно в 5 % случаев . В зрелом пептидогликане один или оба остающихся D-аланиновых

остатка удаляются из пептидных мостиков карбоксипептидазами. Пептидные цепи располагаются по

спирали вокруг гликановых цепей под углами приблизительно в 90° друг к другу . Если муреин

однослоен, как в E.coli, пептидные мосты могли бы поэтому соединять каждый второй остаток MurNAc

в соседних цепях гликана. Реальная степень поперечных сшивок близка к ожидаемой по крайней мере в

некоторых условиях. Такое строение молекулы приводит к созданию прочной ковалентно связанной

сетчатой структуры, фактически одной огромной молекулы, в которую заключена большая часть

бактериальной клетки. Такая структура позволяет муреиновому саккулюсу противостоять внутреннему

давлению в несколько атмосфер. И именно комбинация высокого внутреннего давления с жестким

муреиновым "мешок" определяет фиксированную форму бактериальной клетки. Очевидно, что такая

структура обеспечивает бактерии много преимуществ, но также создает и несколько проблем, наиболее

важной из которого является рост жесткого саккулюса - он должен расти и делиться таким способом,

- 48 -

NAM

NAG

NAM

NAG

Muramidase

CH 3

CH 2

HC CH3

CH 3

L-Ala

D-Glu

NH 2

CH 3

m- DAP

Carboxy-

D-Ala

CH 2

peptidase

D-Ala

CH 2

HC CH 3

HC CH3

CH 3

L-Ala

Endopeptidase

D-Glu

NH 2

m- DAP

D-Ala

Рис.10.1. Структура пептидогликана

чтобы целостность всей структуры экзоскелета, противостоящей внутреннему

осмотическому

давлению, никогда не нарушалась.

10.1.2. Модели элонгации и деления муреинового саккулюса.

Другим возможным путем вставки нового материала в саккулюс была бы стратегия "присоединяй,

а затем разрывай", используемая грамположительными бактериями, где новые слои муреина

добавляются в ненапряженном состоянии ниже внешних слоев, несущих механическое напряжение. Эти

новые цепи вводятся в действие медленно, по мере деградации внешних слоев гидролазами. Подобная

форма роста саккулюса предложена для E. coli в другой модели. Эта модель постулирует, что новый

материал должен быть присоединен к существующему слою муреина прежде, чем любые ковалентные

связи могут быть расщеплены. Гипотеза объясняет роль тримерных поперечных сшивок и фактически

полагается на их существование. Тримерные сшивки, как полагают, являются сайтами присоединения

нового добавляемого материала. Самый маленький такой сайт

- одиночная цепь гликана, но

минимальная структура нового муреина, добавленного к этому сайту, должна по структурным

причинам состоять из трех цепей. Чтобы объяснить экспериментально наблюдаемую вставку

одиничных цепей гликана, постулируется существование "праймерной" цепи, синтезируемой

монофункциональной трансгликозилазой. Никакое доказательство для существования таких

"праймерных" цепей не доступно, но фермент, способный к созданию таких цепей,

монофункциональная гликозилтрансфераза, известен. Предполагается, что триплет цепей гликана

формируется путем синтеза двух новых цепей, сопряженного с их одновременным «пришиванием» к

праймерной цепи. Этот триплет затем присоединяется к свободным амино группам DAP из пептидных

мостиков с обеих сторон цепи-мишени в существующем муреине. Цепь-мишень затем удаляется, и три

новых цепи выдвигаются в плоскость муреина внутренним давлением (Рис. 10.2).

Минорная модификация состава мультиферментного комплекса могла бы быть достаточна для

обеспечения синтеза муреина в течение клеточного деления - PBP3 использовался бы вместо PBP2 и,

возможно, монофункциональная трансгликозилаза была бы добавлена. В этом случае триплеты муреина

могли бы синтезироваться за один шаг, так как, вопреки тому, что наблюдается при элонгации, при

- 49 -

(a)

(b)

Docking str and

EP(AM)

Ala-Glu-A2pm Ala-A2pm-Glu-Ala

Stress-bear ing

Ala-Glu-A2pm-Ala A2pm-Glu-Ala

la yer

Ala

-A2pm

Ala

Glu

Ala

-A2pm

Glu

Ala

Glu

A2pm

Ala

Murein triplet

TP/TG

Ala

Ala-A2pm-Glu-Ala

Glu

A2pm

Ala

Ala-Glu-A 2pm-Ala

Рис.10.2. Элонгация пептидогликана

делении несколько новых цепей муреина вставляются рядом. Небольшая задержка удаления старой

цепи вела бы к инвагинации муреина в результате добавления следующего триплета муреина до того,

как старая цепь педед предыдущим триплетом будет удалена.

10.1.3. Гены клеточного деления.

Определение специфического гена клеточного деления может быть несколько затруднено.

Клеточное деление, конечно, не возможно без многих из генов, описанных выше, и мутации в многих из

их летальны, но термин "ген клеточного деления" обычно используется, когда мутация непосредственно

ведет к видимому дефекту в делении без других непосредственных эффектов на клеточный рост,

формирование клеточной стенки, репликацию ДНК или сегрегацию. Обычно, блок деления не приводит

к немедленному прекращению роста, и клетки продолжают удлиняться некоторое время. Это приводит

к формированию длинных филаментов, поэтому большинство жизненно важных генов клеточного

деления имеют аббревиатуру fts (filamentous temperature sensitive). Если говорить о гене, который

является абсолютно необходимым для деления каждой

бактерии, то единственный ген из известных в настоящее

время соответствует этому определению - ftsZ (даже этот

ген вероятно отсутствует в по крайней мере одной

бактерии - недавно сиквенированный геном Chlamydia

trachomatis не имеет узнаваемого гомолога ftsZ). Но ftsZ в

одиночку оказывается достаточным для деления только

самых простых бактерий, например M. genitalium,

живущих в идеальной богатой питательными веществами

окружающей среде при постоянной температуре и

постоянном осмотическом давлении и следовательно не

нуждающихся (и не имеющих) муреиновой клеточной

стенки. Другие бактерии должны иметь дополнительные

структуры, чтобы выживать в своих местообитаниях.

Рис.10.3. Молекулярная машина

Одна из этих дополнительных структур - муреиновая

биосинтеза пептидогликана

клеточная стенка, типичная для огромного большинства

- 50 -

Eubacteria. Присутствие клеточной стенки немедленно создает серьезные проблемы при делении.

Жесткой и находящейся под постоянным осмотическим давлением изнутри муреиновой клеточной

стенке требуется набор белков для правильного разделения пополам при делении клетки без нарушения

целостности структуры, и эти белки должны действует координированно с другими белками,

необходимыми для деления как такового.

ftsZ - ген клеточного деления, которому уделяется наибольшее внимание в последнее время, после

обнаружения того, что его продукт образует кольцо на внутренней стороне цитоплазматической

мембраны в центре клетки. Ген ftsZ, расположенный в кластере mra на 2.5 минуте хромосомной карты,

кодирует наиболее многочисленный белок клеточного деления, который присутствует в количестве от

5,000 до 20,000 копий на клетку. FtsZ белок разделяет некоторое сходство последовательности с

эукариотическими тубулинами,что согласуется с его слабой ГТФазной активностью. Недавнее

определение кристаллических структур FtsZ и тубулина подтвердило, что трехмерные структуры этих

белков очень похожи несмотря на низкий уровень сходства первичной последовательности. N-концевые

ГТФ-связывающие домены этих белков являются фактически идентичными, и C-концевые домены

также очень схожи, хотя гомология первичных последовательностей C-концевых доменов не

детектируется. Функциональное сходство FtsZ с тубулинами подтверждается его способностью

собираться in vitro в протофиламенты и мини-кольца, которые близко напоминают структуры,

формирыемые тубулином. Учитывая диаметр этих протофиламентов и диаметр клетки, количество FtsZ

в клетке достаточно, чтобы образовать протофиламент, окружающий клетку 20 раз. Способность FtsZ

полимеризоваться (димеризоваться), была недавно демонстрирована in vivo.

В настоящее время считается, что сокращение кольца, образованного молекулами FtsZ, приводит к

продвижению молекулярных машин, синтезирующих клеточную перегородку в месте деления.

Формирование этого кольца является самым ранним видимым признаком деления и может быть

обнаружено очень рано в клеточном цикле. Было также показано, что кольца FtsZ могут образовываться

в ftsA, ftsQ и ftsI мутантах, так же, как и в ftsW и ftsK штаммах, таким образом указывая, что продукты

этих генов не требуются для сборки кольцевой структуры и скорее действуют позже в процессе

деления. FtsZ может также образовывать и некольцевые структуры, например дуги в rodAsui мутанте и

спирали в штамме ftsZ26. Эти структуры могут сокращаться и таким образом определять форму

отклоняющейся септы. Это также косвенно предполагает, что сборка кольца FtsZ начинается на "сайте

нуклеации" на внутренней мембране (возможно, другом белке клеточного деления), от которого и

начинается его двунаправленная полимеризация. Другой подход, основанный на наблюдении гибридов

FtsZ-GFP in vivo, также подтверждает присутствие Z-колец в живых клетках; более того, когда

гибридный белок сверхпродуцируется, наблюдаются спиральные структуры. FtsZ-GFP также иногда

образует двойные кольца в клеточном центре. Делеция 67 неконсервативных C-концевых остатков FtsZ

в гибридном белке предотвращает формирование Z-кольца, но не останавливает полимеризации, более

того, полимеры, формирующиеся с этим делеционным вариантом

(спирали и толстые листы),

оказываются гораздо более устойчивыми и имеют более яркую флюоресценцию.

Гомологи FtsZ были найдены в разнообразных Eubacteria и Archaea, включая все организмы, для

которых полные геномные последовательности уже определены (кроме C. trachomatis); этот белок был

найден даже в высшем растении, Arabidopsis thaliana, где он кодируется ядерным геном, но очевидно

требуется для деления хлоропластов.

Свойства Z-кольца, главным образом его формирование рано в клеточном цикле, местоположение

в середине клетки на будущем сайте деления, и его видимое сокращение в течение процесса деления,

обеспечивают привлекательное основание для предположений, что кольцо FtsZ может быть сайтом

сборки для других белков, вовлеченных в деление, а также движущей силой или, по крайней мере, ее

составляющей, направляющей образование септы. Для выполнения этих двух предполагаемых функций

FtsZ должен взаимодействовать по крайней мере с некоторыми из предложенных участников комплекса

деления. Некоторое доказательство для такого взаимодействия появилось недавно и обсуждается позже

в этой главе.

Ген ftsA, расположенный перед ftsZ, кодирует 46 kDa белок, присутствующий в количестве

приблизительно

150 молекул на клетку. Правильное отношение FtsA к FtsZ

(1:100) является

необходимым для успешного деления. Цитоплазматическая форма FtsA может фосфорилироваться и в

фосфорилированном состоянии является способной к связыванию АТФ, тогда как в

нефосфорилируемой форме белок связывается с клеточной мембраной. Белок

- член большого

- 51 -

семейства АТФ-связывающих белков, которые включают актины и белки теплового шока (HSP70), и

было предположено, что белок имеет трехмерную структуру, типичную для представителей этого

семейства . Однако мутации по основаниям, которые, как предполагается, являются необходимыми для

функции АТФазы, так же, как и по фосфорилируемым остаткам, не изменяет способность белка

комплементировать известные температурочувствительные мутации ftsA. Недавно было показано с

использованием иммунофлуоресцентной микроскопии и GFP гибридов, что FtsA следует

непосредственно за FtsZ во время деления - кольцо визуализируется в середине клетки, немного позже

чем кольцо FtsZ, и эти структуры ведут себя точно тем же самым способом в различных мутантах,

которые имеют некольцевые FtsZ структуры

(спирали или дуги). FtsA, вероятно, включается в

формирующуюся структуру септы немедленно после того, как образуется кольцо FtsZ. Это утверждение

основано на факте, что кольца FtsZ могут образовывать в мутантах FtsA, но не наоборот . Еще одно

доказательство в пользу этого - то, что гибридный белок FtsA-GFP, обычно локализующийся в центре

клеток, образует спиральные структуры (такие же, как и у FtsZ-GFP гибридов), когда концентрация FtsZ

увеличена. Также, часть гибридного белка FtsA-GFP оказывалась ассоциированной с мембраной, что

подтверждает существование двух субпопуляций FtsA, локализованных в цитоплазме или клеточной

мембране согласно состоянию их фосфорилирования.

ftsQ находится перед геном ftsA. Его продукт - 31 kDa белок цитоплазматической мембраны с

единственной N-концевой трансмембранной α-спиралью. Большая часть белка расположена в

периплазме . FtsQ белок, по оценкам, присутствует в количестве от 50 до 100 копий на клетку. Мутанты

этого гена дают филаменты без признаков сокращений, но сокращения становятся видны, если ввести

вторую мутацию в гене rodA, что свидетельствует в пользу действия FtsQ после FtsZ.

Цитоплазматический и трансмембранный домен FtsQ не являются специфическими для его функции и

могут быть заменены мембранным якорем от другого белка. Периплазматический домен - единственная

часть белка, требующаяся для септальной локализации и достаточная для комплементации ftsQ1ts

мутанта. Правильная локализация FtsQ зависит от цитоплазматических белков FtsZ и FtsA, но не от

периплазматических FtsL или FtsI. Это свидетельствует в пользу того, что FtsQ действует на

промежуточной стадии образования септы и вероятно взаимодействует с периплазматическим белком,

отличным от FtsL и FtsI, для достижения правильной локализации во время деления.

ftsW расположен между murD и murG в генном кластере mra. Мутанты ftsW филаментируют без

видимых сокращений даже когда объединены со сферическими мутациями, что предполлагает раннюю

роль в клеточном делении. Высокая гидрофобность и гомология с RodA предполагают локализацию

белка во внутренней мембране. Было предложено, что белок FtsW взаимодействовует с PBP3, но нет

никакого прямого доказательства этого взаимодействия. Ранний блок деления в мутантах ftsW может

быть обусловлен стабилизацией кольца FtsZ, поскольку кольцо отсутствует у 50 % филаментов в

штамме, полностью лишенном FtsW, и число колец уменьшено у оставшихся 50 %.

ftsN ген, расположенный на 88.5 минуте, кодирует 36 kDa белок с трансмембранным сегментом

около N-конца, коротким N-концевым цитоплазматическим и большим периплазматическим доменами.

Белок присутствует в количестве приблизительно 50 молекул на клетку. Цитоплазматический домен

белка оказывается абсолютно необязательным, и трансмембранный сегмент может быть заменен

трансмембранным доменом MalG или даже отрезаемой сигнальной последовательностью белка MalE,

из чего следует, что только периплазматическая часть белка определяет его специфическую функцию. С

другой стороны, перемещение белка в периплазму абсолютно необходимо для его нормального

функционирования. Ген был первоначально изолирован как мультикопийный супрессор ftsA12 мутации,

а затем была показана его способность супрессировать ftsI23 и ftsQ1 мутации, две мутации ftsW и ftsK44

. Так как истощение клеточного запаса FtsN ведет к филаментации (длинные несегментированные

филаменты), он считается жизненно необходимым белком клеточного деления. Мутантный фенотип,

количество белка и его местоположение вели к предложению, что FtsN функционирует вместе с FtsQ,

FtsI и FtsL в 'стехиометрическом комплексе' на сайте формирования септы.

ftsL (mraR) находится близко к самому началу генного кластера mra. Его продукт - 13.6 kDa белoк

цитоплазматической мембраны с одним пронизывающим мембрану доменом и большeй частью белка,

расположенной в периплазме. Белок присутствует в количестве от 30 до 40 копий на клетку, и мутация

ведет к продукции несегментированных филаментов. Белок содержит лейциновую застежку, которая

- 52 -

может быть жизненно важна для его функции, возможно управляя его димеризацией. FtsL

мембранный белок с маленькими цитоплазматическими и трансмембранными доменами и большим

периплазматическим доменом. В отличие от некоторых других белков деления, и цитоплазматические,

и пронизывающие мембрану домены оказывались специфичными и жизненно важными для

правильного функционирования этого белка. Недавняя работа продемонстрировала, что, подобно

нескольким другим белкам клеточного деления, FtsL образует кольцевную структуру в центре клетки

довольно поздно в процессе деления. Эта локализация зависит от функции FtsZ, FtsA и FtsQ, но не FtsI.

С другой стороны, локализация FtsQ, FtsA и FtsZ не требует FtsL.

zipA ген был обнаружен недавно при помощи процедуры аффинного блоттинга, в течение поиска

белков, специфично взаимодействующих с FtsZ. Ген оказался жизненно важным. Его инсерционная

инактивация в присутствии комплементирующей термочувствительной плазмиды дает длинные

несегментированные филаменты при непермиссивной температуре. Интересно, что сверхэкспрессия

ZipA также блокировала клеточное деление, но этот блок может быть полностью преодолен путем

увеличения количества FtsZ, что также свидетельствует в пользу возможности взаимодействия между

этими двумя белками. Кроме того, гибриды ZipA::GFP локализовались в кольцевной структуре в

середине клеток в 91 % случаев, иногда будучи видимыми даже в очень молодых клетках. Это

напоминает поведение FtsZ колец, описанных. ZipA - белок с предсказанным молекулярным весом 36

kDa, который мигрирует как 50 kDa на гелях SDS-PAGE. Самый N-конец белка предположительно

локализуется во внутренней мембране, а остальная часть

- в цитоплазме. Немедленно после

пронизывающего мембрану домена есть и богатая пролином и глутамином областьразмером 103

остатка, которая может образовывать жесткий линкер между мембранным якорем и C-концевым

доменом белка. Эта структура, так же, как и местоположение белка, делает его хорошим кандидатом на

роль связки между мембраной и кольцом FtsZ. Возможность прямого взаимодействия между ZipA и

FtsZ поддержана присутствием мотивов в последовательности ZipA, подобных доменам связывания с

микротрубочками нескольких эукариотических белков, и демонстрации стабилизации FtsZ-

протофиламентов in vitro при помощи ZipA. Hale и de Boer первоначально предложили возможную роль

ZipA как центра нуклеации сборки кольца FtsZ (что соответствует его присутствию в количестве 1-10 %

FtsZ). Это предположение, однако, может быть и неверно, так как более поздняя работа показала, что Z-

кольца по прежнему образуются в отсутствии ZipA, хотя количество сформированных колец и

уменьшатся. Срединная локализация самого ZipA оказывалась FtsZ-, но не FtsA- или FtsI зависимой . И,

в свою очередь, септальная локализация FtsA не зависела от ZipA.

ftsI находится в том же самом кластере, что и ftsQAZ, и кодирует специфическую для септы

синтетазу муреина, PBP3 . Белок, как оценивают, присутствует в 50-100 копиях в клетку . PBP3 -

трансмембранный белок с каталитическим доменом, расположенным в периплазме. Мутанты

филаментируют с сокращениями, видимыми только после введения сферической мутации. PBP3 -

специфическая для деления транспептидаза. Было высказано предположение, что PBP3 требуется

какой-то дополнительный белок, чтобы проявить трансгликозилазную активность, подобно PBP2 и

RodA белкам. FtsW был предложен для этой функции на основе сходства последовательности между

FtsW и RodA; доказательство для этого взаимодействия, однако, отсутствует.

Белок локализуется к септе на последних стадиях деления; часть белка также наблюдается на

клеточных полюсах. Для правильной септальной локализации белка требуется его собственный

трансмембранный домен, а также FtsZ, FtsA, FtsQ, и FtsL.

Ген ftsK расположен на 20 минуте хромосомы после SOS-индуцибельного промотора (dinH) и

кодирует цитоплазматический мембранный белок с предсказанным размером приблизительно 147 kDa.

Белок высоко гомологичен нескольким белкам SpoIIIE грамположительных бактерий. В B. subtilis этот

белок ответствечает за правильное распределение одной из сестринских хромосом в споровый

компартмент, а также может быть вовлечен в завершение септы. Кроме того, C-концевая часть белка

имеет существенную гомологию со множеством Tra белков плазмид Streptomyces и конъюгативного

транспозона Tn916. FtsK, подобно SpoIIIE, имеет гидрофобную N-концевую область с несколькими

потенциальными трансмембранными сегментами и большим цитоплазматическим доменом,

содержащим нуклеотидсвязывающий мотив. Белок локализован в центре клетки во время клеточного

- 53 -

деления, а при помощи гибрида N-концевого мембранного домена FtsK с белком GFP было показано,

что только N-концевые 15 % белка требуются для правильной локализации. Та же самая N-концевая

часть достаточна для комплементации ftsK44 мутации. Изолированная первой термочувствительная

мутация ftsK44 локализуется в этой части белка в одном из α-спиральных трансмембранных сегментов,

и это мутационное изменение фактически предотвращает правильную локализацию белка. Фенотип

двойного мутанта ftsK rodA свидетельствует в пользу того, что белок действует поздно в делении. Это

поддержано выбором времени локализации FtsK - FtsK-GFP гибрид локализуется на сайте деления

только тогда, когда уже есть видимое сокращение. С другой стороны, данные иммунофлуоресценции

указывают на то, FtsK локализуется к септе рано, что поддерживается гладким фенотипом филаментов,

образуемых нулевым мутантом.

Недавние данные предлагают, что С-концевая часть белка, которая имеет самую высокую

гомологию с SpoIIIE и другими белками с "ДНК-мобилизующей" функцией, действительно требуется

для нормального разделения ДНК между сестринскими клетками в течение деления. Чтобы подвести

итог, N-концевая часть FtsK вероятно играет некоторую роль при завершении септы, в то время как С-

концевой домен необходим, чтобы переместить ДНК, которая могла бы быть поймана закрывающейся

септой, в правильный компартмент.

10.1.4. Сегрегация нуклеоидов.

Очевидно, клетка должна копировать свою хромосому в течение каждого клеточного цикла и

гарантировать, что полученные копии окажутся в различных дочерних клетках. Поэтому деление

должно быть так или иначе скоординировано с репликацией хромосомы и сегрегацией нуклеоидов.

Поскольку скорость репликации ДНК при данной температуре постоянна, клетки достигают

необходимого числа полных хромосом к времени деления через контроль инициации репликации -

интервалы между событиями инициации равны интервалам между делением. Это приводит к тому, что

быстро растущие клетки имеют множественные хромосомы.

Разделение сестринских нуклеоидов, очевидно, является необходимой предпосылкой для деления,

и похоже, что пространство, свододное от нуклеоидов, может определять расположение септы (и, в

свою очередь, формирование септы ингибируется в областях, где нуклеоид присутствует). В настоящее

время нет полного согласия по поводу механизмов, осуществляющих разделение нуклеоидов, но

недавно было продемонстрировано, что E. coli (также как другие бактерии) имеет активный подобный

митотическому аппарат сегрегации . К сожалению, не известно, какие белки вовлечены в быструю

сегрегацию точек начала репликации хромосом. Два возможных кандидата на эту роль - FtsK и

продукты muk генов.

mukB мутанты имеют слегка филаментирующий фенотип и существенный процент безъядерных

клеток. У мутанта хорошо выражено нерегулярное разделение нуклеоидов. MukB - самый крупный из

охарактеризованных прокариотических белков. Он разделяет некоторое сходство с эукариотическими

миозинами и имеет доменную структуру, напоминающую об эукариотических моторных белках

кинезине и миозине, что совместимо с его предложенной функцией моторного белка, перемещающиеся

нуклеоиды. Эта возможность поддерживается недавней демонстрацией специфического связывания

MukB с микротрубочками. В дном опероне с mukB расположены два других гена, mukE и mukF. Их

инактивация также ведет к дефекту в разделении нуклеоидов и продукции безъядерных клеток.

Очищенный MukB белок имеет низкую АТФазную и ГТФазную активности. N-концевой домен

MukB связывается с высокой аффинностью с FtsZ. FtsZ может стимулировать АТФазную и ГТФазную

активности MukB. Эти свойства совместимы с предполагаемой функцией MukB как моторного белка,

использующего FtsZ как опору для генерации силы внутри клеток E. coli. Поскольку кольцо FtsZ

собирается рано, MukB мог бы использовать это как "маркер", чтобы отодвинуть нуклеоиды от сайта,

где будет сформирована будущая септа. В соответствии с этим продемонстрировали двунаправленное

перемещение регулятора инициации репликации SeqA. Это перемещение происходило после

формирования Z-кольца и требовало присутствия MukB.

Продукт гена ftsK является другим кандидатом на участие в разделении хромосомы. Первичная

структура FtsK имеет сильное сходство с белком SpoIIIE B. subtilis и множеством Tra белков

конъюгативных плазмид Streptomyces, для которых участие в перемещении ДНК было

продемонстрировано. Первоначальная ftsK44 мутация не влияла на сегрегацию хромосом, но, когда

- 54 -

экспрессия C-концевого домена была уменьшена, дефект сегрегации был действительно обнаружен.

10.1.5. Дифференциация сайтов деления: система min.

Функция генов в локусе minB должна предотвратить формирование септы в неправильном месте.

Локус состоит из трех генов, minC, minD и minE. Белки MinC и MinD действуют вместе, образуя

неспецифический ингибитор формирования септы, блокирующий клеточное деление на всех доступных

сайтах. Белок MinE предотвращает действие этого ингибитора на внутренних сайтах, тем не менее

разрешая ему действовать на клеточных полюсах. Хотя MinC обычно нуждается в активации белком

MinD, чтобы функционировать должным образом, он может также действовать вместе с другим

ингибитором деления, DicB. В мутантах minB (лишенных MinC или MinD) септа может формироваться

или внутри клетки или на ее полюсах, но общее количество септ то же самое, что в нормальных

клетках. Каждое полярное деление потребляет "квант" "потенциала деления" и одно центральное

деление утрачивается, таким образом делая клетку длиннее. Следует также заметить, что время до

следующего деления обратно пропорционально длине клетки, но даже в самых длинных клетках только

одна септа может формироваться одновременно.

Местоположение MinD во внутренней мембране было определено иммуноэлектронной

микроскопией. Было также показано, что MinD имеет активность АТФазы in vitro.

Было показано, что, несмотря на свои маленький размер (88 AК), белок MinE имеет три отдельных

домена с различными функциями. Маленький N-концевой домен необходим, чтобы противодействовать

активности ингибитора деления MinCD, центральная область может быть вовлечена в димеризацию или

олигомеризацию, а большая C-концевая часть определяет топологическую специфичность функции

MinE, позволяя ему действовать только на внутренних сайтах деления. Недавно было показано, что

MinE образует кольцевную структуру около середины молодых клеток. Формирование этого кольца

требовало MinD, но было независимо от MinC и FtsZ. Таким образом, в настоящее время MinE

выглядит как белок, первым появляющийся на формирующемся сайте деления, что, возможно, является

необходимым для правильной локализации кольца FtsZ, хотя не для его формирования.

Пока еще в точности не известно, как работают Min белки. Попытка показать прямое

взаимодействие этих трех белков с их наиболее вероятной мишенью, FtsZ, оказалась неудачной; хотя

этот подход, использующий дрожжевую двухгибридную систему, легко показывает взаимодействие

между членами системы Min и то, что MinE уменьшает взаимодействие между MinC и MinD. Природа

топологического сигнала, узнаваемого белком MinE, также неизвестна.

10.1.6. Сборка и порядок действия белков клеточного деления на сайте деления.

Бактериальное клеточное деление, хотя и кажется простым на первый взгляд, является фактически

весьма сложным процессом, в котором принимает участие много белков. Очевидно, что действие этих

белков должно быть скоординировано так или иначе, и самый легкий путь, которым такая координация

могла бы быть достигнута - через формирование макромолекулярного комплекса на сайте деления.

Предполагается, что эта, все еще в значительной степени гипотетическая, структура, названная

дивисомой или септатором, собирается на сайте деления в самом его начале. Процесс, вероятно,

начинается на сайте нуклеации, где инициируется сборка Z-кольца. Предполагается, что другие белки

деления включаются в состав дивисомы после формирования Z-кольца.

Хотя генетическое доказательство в пользу возможности взаимодействия между генами

клеточного деления существовало в течение некоторого времени, только прямая демонстрация белок-

белкового взаимодействия могла доказывать, что это взаимодействие действительно имеет место. Эти

данные начали накапливаться недавно. zipA ген был фактически обнаружен через прямое связывание

его продукта с FtsZ. Специфическое связывание очищенного N-концевого домена MukB с FtsZ было

недавно продемонстрировано. Косвенное доказательство для FtsA-FtsZ взаимодействия обеспечивается

исследованиями локализации гетерологичного FtsA в E. coli. FtsA белок из Rhizobium meliloti или

Agrobacterium tumefaciens был способен локализоваться правильно в клетках E. coli, только если FtsZ

белок от того же самого организма также обеспечивался. Взаимодействие между FtsZ и FtsA также

наблюдалось при использовании дрожжевой двухгибридной системы . Также, косвенное доказательство

существует для возможного взаимодействия FtsW с PBP3 и PBP3 и PBP1B. Взаимодействие между

высокомолекулярным PBP и литическими ферментами уже было обсуждено выше.

Недавнее изучение локализации белков клеточного деления с использованием

- 55 -

иммунофлуоресценции и гибридов с GFP обеспечило информацию относительно локализации в

середине клетки некоторых белков, что является предпосылкой для их участия в дивисоме. Локализация

в сайте деления была сначала показана для FtsZ с использованием окрашивания иммунозолотом, а затем

подтверждена иммунофлуоресцентной микроскопией и in vivo с использованием гибридов с GFP.

Несколько других белков деления также локализовались в септе - FtsA, FtsQ, ZipA , FtsW.

Недавние эксперименты с локализацией белков деления в нескольких fts мутантах дают ключ к

порядку их привлечения в дивисому и, возможно, к последовательности их действия во время деления.

Расположение FtsA в середине клетки зависит от предшествующего формирования Z-кольца .

Перемещение FtsQ к септе требует FtsZ и FtsA, но не FtsL и FtsI. Септальная локализация FtsI

оказывается зависящей от присутствия FtsZ и FtsA, так же, как FtsL и FtsQ. В то же время, сборка колец

FtsZ слегка нарушена, если инактивирован PBP3, а сокращение кольца не происходит. FtsN также

образует кольца в центре клетки, но требует не только FtsZ, но также и FtsA, FtsQ и FtsI для правильной

локализации. Хотя фенотип первоначального ftsK мутанта и результаты, полученные с GFP гибридами

предполагали позднее время действия для FtsK, иммунофлуоресцентное мечение показало, что белок

локализовался к септе довольно рано; только FtsZ и FtsA, но не FtsQ или FtsI требуются для правильной

локализации.

Подводя итог, можно сказать, что доступные данные предлагают следующий порядок сборки в

"дивисому" нескольких белков деления: FtsZ-FtsA-FtsQ-FtsL-FtsI. FtsN может быть включен в септу

после FtsI, но мультикопийная супрессия мутаций в генах, кодирующих FtsA, FtsQ, FtsI и FtsK, может

указывать более раннюю роль для белка. FtsK включается в септу после FtsA, но не известно, зависят ли

более поздние белки от его локализации. ZipA и FtsA локализуются к септе после FtsZ и не требуют

присутствия друг друга для этой локализации. FtsW может действовать прежде FtsZ, по крайней мере

это требуется для стабилизации Z-кольца (Рис. 10.4).

FtsI - фермент, абсолютно требуемый для синтеза муреина септы, - является одним из последних

белков, включаемых в дивисому. С другой стороны, сокращение Z-кольца требует активности FtsI. Это

указывает, что целая структура дивисомы,

возможно, должна быть собрана прежде, чем

начнется синтез септы и ее сокращение. FtsI

может также обеспечивать связь между

периплазматическим

пептидогликансинтезирующим комплексом

(обсужденным выше) и белками клеточного

деления. Хотя прямое взаимодействие FtsI с

любым другим белком клеточного деления

не было демонстрировано, косвенные

доказательства

таких

взаимодействий

свидетельствуют в пользу того, что FtsI

часть

дивисомы.

Поскольку

непосредственное связывание FtsI с другими

муреиновыми синтетазами и литическими

ферментами было обнаружено, эти белки

также должны входить в состав дивисомы.

Важная проблема возникает из-за того,

что многие из белков клеточного деления

присутствуют в количествах, намного

меньших, чем FtsZ. Например, соотношение

FtsA к FtsZ обычно составляет 1:100. FtsQ,

FtsL (?) и FtsN (?) вероятно присутствуют в

еще меньших количествах, чем FtsZ. Было

предложено, что "минорные" белки образуют

Рис.10.4. Сборка аппарата деления Escherichia coli

комплексы друг с другом, "подсборки",

которые присоединены к Z-кольцу, но

расположены далеко друг от друга в начале

- 56 -

сокращения, сдвигаясь ближе друг к другу только в процессе сокращения. Не известно, какая сила

является ответственной за сокращение кольца и прогресс деления.

Конечная стадия деления должна отличаться от сокращения, потому что дивисома должна быть

демонтирована, и дочерние клетки должны разделиться, что может (или нет) требовать дополнительных

белков для расщепления пептидных связей, которые вероятно скрепляют две клетки. Альтернативно,

этот шаг мог быть выполнен "нормальными" литическими ферментами.

10.1.7. Регуляция клеточного деления.

Наиболее важный вопрос о регуляции клеточного деления - о правильном выборе времени сборки

и точном размещении септы, - все еще остается в значительной степени без ответа. Есть, однако,

некоторая информация относительно других аспектов регуляции деления - регуляция транскрипции

нескольких генов деления, участие белковых регуляторов на уровне транскрипции или прямых белок-

белковых взаимодействий и специальный случай регуляции деления во время SOS ответа.

Транскрипционная регуляция.

Большинство генов клеточного деления расположены в большом генном кластере dcw (division and

cell wall) или mra на 2 минуте хромосомы E. coli (Рис. 10.5). Несколько mur генов, вовлеченных в синтез

пептидогликана, также расположены в этом кластере. Транскрипционные терминаторы не были

найдены в пределах этого большого кластера из 16 генов, что вело к предположению, что весь кластер

составляет один оперон. Гены в кластере обычно разделены только несколькими парами оснований, а в

некоторых случаях даже перекрываются, что предполагает возможность трансляционного сопряжения.

Поскольку структура оперона обычно подразумевает какую-то координацию генной регуляции,

проводились исследования регуляции транскрипции генов в этой области. Большинство генов в

кластере имеет несколько промоторов, в различной степени ответственных за их транскрипцию и

иногда реагирующих на различные стимулы окружающей среды.

Рис.10.5. dcw (mra) оперон генов клеточного деления и биосинтеза пептидогликана Escherichia

coli

- 57 -

Сильный промотор расположен в самом начале кластера dcw. Этот промотор mra необходим для

полной экспрессии первых девяти генов, до ftsW. Инактивация этого промотора не летальна, если

первые девять генов кластера введены в клетку in trans, что указывает на присутствие дополнительных

промоторов, способных к транскрипции нижележащих генов. Оказывается, однако, что транскрипция

всех нижележащих генов, включая ftsZ, уменьшена, если этот (mra) промотор инактивирован.

Хотя промотор mra, вероятно, важен для нормальной транскрипции всех генов в кластере dcw,

дополнительные промоторы в пределах кластера также важны и были фактически охарактеризованы

первыми. Из-за очевидной значимости ftsZ в клеточном делении регуляция его транскрипции была

изучена наиболее экстенсивно. Гену предшествует набор промоторов различной силы и типов, что,

вероятно, отражает потребность настройки экспрессии гена в различных условиях. Первоначально

основная роль в транскрипции ftsZ была приписана его двум проксимальным промоторам. Однако

позже было показано, что наиболее сильный из этих "промоторов" на самом деле является сайтом

процессинга для РНКазы E. Когда это было принято во внимание, оказалось, что почти половина

транскриптов ftsZ происходила от двух промоторов в пределах ddlB. Однако позже было показано, что

еще более сильный промотор расположен выше и две трети транскриптов начинаются перед ddlB. Это

коррелирует с более ранним наблюдением, что более чем 6 т.н.п. перед ftsZ требуются для его

нормальной экспрессии.

Регуляция экспрессии ftsZ с его проксимальных промоторов оказывается важной для надлежащего

функционирования аппарата деления (Рис. 10.6). Вставка управляемого tac промотора непосредственно

перед ftsZ вела к заметным изменениям нормального цикла деления, хотя клетки остались

жизнеспособными. Это может указывать на то, что нормальный промотор ftsZ так или иначе регулирует

транскрипцию гена в течение клеточного цикла (результат этой регуляции может максимизировать

число жизнеспособных клеток на единицу массы). Эта возможность поддерживается колебанием

количества транскрипта ftsZ в синхронизированных клетках. Также наблюдалось изменения в

количестве транскрипта ftsZ, но приписывали их временному ингибированию транскрипции после

репликации этой хромосомной области. Транскрипция, начинающаяся перед ftsA, показала

периодичность и составляла существенную пропорцию транскриптов, захватывающих FtsZ, в то время

как проксимальный промотор ftsZ транскрибировался конститутивно в течение всего клеточного цикла.

Хотя эти сообщения о колеблющихся уровнях транскрипта в течение клеточного цикла

обеспечивают возможную связь между регуляцией генной экспрессии и иницииацией клеточного

деления, неизвестно, как уровни транскрипта управляются, т.е. какие белки и промоторы являются

ответственными за эти колебания. С другой стороны, регуляция транскрипции, начинающейся с двух

промоторов, расположенных в пределах ddlB, была изучена более подробно.

sdiA ген (suppressor of division inhibition) был изолирован по его способности супрессировать

действие нескольких ингибиторов деления. Будучи сверхэкспрессированым, его продукт индуцировал

формирование мини-клеток и позволял мутанту ftsZ84 делиться при непермиссивной температуре. Эти

эффекты наблюдались из-за того, что белок SdiA активировал транскрипцию с одного из промоторов в

ddlB перед ftsQAZ и envA генами.

Значение этой активации не ясно,

поскольку ген не является жизненно

необходимым. Однако ген может

играть роль в стационарной фазе,

потому что белок имеет обширную

гомологию с большим семейством

LuxR-подобных транскрипционных

активаторов

"quorum

sensing"

семейства. Все известные активаторы

этого семейства работают в паре с

другим геном (гомологичным luxI),

чьей функцией является продукция

маленькой

свободно

Рис.10.6. Регуляция экспрессии проксимальных

диффундирующей молекулы, N-

промоторов ftsZ у Escherichia coli

ацил-гомосеринлактона, с ацил-

цепью, длина которой варьирует у

- 58 -

различных видов. Поскольку эта молекула накапливается при увеличении плотностьи клеток в

популяции, luxR-подобный ген активирует транскрипцию соответствующего регулона. Интересно, что

E. coli явно не имеет гомолога luxI, что поднимает вопрос: что действует как активатор SdiA? Две

противоречивых работы рассматривали эту проблему. Не было найдено никакого доказательства

эффекта предполагаемого автоиндуктора на регуляцию SdiA-зависимого промотора

(ftsQp2).

Фактически, они наблюдали небольшое (30-35%) уменьшение транскрипции с этого промотора в

течение роста в "культивированной" среде, в которой предварительно выращивались клетки E.coli. Этот

эффект был меньше, чем снижение транскрипции с того же самого промотора (40-60%) в результате

инсерционной инактивации гена sdiA. Вопреки этому сообщению, позднее было продемонстрировано

не только увеличение транскрипции с ftsQp2 промотора в стационарной фазе, но также и активацию

этого промотора автоиндукторами V. fischeri и V. harveyi, так же, как "культивированной" средой. Это

свидетельствует в пользу того, что sdiA действительно действует подобно другим luxR-подобным

регуляторам, хотя нативная молекула автоиндуктора в E.coli остается неизвестной.

rpoS ген, кодирующий сигма-фактор стационарной фазы, также вовлечен в регуляцию

транскрипции ftsQAZ генов. В частности ftsQp1, один из нескольких промоторов, ответственных за

транскрипцию ftsQAZ генов, но никакой другой промотор в ddlB-ftsZ области, зависит от RpoS.

stfZ - маленький ген, транскрибирующийся с антисмысловой цепи в 5' области ftsZ. Присутствие

промоторной активности и функционального терминатора в этой области было показано, а

ингибирование клеточного деления при повышенных температурах, когда эта область ДНК

присутствует в множественных копиях, вело к предложению, что она действует как антисмысловая

РНК, блокирующая трансляцию ftsZ подобно реликтовому фаговому гену dicF.

Посттранскрипционная регуляция.

Хотя многие, если не все, гены в кластере mra транслируются с полицистронных мРНК,

относительная эффективность трансляции различных ORF изменяется значительно. Это неудивительно,

поскольку продукты различных генов клеточного деления присутствуют в клетке в весьма различных

количествах. FtsZ является, вероятно, наиболее распространенным (до 20,000 молекул в клетку), а FtsQ

- одним из наименее распространенных. Несколько ORF в этой области не имеют хороших

рибосомсвязывающих сайтов и, кроме того, несколько генов имеют отличные от ATG старт-кодоны.

Это подразумевало, что трансляция различных ORF в этой области должна демонстрировать

существенные различия в эффективности, и это действительно имеет место.

Другой важный аспект посттранскрипционного контроля клеточного деления - ингибирование

деления в течение SOS ответа. Повреждение ДНК в E.coli индуцирует экспрессию нескольких генов,

которые исполняют две функции, важные для выживания клетки. Некоторые из индуцируемых белков

вовлечены в восстановление ДНК, но функция других заключается в том, чтобы задержать клеточное

деление, пока ДНК не восстановлена. SOS-индуцированый блок деления является результатом действия

белка SulA.

Продукт гена sulA (sfiA) блокирует деление, предотвращая сборку Z-кольца. Использование

дрожжевой двухгибридной системы показало прямое взаимодействие SulA с FtsZ. Было также показано,

что SulA предотвращает полимеризацию FtsZ in vitro. Поскольку сборка кольца FtsZ - ключ к целому

процессу деления, индукция SulA полностью блокирует деление. Как только SOS индукция закончена,

SulA быстро деградируется протеазой Lon, и деление возобновляется.

FtsK также вовлечен в SOS ответ. Одна из предложенных функций этого белка должна

гарантировать, что хромосомы не "защемляются" закрывающейся септой. Инактивация только

цитоплазматической части FtsK позволяет продолжаться делению клетки, но индуцирует SOS ответ,

возможно из-за последующего повреждения ДНК.

10.2. Регуляция клеточного цикла у Caulobacter crescentus.

Бактерия Caulobacter crescentus интересна в плане изучения клеточного цикла потому, что, по

крайней мере на первый взгляд, клеточный цикл этой бактерии наиболее близок к эукариотическому:

имеются четко выраженные G1, S и G2 периоды ( у прокариот сложно пока говорить о М фазе); более

- 59 -

того, в результате деления образуются

Replication

неравноценные клетки (т.е. наблюдается

Chromosome segregation

Cell division

Flagellum

некоторая дифференцировка) - одна из

Motile

Sessile

Asymmetric

Chemot actic

Replication

дочерних клеток имеет жгутик и аппарат

Replication bloc k

initiation

Predivisional

cell

хемотаксиса, а другая неподвижна и

Swarmer

St alked

cell

остается прикрепленной к субстрату

(Рис. 10.7).

В подвижной клетке репликация

ДНК и деление клетки полностью

заблокированы (т.е. имеет место четко

выраженная G1 фаза клеточного цикла,

St alk

которой не наблюдается у быстро

Cell cycle

растущих

энтеробактерий).

Через

некоторое время бактерия утрачивает

Flagellum

St alk

ejection

biogenesis

Flagellar biogenesis

свой единственный полярный жгутик (а

Development

вместе с ним и аппарат хемотаксиса) и на

этом же полюсе клетки формирует

Рис.10.7. Клеточный цикл Caulobacter crescentus

стебелек, которым прикрепляется к

субстрату.

Такое морфологическое

изменение совпадает с инициацией репликации ДНК

(началом S фазы). Во время этой фазы

прикрепленная к субстрату клетка удлиняется и формирует новый жгутик на полюсе клетки,

противоположном стебельку. По завершении репликации ДНК хромосомы перемещаются к полюсам

(фаза G2), за чем следует деление клетки. Таким образом, в каждом цикле деления два типа

морфологически и физиологически различных типа клеток сменяют друг друга: подвижная неспособная

делиться клетка и неподвижная (прикрепленная) способная к росту и делению. Очевидно, что такая

четкая смена поведения клеток должна строго контролироваться, и некоторая информация об этом

контроле имеется.

Центральным регулятором клеточного цикла является белок CtrA, принадлежащий к уже хорошо

нам знакомому классу регуляторов ответа. Этот белок контролирует синтез жгутиков, метилирование

ДНК и ее репликацию, деление клетки (Рис. 10.8).

Контроль репликации ДНК осуществляется путем ее метилирования. CtrA активирует

транскрипцию гена ccrM, кодирующего ДНК-метилтрансферазу, жизненно необходимую для роста C.

crescentus. Транскрипция этого гена происходит исключительно в фазе G2 клеточного цикла, а

поскольку белок CcrM очень быстро деградируется протеазой Lon, то и присутствует в значимых

количествах он только в период своего активного синтеза, т. е. в фазе G2. В результате вновь

реплицированные хромосомы находятся в полуметилированном состоянии значительную часть

клеточного цикла

(фактически всю S

ClpXP

фазу). А поскольку для инициации

репликации ДНК должна быть в

DivJ

DivK

CtrA

полностью метилированном состоянии,

DivL

новый раунд репликации ДНК у C.

crescentus, в отличие от E. coli, не может

CtrA~P

Cc kA

ctrA

начаться,

пока

не

завершится

предыдущий.

CtrA также обеспечивает временной

контроль

за

экспрессией

генов

ccrM

fla

ftsZ

ftsQA

клеточного деления. С одной стороны,

Cori

CtrA-Box

CtrA репрессирует транскрипцию ftsZ в

подвижных клетках, а с другой

активирует транскрипцию ftsQA оперона

Рис.10.8. Основные регуляторы клеточного цикла

в клетках перед самым делением. Таким

Caulobacter crescentus

образом

CtrA

обеспечивает

- 60 -

последовательную транскрипцию сначала ftsZ, а затем ftsQA. Такая последовательность экспрессии

соответствует предполагаемому порядку сборки машины клеточного деления (дивисомы) в центре

делящейся клетки.

Но наиболее важным, пожалуй, в плане контроля клеточного цикла, является негативная

регуляция при помощи CtrA сильного промотора PCori, расположенного внутри точки начала

репликации хромосомы (Cori). Активность этого промотора абсолютно необходима для инициации

репликации ДНК. Минимальный Cori содержит 5 CtrA-боксов (сайтов связывания CtrA), два из которых

перекрываются с областью PCori. Каким-то образом CtrA блокирует транскрипцию с промотора PCori, а

значит, и репликацию хромосомы, во всех клетках за исключением только что сбросивших жгутик и

закрепившихся на субстрате (т.е. репрессия не срабатывает как раз в тех клетках, в которых и

начинается репликация ДНК).

Возможность использовать всего один регуляторный белок для регуляции совершенно разных

функций на протяжении клеточного цикла достигается за счет строгого временного и

пространственного контроля активности CtrA. Как и большинство других регуляторов ответа, CtrA

активен только в фосфорилированном состоянии. Но в таком состоянии этот белок присутствует только

в подвижных клетках и непосредственно перед делением (в G2 фазе). Это достигается путем частично

перекрывающихся механизмов, контролирующих CtrA на уровне экспрессии, стабильности и

фосфорилирования.

Транскрипция ctrA происходит только перед делением, после инициации репликации хромосомы.

Транскрипция происходит с двух промоторов

- слабого P1, активного только в ранних

"предивизионных" клетках и сильного P2, включающегося позже. CtrA регулирует оба промотора,

причем первый репрессирует, а второй активирует. Таким образом, по мере накопления

фосфорилированного CtrA в ранней предивизионной клетке P1 отключается, а P2

, наоборот,

активируется, что дает высокую концентрацию CtrA к концу S фазы. Такой простой авторегуляторный

механизм создает основу для обеспечения нужных концентраций CtrA в соответствующее время. От

последовательного изменения концентраций CtrA зависит, в свою очередь, последовательность

экспрессии контролируемых этим регулятором генов. Так, аффинность CtrA к жгутиковому промотору

fliQ в 20 раз выше, чем к промотору ccrM, поэтому fliQ, так же как и другие зависящие от CtrA

жгутиковые промоторы, транскрибируется в ранней предивизионной клетке, а ccrM активируется

значительно позже, когда концентрация CtrA возрастает.

Для того, чтобы "перезапустить таймер" в новом клеточном цикле, достаточно просто вовремя

удалить CtrA из клетки. И такое удаление действительно имеет место

- CtrA протеолитически

деградируется в поздней предивизионной клетке и во время прикрепления подвижной клетки к

субстрату. Удаление активного CtrA до того, как клетка вступит в S-фазу, важно не только для

авторегуляции CtrA, но и для активации промотора PCori и инициации репликации. Деградация CtrA

происходит под действием АТФ-зависимой протеазы ClpXP. Причем, в отличие от E. coli, инактивация

этой протеазы у Caulobacter является летальной - клетка оказывается "арестованной" в фазе G1

клеточного цикла. Однако каким образом "включается" и "выключается" протеолиз - пока неясно.

Активность CtrA регулируется сразу через несколько путей фосфорилирования. Как известно,

регуляторы ответа (к числу каковых принадлежит и CtrA) активируются путем фосфорилирования

сенсорными гистидинкиназами в ответ на сигналы внешней среды. Вновь синтезированный CtrA

немедленно фосфорилируется, и как минимум три гистидинкиназы

(DivJ, DivL и CckA) могут

участвовать в этом процессе. К сожалению, сигналы, на которые реагируют эти киназы, неизвестны.

Однако известно, что две из этих киназ, DivJ и CckA, локализуются в различных частях клетки, что

свидетельствует в пользу участия пространственной информации в контроле активации CtrA. Так,

CckA, типичная мембранная сенсорная киназа, распределена равномерно на протяжении большей части

клеточного цикла. Однако в ранней предивизионной клетке CckA концентрируется на полюсе клетки,

противоположном стебельку и остается там до момента деления. Полярная локализация абсолютно

необходима для проявления киназной активности CckA и фосфорилирования CtrA. DivJ

концентрируется на противоположном (стебельковом) полюсе во время перехода от G1 к S фазе. Таким

образом, очевидно, что активность CtrA контролируется, по крайней мере частично, различной

природой противоположных полюсов клетки. Каждый вновь сформированный при делении полюс

клетки сначала "жгутиковый", а затем становится "стебельковым". Полюса фактически "маркируются" в

процессе развития различными киназами, от активности которых, в свою очередь, зависит активность

- 61 -

CtrA.

Литература:

1. Magne Østerås and Urs Jenal. Regulatory circuits in Caulobacter. Current Opinion in Microbiology 2000,

3:171-176

2. Christine Jacobs and Lucy Shapiro. Microbial asymmetric cell division: localization of cell fate determinants.

Current Opinion in Genetics & Development 1998, 8:386-391 (less detail but better text overall)

3. J. Lutkenhaus. The regulation of bacterial cell division: a time and place for it. Current Opinion in

Microbiology 1998, 1:210-215

4. J. A. Hoch. Initiation of bacterial development. Current Opinion in Microbiology 1998, 1:170-174

11. Споруляция у Bacillus subtilis.

Процесс споруляции у B. subtilis проходит через серию четко выраженных морфологических

стадий, и его результатом является превращение растущей клетки в двухкамерный спорангий, в

котором и формируется спора. Известно более

125 генов, участвующих в этом процессе. Их

транскрипция контролируется во времени и пространстве четырьмя ДНК-связывающими белками и

пятью сигма факторами, а сигнал для запуска всего процесса поступает от сенсорных систем и путем

переноса фосфатной группы по сложной фосфотрансляционной сети оказывается на одном ключевом

регуляторе ответа, который и запускает каскадную экспрессию громоздкого аппарата споруляции.

Морфология споруляции

Последовательные морфологические стадии споруляции показаны на рисунке 11.1.

Начало споруляции обнаруживается по формированию т. н. аксиального филамента, в котором две

хромосомы после последнего раунда репликации вытягиваются вдоль длинной оси клетки. Затем возле

одного из полюсов клетки формируется перегородка (септа), что разделяет развивающийся спорангий

на два компартмента, материнскую клетку (больший) и преспору. Каждый из этих компартментов

получает по копии хромосомы. На последующих стадиях споруляции преспора обволакивается

материнской клеткой и в конце концов оказывается полностью внутри ее (в связи с чем и называется

эндоспорой).

На

последующих

стадиях

преспора созревает в результате

сложных

биосинтетических

морфогенных процессов, протекающих

в обоих компартментах. Через

6-8

часов созревание заканчивается, и

зрелая спора освобождается путем

лизиса

материнской

клетки.

Последовательность морфологических

событий разделяется на стадии,

которые обозначаются римскими

цифрами 0-VII. Стадия 0 соответствует

клеткам, еще не ставшим на путь

споруляции, стадия I

- начавшим

споруляцию

сформировавшим

аксиальный филамент, стадии II и III

соответствуют спорангиям на стадиях

полярного деления и обволакивания

преспоры материнской клеткой и т.д.

Рис.11.1. Стадии споруляции Bacillus subtilis

Похожая схема используется для

обозначения генов и оперонов,

необходимых для споруляции. Так,

- 62 -

мутации в генах spo0 и spoIII останавливают споруляцию на стадиях 0 и III соответственно. Латинские

буквы различают гены одной стадии между собой (напр., spo0A и spo0B). В оперонах дополнительные

латинские буквы используются для того, чтобы различать членов оперонов между собой (напр.,

spoIIAA, spoIIAB и spoIIAC).

Как принимается решение о начале споруляции?

Бактерии достаточно сложно принять решение о начале споруляции, поскольку этот процесс,

будучи запущенным, уже необратим. А поскольку это решение коренным образом меняет метаболизм

клетки, ошибка может иметь для нее печальные последствия. Поэтому для принятия этого решения

бактерия должна проанализировать множество сигналов от внешней среды от внутриклеточных

метаболических систем, от клеточного цикла. Сигналы могут происходить от нехватки питательных

веществ, плотности популяции, синтеза ДНК, повреждений ДНК, цикла Кребса. Все эти сигналы

интегрируются на уровне одного регуляторного белка (Spo0A). Сигналы передаются на Spo0A в виде

его фосфорилирования через цепь переносчиков фосфата. Spo0A принадлежит к классу регуляторов

ответа из семейства двухкомпонентных регуляторных систем, которые вам уже хорошо знакомы. И той

информации, ктотрой вы уже обладаете, наверное, достаточно, чтробы сделать вывод о том, что в

данном случае сложно будет обойтись простой двукомпонентной системой. И действительно, основу

регуляторной системы споруляции составляет сложная разветвленная фосфотрансляционная сеть. В

качестве источника сигнала могут выступать несколько сенсорных белков (гистидинкиназ), сигнал от

которых (фосфат) поступает на ключевой регулятор через несколько переносчиков. Такая сложная

система создает много точек, в которых можно осуществлять контроль передачи сигнала, что позволяет

тесно координировать многие клеточные события. Поэтому практически каждая стадия передачи

сигнала по фосфотрансляционной сети в той или иной степени подвержена регуляции.

Фосфат в сигнальную фосфотрансляционную систему поступает от двух сенсорных киназ,

цитоплазматической KinA и мембранной KinB, а в качестве получателей этого фосфата выступают два

РО. Первый из них, Spo0F непосредственнно фосфорилируется киназами, тогда как фосфат на второй

РО, Spo0A, попадает от Spo0F через переносчик Spo0B. Spo0A~Ф является транскрипционным

фактором и выступает в роли репрессора либо активатора по отношению к тем генам, чьи функции

являются критическими при переключении клетки с вегетативного роста на споруляцию. Один из таких

генов кодирует репрессор AbrB, который предотвращает экспрессию ряда генов, необходимых при

переключении на споруляцию. Накопление Spo0A~Ф в клетке снижает уровень AbrB и активирует

ранние гены споруляции. Кроме того, Spo0A~Ф является непосредственным активатором генов и

оперонов, таких как spoIIA и spoIIG, кодирующих сигма факторы σF и σЕ, ответственные за локальную

экспрессию

генов

споруляции

соответственно

преспоре и материнской

клетке.

Первый уровень

контроля

осуществляется,

естественно, на уровне

киназ. К сожалению,

эффекторные молекулы,

активирующие

эти

киназы,

пока

не

известны, однако описан

ингибитор

киназной

активности белка KinA.

Активность

этого

ингибитора,

KipI,

контролируется анти-

ингибитором KipA, ген

Рис.11.1. Контроль инициации споруляции у Bacillus subtilis

которого находится в

одном опероне с kipI.

- 63 -

Этот оперон реагирует на доступность глюкозы и фиксированного азота, что позволяет запускать

процесс споруляции при голодании по этим компонентам питания.

Следующий уровень контроля осуществляют аспартил-фосфат фосфатазы, которые удаляют

фосфат с молекул РО фосфотрансляционной цепи. Первой была обнаружена фосфатаза Spo0E,

действующая непосредственно на Spo0A~Ф. К сожалению, до сих пор очень мало информации о том,

как регулируется активность или синтез самой Spo0E. Несколько больше известно о фосфатазах,

действующих на более ранних этапах сигнального пути. Фосфатазы RapA и RapB действуют на

Spo0F~Ф. А поскольку все реакции по пути от Spo0F~Ф к Spo0A~Ф являются обратимыми,

дефосфорилирование Spo0F ведет к быстрому дефосфорилированию и Spo0A.

RapA и RapB регулируются на уровне транскрипции физиологическими процессами, которые

составляют альтернативу споруляции. RapA находится под контролем сигнальной системы

ComP/ComA, ответственной за индукцию состояния компетентности к поглощению ДНК

(физиологическое состояние, несовместимое со споруляцией). А RapB индуцируется условиями,

способствующими вегетативному росту клетки, что позволяет при инициации деления или других

клеточных процессов, несовместимых со споруляцией, предотвращать это переключение метаболизма

путем специфического дефосфорилирования одного компонента фосфотрансляционной цепи.

Еще одна ступень контроля - регуляция регуляторов Spo0A (который тоже является регулятором).

Здесь одним из регуляторов является система контроля плотности бактериальной популяции, зависящая

от пептидного феромона - продукта гена phrA. Ген этот находится в одном опероне с RapA, а его

продуктом является небольшой (всего из 44 АК) белок. На амино-конце белка располагается типичная

сигнальная последовательность, и белок действительно секретируется из клетки по SecA-зависимому

пути. После отрезания сигнального пептида от белка остается всего 19 АК. Оказалось, что этот пептид,

а точнее, только пять карбокси-концевых АК, ингибирует фосфатазную активность RapA. Для этого

ингибирования необходима активная система транспорта олигопептидов в клетку Opp, компоненты

которой и отрезают необходимые 5 АК с карбокси-конца 19АК пептида и транспортируют их в клетку.

Такая достаточно громоздкая система может выполнять несколько функций. Во-первых, синтез,

секреция и реимпорт PhrA пептида требует времени, поэтому эта система задерживает споруляцию,

когда все для нее уже готово. Во-вторых, вся эта система очень напоминает способ межклеточных

коммуникаций при помощи низкомолекулярных молекул-феромонов. Поэтому еще одной возможной

функцией PhrA может быть детекция плотности бактериальной популяции, во всяком случае,

при

высокой плотности задержка будет явно меньше.

Роль активаторов транскрипции на разных стадиях споруляции

Будучи

активированным

путем

фосфорилирования,

Spo0A

индуцирует

транскрипцию как минимум семи генов,

управляющих вступлением бактерии на путь

споруляции и превращением вегетативной клетки

в двухкомпатрментный спорангий. Spo0A~P

активирует

транскрипцию, связываясь

промоторами соответствующих генов и оперонов,

контактируя с РНK-полимеразой, имеющей в

своем составе основной сигма фактор σA или

альтернативный

σH.

σH

обеспечивает

транскрипцию неизвестного пока гена

(или

генов), контролирующего полярное деление.

После разделения клетки на две части в

каждом из образовавшихся компартментов

происходит

активация

компартмент-

специфического сигма-фактора - σF в преспоре и

σE в материнской клетке. σF синтезируется

задолго до полярного деления, и то, что его

Рис.11.2. Активация σF в преспоре

активность проявляется только в преспоровом

компартменте, определяется регуляцией на

- 64 -

РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА. Курс лекций - часть 4