ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ГЕЛЕЙ И АППАРАТУРА ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Глава 2

ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ГЕЛЕЙ И АППАРАТУРА ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Рассмотрим основные технические приемы приготовления
и использования гелей для электрофореза. Это рассмотрение
целесообразно провести отдельно для трех вариантов аналити-
ческого электрофореза: вертикального в трубках, вертикально-
го в пластинах и горизонтального в пластинах. Приемы препа-
ративного электрофореза будут рассмотрены отдельно. Методы
подготовки препаратов, выбора буферов и различных добавок к
ним, а также условий протекания самого процесса электрофоре-
за будут детально исследованы далее, в главах 3 и 4, посвящен-
ных описанию различных вариантов электрофоретического
фракционирования белков и нуклеиновых кислот.

ВЕРТИКАЛЬНО РАСПОЛОЖЕННЫЕ ТРУБКИ

Вертикальное расположение трубок и пластин имеет то пре-
имущество, что препарат, наносимый на гель сверху, при любом
его объеме равномерно покрывает всю рабочую поверхность ге-
ля. Затруднения при вертикальном расположении могут возни-

кать для гелей, недостаточно прочно сцепленных со стеклом (см.
выше). Под действием собственного веса они могут постепенно
сползать вниз. Реальные трудности такого рода возникают,
главным образом, в случае препаративного электрофореза, ког-
да соотношение поверхности и объема колонок геля способству-
ет его сползанию.

Все приборы с вертикальным расположением гелей конструк-
тивно сложнее, чем аппараты с горизонтальным расположени-
ем, так как верхний электродный резервуар должен быть под-
нят над гелем. Приходится заботиться об уплотнениях в местах
сочленения его с трубками или пластинами. В приборах с труб-
ками для уплотнения обычно служат резиновые кольцевые про-
кладки, укрепленные в отверстиях на дне верхнего резервуара.
Схема такого прибора показана на рис. 5.

Трубки (12 — 18 штук) с уже заполимеризованным в них ге-
лем вставляют снизу в резиновые прокладки так, чтобы их верх-
ние концы выступали над дном резервуара. Если используют не
все трубки, то на их место ставят заглушки. Собранный вместе
с трубками верхний электродный резервуар устанавливают на
нижний так, чтобы концы трубок оказались на некотором рас-
стоянии от дна последнего и заполняют нижний резервуар элек-
тродным буфером, нередко до такого уровня, что трубки оказы-
ваются почти полностью погруженными в буфер. Это делается
для улучшения теплоотвода в процессе электрофореза С этой
же целью нижний буфер перемешивают магнитной мешалкой
или вводят дополнительную систему с циркуляцией охлаждаю-
щей воды. Оба резервуара цилиндрической или прямоугольной
формы изготавливают из плексигласа, что позволяет следить за
продвижением фронта красителя в процессе электрофореза.
В резервуарах должны быть закреплены электроды из платино-
вой проволоки. Нижний электрод при этом должен располагать-

ся так, чтобы поднимающиеся от него пузырьки газа не попада-
ли на нижние торцы трубок, что создавало бы помехи протека-
нию через них тока. Объемы электродных резервуаров доста-
точно велики, чтобы рН находящегося в них буфера не изменял-
ся под влиянием продуктов электролиза.

Стеклянные тонкостенные трубки, в которых ведут электро-
форез, чаще всего имеют внутренний диаметр 5 — 6 мм и длину
около 10 см. Фирма «Bio-Rad» в своем приборе модели 155 пред-
лагает широкий набор трубок с внутренним диаметром от 2 до
14,6 мм и длиной от 7,5 до 30 см. Их можно монтировать в пяти
сменных верхних резервуарах. Торцы трубок отшлифованы. При
изготовлении трубок в лаборатории не следует оплавлять их в
пламени горелки во избежание образования незаметного на
глаз сужения, которое будет мешать извлечению геля после
окончания электрофореза.

Для заливки и полимеризации геля нижние торцы трубок за-
клеивают парафильмом или лейкопластырем и устанавливают
их строго вертикально в штатив. Деаэрированный раствор моно-
меров сразу после добавления и надежного смешивания с ним
раствора персульфата аммония заливают по стенке трубки из
пипетки с полиэтиленовым наконечником так, чтобы верхний
участок трубки, предназначенный для внесения препарата, ос-
тавался сухим. Затем осторожно по стенке наслаивают воду или
изобутанол и ведут полимеризацию, как описано в предыдущем
разделе. Если готовят гель для ступенчатого электрофореза
(см. ниже), то после окончания полимеризации нижнего (рабо-
чего) геля воду стряхивают, споласкивают поверхности буфером
верхнего (формирующего) геля и точно так же заливают слой
раствора мономеров верхнего геля, а затем наслаивают на него
воду или изобутанол. Перед установкой готовой трубки с гелем
в прибор парафильм снимают, а ее свободный конец промывают
верхним электродным буфером.

Собрав прибор, заливают буфер в верхний электродный ре-
зервуар. При полимеризации геля часть трубки с верхнего ее
конца оставляют свободной, и туда при заливке попадает элек-
тродный буфер. Затем под него, на поверхность геля, пипеткой
с оттянутым полиэтиленовым наконечником наслаивают препа-
рат, в который добавляют предварительно 5 — 10% сахарозы.
Наконечник пипетки не следует подносить вплотную к поверхно-
сти геля; препарат должен выливаться с высоты 2 — 3 мм над
гелем и свободно растекаться по его поверхности за счет своей
повышенной плотности. При любом варианте электрофореза на-
до быть уверенным в том, что исходный препарат свободен от
взвешенных частиц (пыли или осадков), которые будут соби-
раться на торце геля и нарушать однородность тока по его сече-
нию, что повлечет за собой деформацию разделяющихся зон.
В этом случае препарат следует отфильтровать или очистить
центрифугированием.

Выше уже упоминалось о возможности использования гра-
диента пористости геля с изменяющимся по его длине, т. е. по
высоте трубки, содержанием акриламида. Были также приведе-
ны соображения, касающиеся подбора концентраций иниции-
рующих добавок в этом случае. Преимущества таких «градиент-
ных» гелей будут рассмотрены ниже. Для получения градиент-
ных гелей используют такие же смесительные устройства, как
при создании градиентов плотности сахарозы для ультрацент-
рифугирования. В этом случае также можно получать линейные
и нелинейные градиенты, «выпуклые» и «вогнутые», в том чис-
ле экспоненциальные.

В смеситель можно поместить раствор мономеров с макси-
мальным содержанием акриламида, а в резервуар смесительно-
го устройства — соответственно разбавленный раствор. Затем
можно заливать закрытую снизу трубку по стенке подобно цен-
трифужной пробирке, однако это довольно неудобно ввиду ма-
лого объема трубки (2 — 4 мл). Кроме того, почти всегда жела-
тельно иметь несколько трубок с заведомо одинаковой формой
градиента, поэтому лучше заливать одновременно целую пачку
параллельно расположенных трубок. Всю пачку, скрепив ее ре-
зинками, закрепляют вертикально в стакане таким образом, что-
бы нижние торцы трубок были слегка приподняты над его дном,
Через отросток, припаянный у дна стакана (или через одну из
трубок), насосом подают градиент смеси мономеров (рис. 6)
Заполнение трубок идет снизу вверх, поэтому в смесителе гради-
ентного устройства должен находиться раствор мономеров ма-
лой концентрации, а в резервуаре — концентрированный рас-
твор. В него следует добавить до 10% сахарозы, чтобы по мере
поступления в стакан с трубками плотность жидкости заметно
увеличивалась одновременно с повышением содержания акри-
ламида. Это обеспечит равномерное оттеснение менее концент-
рированных слоев вверх по трубкам. По окончании заполнения
в каждую трубку следует наслоить одинаковое (и минимально
необходимое) количество воды или изобутанола. Еще лучше на-
чинать заполнение трубок с воды, а в раствор мономеров, нахо-
дящийся в смесителе, добавить 2% сахарозы.

Следует помнить о необходимости промывки смесительного
устройства и системы подачи растворов в стакан сразу после
окончания их использования, до того как в них произойдет по-
лимеризация акриламида. Разумеется, для этого всю систему
нужно отсоединить от стакана, зажав предварительно подво-
дящую к нему трубку.

По окончании полимеризации всю пачку трубок следует из-
влечь из стакана, разнять, с каждой удалить гель (снаружи) и
обрезать его излишек у нижнего конца. Возможно, хотя техни-
чески и более сложно, создание линейного градиента ПААГ за
счет перемешивания двух одинаковых по высоте слоев раствора
мономеров разной концентрации в наклонном положении [Lo-
rentz, 1976].

В описанном приборе для вертикального электрофореза элек-
трическая цепь надежно замыкается непосредственными кон-
тактами обоих концов трубок с электродными буферами. Одна-
ко надо следить за тем, чтобы на нижних торцах гелей не было
пузырьков воздуха, оставшихся там с момента погружения тру-
бок в нижний резервуар. Пузырьки можно удалить струёй жид-
кости, направленной из шприца с согнутой иглой.

По окончании электрофореза гель из трубки извлекают.
В большинстве случаев это легко сделать с помощью длинной и
затупленной иглы шприца, которую вводят с одного из концов
трубки, круговыми движениями постепенно отслаивая гель от
ее стенок. Если необходимо, такую операцию повторяют и с дру-
гого конца. Через иглу при этом поступает вода из закрепленно-
го несколько выше иглы резервуара (или от насоса). Если гель
отслаивается с трудом, в воду можно добавить 0,5 — 1% какого-
нибудь детергента. Во избежание поломки следует дать гелю
возможность выскользнуть из трубки в сосуд с водой, над кото-
рым проделывают описанную манипуляцию. Иногда для удале-
ния геля из очень длинных трубок по его периферии с концов
трубки впрыскивают глицерин, а сам гель выталкивают водой
из присоединяемого к трубке шприца. Если гель высокой кон-
центрации вынуть не удается, его приходится замораживать, а
трубку разбивать молотком. Иногда можно решить проблему
путем вымачивания трубки с гелем в метаноле: гель постепенно
съеживается и отстает от стенки.

Основным недостатком электрофореза в трубках является
затрудненный отвод тепла даже при диаметре 5 мм. На оси ге-
ля температура оказывается выше, чем у его прилегающей к
стеклу поверхности. Это приводит к изгибу зон и соответствен-
но окрашенных полос, поскольку электрофоретическая подвиж-
ность зависит от температуры. В условиях хорошего теплоотво-
да можно вести микроэлектрофорез в стеклянных капиллярах
диаметром 0,7 — 1,5 мм [Condeelis, 1977].

ВЕРТИКАЛЬНО РАСПОЛОЖЕННЫЕ ПЛАСТИНЫ

Для электрофореза белков обычно используют пластины
шириной 8 — 14 см и длиной (в направлении электрофореза) 8 —
28 см. Электрофорез нуклеиновых кислот и их фрагментов, на-
пример при секвенировании, нередко ведут в больших пласти-
нах размером 33 ´ 43 см, что диктуется максимальным размером
рентгеновской пленки для авторадиографии. Для разделения гид-
ролизатов тРНК Пиртл и др. недавно использовали пластины
ПААГ длиной 90 см [Pirtle et al., 1980].

Полимеризацию акриламида или застывание агарозы, а за-
тем и сам электрофорез ведут в форме, образованной двумя
пластинами зеркального стекла толщиной 5 — 6 мм. Расстояние
между пластинами задается толщиной прокладок из тефлона
или плексигласа («спейсеров») и определяет толщину геля.
Прокладки шириной 10 — 15 мм устанавливают вдоль боковых
краев стекол. Для аналитических целей, как правило, исполь-
зуют пластины геля (и соответственно прокладки) толщиной от
0,4 до 1,5 мм. Эти же прокладки можно использовать и для уп-
лотнения формы во время нахождения в ней еще не затвердев-
шего геля. Для этого устанавливают еще одну прокладку точно
такой же толщины (фрезеровать совместно!) по нижнему краю
стекол и плотно прижимают ее к фрезерованным торцам боко-
вых прокладок.

Хорошо подогнанные тефлоновые прокладки в силу гидро-
фобности материала можно не смазывать. Прокладки из плек-
сиглаза смазывают силиконовой смазкой. Тонкий валик смазки
из шприца без иглы наносят сначала с одной стороны трех хоро-
шо промытых детергентом прокладок (примерно посередине), а
также на нижние торцы двух из них (боковых). Боковые про-
кладки накладывают на одно из стекол формы смазкой вниз и
к ним вплотную придвигают так же уложенную нижнюю про-
кладку. Руками (в перчатках) прижимают прокладки к стеклу,
следя за тем, чтобы смазка не выдавливалась из-под них в по-
лость формы. На образовавшуюся таким образом П-образную
прокладку снова так же наносят сплошной валик смазки по все-
му периметру и накладывают второе стекло. Всю систему зажи-
мают по трем сторонам пружинными зажимами для бумаг.

При заливке агарозы уплотнение формы можно осуществить
проще — заклеить торцы стекол липкой лентой (лейкопласты-
рем). Нижнюю прокладку при этом можно не устанавливать.
Уплотнение не будет совершенным, но агароза в контакте с про-
кладками и лентой быстро застынет и заметного ее вытекания
не произойдет. Для надежности можно сначала залить неболь-
шой слой агарозы и дать ей застыть в нижней части формы, а
потом залить остальной ее объем.

Описано применение в качестве прокладки П-образной по-
лоски силиконовой резины с разрезом, позволяющим отнимать
ее нижнюю часть после полимеризации геля. Такая прокладка

не нуждается в смазке [Stein, Varricchio, 1974]. Можно вместо
нижней прокладки сделать в нижней части формы «пробку» из
ПААГ повышенной концентрации. Для этого собранные с боко-
выми прокладками пластины (или пачку пластин) устанавлива-
ют в корытце, заполненное раствором мономеров с инициирую-
щими добавками, так, чтобы заполнить нижнюю часть формы
на высоту 1 см и захватить при этом концы боковых прокладок.
Для успешной полимеризации на раствор мономеров наслаива-
ют воду. После полимеризации геля во всем объеме корытца и
внутри формы пластины вынимают и лишний ПААГ обрезают.
Перед заливкой рабочего геля следует отсосать воду над проб-
кой и промыть поверхность буфером геля. Фирма «Bio-Rad»
предлагает для заливки пластин геля простое устройство, по-
зволяющее с помощью винтов прижать собранные с боковыми
прокладками стекла нижними торцами к полоске мягкой рези-
ны. Иногда, особенно для гелей толщиной менее 1 мм, нижнее
уплотнение осуществляют просто пластилином.

Собранную и уплотненную одним из описанных способов
форму устанавливают вертикально и заливают в нее раствор
мономеров ПААГ или расплавленную агарозу. Впрочем, ПААГ
толщиной 0,4 мм можно заливать в наклонном, а полимеризо-
вать — в горизонтальном положении пластин. Это значительно
упрощает задачу герметизации формы: достаточно оклеить ее
по торцам пластин водостойкой липкой лентой.

В аналитических опытах на каждой пластине обычно ведут
электрофорез нескольких препаратов, состав которых можно за-
тем сопоставить при идентичных условиях разделения. Как бы-
ло показано на фотографии (см. рис. 3), сопоставляемые препа-
раты фракционируют в параллельных друг другу «треках».
В ходе полимеризации на верхнем крае геля формируют ряд
одинаковых углублений прямоугольной формы — «карманов»,
куда затем и вносят различные препараты. Для этого в еще не
заполимеризовавшийся гель или горячую агарозу вставляют
«гребенку» из тефлона или плексигласа такой же или чуть мень-
шей толщины, чем прокладки между стеклами. Прямоугольные
зубцы гребенки и формируют карманы для препаратов. На рис.
7 изображена собранная форма с вставленной в гель гребенкой.
На боковом сечении можно видеть, что верхняя часть гребенки
немного толще, чем нижняя (с зубцами). Это удобно, так как
гребенка ставится каждый раз одинаково и ровно — до упора
выступа о торец стеклянной пластины. Кстати, на рис. 7 показа-
ны и прокладки (пунктир). Можно заметить, что нижнюю про-
кладку делают чуть длиннее ширины стекол, так что ее концы
выступают наружу. За эти концы нижнюю прокладку и выни-
мают из формы после застывания геля. Для ясности на чертеже
показаны только три зажима (с правой стороны пластин).

Гель или агарозу заливают между пластинами с таким рас-
четом, чтобы при опускании гребенки до упора жидкий гель за-
полнил промежутки между ее зубцами. Гребенку начинают

вставлять с некоторым переко-
сом, чтобы под ее зубцами не за-
держивались пузырьки воздуха.
Для этой цели торцы зубцов
предварительно смачивают, по-
терев их о стекло с налитым на
него раствором акриламида.
В тех случаях, когда готовят
двухслойный гель, по окончании
полимеризации нижнего геля во-
ду отсасывают, поверхности про-
мывают буфером верхнего геля,
заливают этот последний и уже
в него устанавливают гребенку.

Рис. 7. Форма для полимеризации
вертикальной пластины геля

1 — стеклянные пластины; 2 — прокладки;

3 — гребенка; 4 — зажим

Когда гель готов, вынимают
нижнюю прокладку или снимают
липкую ленту и осторожно вы-
таскивают гребенку. При работе
с концентрированным ПААГ гель может прилипать к зубцам
гребенки и нижние плоскости карманов могут оказаться не-
ровными. Это ухудшает условия формирования исходных полос
в геле.

В таком случае имеет смысл ввести еще один слой геля
пониженной концентрации и гребенку устанавливать в него. На
границе между двумя слоями разной пористости полоса ис-
ходного препарата будет выгодным образом сужаться.

Перегородки между близко расположенными карманами в
агарозе малой концентрации могут оказаться непрочными. Опи-
сан вариант формы, в которой одну из пластин изготавливают из
плексигласа с рядом фрезерованных узких перегородок в ее
верхней части, выступающих на всю толщину зазора между пла-
стинами. Гребенку вставляют между этими перегородками, но
не на всю их длину. Зубцы гребенки хорошо подогнаны по ши-
рине интервалов между перегородками, так что форма оказыва-
ется уплотненной с ее будущего верхнего края. Перевернув фор-
му, заливают агарозу с противоположной стороны. После за-
стывания агарозы и удаления гребенки карманы для препаратов
оказываются разделенными перегородками из плексигласа, кон-
цы которых погружены в гель [Sugden et al., 1975].

Для получения пластин с градиентом пористости геля по вы-
соте используют те же приемы, что описаны выше. Для одной
пластины смесь подают на дно формы через тонкую стеклянную
трубку, прижатую к боковой прокладке. Разумеется, в этом слу-
чае смеситель градиентного устройства должен содержать смесь
мономеров малой концентрации, а резервуар — более концент-
рированную смесь с добавкой сахарозы. Чтобы не нарушить гра-
диента при вынимании трубки, ее можно оставить в полимери-
зующемся геле.

Возможно одновременное заполнение целой стопки открытых
снизу форм для геля (без нижних прокладок), которое проводят
в сосуде прямоугольной формы, как описано выше для пучка
трубок. Фирма «Pharmacia» (Швеция) предлагает для этой це-
ли специальный сосуд прямоугольного сечения, где два любых
набора могут быть зажаты с помощью клиньев, скользящих по
двум наклонным плоскостям. Градиент концентрации акрила-
мида подают на дно каждого из двух отделений сосуда через
отдельные штуцеры. На фотографии (рис. 8) в сосуд установле-
на только одна пачка пластин. Бесполезный расход акриламида
и загрязнение им пластин снаружи при использовании такого
сосуда сведены до минимума. Подобного рода устройство из
плексигласа для пластин любого размера легко изготовить в ла-
боратории. Кстати, в нем удобно заливать и обычные, не гра-
диентные гели. Еще проще стопку пластин с боковыми проклад-
ками безо всякой герметизации поместить в полиэтиленовый
мешок, плотно обернуть его вокруг пластин, зажать всю стопку
и залить обычный гель прямо в мешок. После полимеризации
мешок снимают, а излишки геля с нижних концов пластин обре-
зают [Kerckaert, 1978].

Линейный градиент пористости геля в пластине или трубках
можно создать смешиванием двух слоев растворов мономеров
разной концентрации путем многократного переворачивания
пластины или трубок в наклонном положении.

В литературе описано много конструкций приборов для
электрофореза в вертикальных пластинах. Ряд моделей предла-
гают различные фирмы. Наибольшее распространение получила
конструкция прибора из плексигласа, предложенная Стадиером
(рис. 9) [Studier, 1973]. Ее легко реализовать и в лабораторных
условиях. Верхний и нижний электродные резервуары прямо-
угольной формы соединены вертикальной стенкой, в которой
имеется вырез, ведущий в полость верхнего резервуара. Такой
же вырез имеет одна из двух стеклянных пластин, между кото-
рыми полимеризуется гель. Пластины прижимают пружинными
зажимами к вертикальной стенке так, чтобы оба выреза совпа-
ли. Буфер в верхний резервуар заливают до такого уровня, что-
бы он через вырез покрывал верхний торец геля. При этом вто-
рая, не вырезанная, стеклянная пластина выступает в роли пе-
редней стенки резервуара. В месте совмещения двух вырезов,
между стеклянной пластиной и стенкой, должно быть осущест-
влено уплотнение, препятствующее вытеканию верхнего буфера.
Стадиер использовал для этой цели заливку агаром. Фирма
«Bio-Rad» в своих моделях 220 и 221 использует ту же конструк-
цию, но обеспечивает уплотнение с помощью резиновой про-
кладки.

В оба резервуара вмонтированы электроды из платиновой
проволоки. При установке в прибор форму с гелем частично по-
гружают в буфер нижнего резервуара, так что она опирается
там на разнесенные по сторонам выступы и ее нижний торец

оказывается приподнятым над дном резервуара. После погру-
жения надо внимательно проверить, не осталось ли между пла-
стинами и на торце геля пузырьков воздуха. Их можно удалить
струёй жидкости из согнутой иглы шприца.

Препараты с добавленной в них сахарозой или глицерином
вносят в карманы геля после окончательной сборки прибора
так же, как и в трубки, т. е. подслаивают их под электродный
буфер на дно каждого из карманов. Их можно заполнять пре-
паратом (постепенно поднимая кончик пипетки) почти на пол-
ную высоту. Приемы заполнения были описаны выше.

Недавно был предложен очень простой, целиком (включая
пластины для геля) изготовленный из плексигласа прибор для
вертикального электрофореза в пластинах [Broadmeadow, Wil-
се, 1979]. В нем используется схема Стадиера, но пластины по
всей высоте омываются и охлаждаются с обеих сторон элект-
родным буфером. Верхний и нижний буферы непрерывно пере-
мешиваются и охлаждаются, проходя через находящийся вне
прибора змеевик. Этим компенсируется худшая, чем у стекла,
теплопередача через плексиглас. Для гелей малой концентрации
этот прибор, по-видимому, непригоден ввиду относительно сла-
бого сцепления ПААГ с плексигласом.

Некоторые фирмы используют для пластин такой же способ
установки в прибор, что и для трубок. Пластины вставляют
снизу через прорези в дне верхнего электродного резервуара.
Уплотнение осуществляют при помощи резиновых прокладок
прямоугольного сечения. Собранные формы с гелем закрепляют
за счет трения в прорезях прокладок («Bio-Rad», «Pharmacia»)
либо прижимают к ним шлифованными торцами («Desaga»).
В любом случае пластины должны быть изготовлены точно, по-
этому приходится ограничиваться использованием фирменных
пластин и гелей определенной толщины.

Необходимость интенсивного теплоотвода от большой по-
верхности пластин заставляет некоторые фирмы вводить в при-
бор для электрофореза змеевик с охлаждающей жидкостью и
насос, обеспечивающий циркуляцию электродных буферов.
Впрочем, в случае тонких гелей воздушное охлаждение оказы-
вается вполне достаточным. Протекающий ток нагревает гель до
некоторой равновесной температуры, но в тонком слое геля эта
температура оказывается практически одинаковой по всему его
сечению. Именно это обстоятельство является решающим для
обеспечения хорошего качества разделения.

В приборе Стадиера можно обойтись и без вырезов в стенке
и пластине, а также без уплотнения, если электрическую цепь
между верхним буфером и гелем замкнуть через смоченные тем
же буфером фитили из фильтровальной бумаги [De Wachter, Fi-
ers, 1971]. Конструкция прибора становится совсем простой, и
отпадает необходимость делать вырезы в стеклянных пластинах.
Тем не менее этот способ нельзя рекомендовать во всех случаях
аналитического электрофореза, так как он имеет один недоста-

ток: открытые фитили могут неконтролируемым образом не-
сколько обсыхать. Это приводит к изменению их электрического
сопротивления, а следовательно, напряжения и тока, текущего
через гель (см. ниже).

По окончании электрофореза пластины разнимают, отслаи-
вая одну из них от геля с помощью шпателя. Его всовывают
между пластинами со стороны карманов и слегка поворачива-
ют. Эту операцию не следует форсировать; лучше сначала прой-
ти шпателем с легким нажимом вдоль всего края пластины, на-
блюдая за тем, как между стеклом и гелем постепенно прони-
кает воздух, а потом уже приподнять пластину. Со второй пла-
стины гель снимают руками и переносят в ванночку для фикса-
ции или окраски. Хотя всегда есть возможность поднять гель с
пластины за «нерабочий» конец, лучше все же работать в пер-
чатках. Случайное прикосновение кожи рук к рабочей поверх-
ности геля при современных чувствительных методах окрашива-
ния может оставить на геле артефактное белковое пятно. При
авторадиографии влажный гель, лежащий на одной пластине,
можно прямо заворачивать в полиэтиленовую пленку.

ГОРИЗОНТАЛЬНО РАСПОЛОЖЕННЫЕ ПЛАСТИНЫ

Преимущество такого расположения — не только в компакт-
ности прибора, но и в отсутствии проблемы уплотнения. Оба
электродных буфера находятся в резервуарах, расположенных
ниже уровня горизонтального столика, на который кладут гель.
Естественно, что этот столик используется и для отвода тепла
от пластинки геля — в его каналах циркулирует охлаждающая
вода.

Гель, полимеризованный на тонкой стеклянной пластинке,
помещают на столик открытой поверхностью кверху, поскольку
препарат вносят не с торца геля, а в ряд специальных «колод-
цев», расположенных на некотором расстоянии от его края.
Электрическая цепь замыкается через 8 — 10-слойные фитили из
фильтровальной бумаги, одним концом погруженные в элект-
родные резервуары, а другим — прижатые к гелю с перекрытием
в 10 — 12 мм (рис. 10, 11). При наложении фитилей на гель сле-
дует внимательно следить за отсутствием воздушных пузырей
между ними.

Показанные на рис. 10 перегородки в электродных камерах
препятствуют конвекционному переносу продуктов электролиза
от электродов к концам фитилей. В ходе электрофореза на ано-
де образуется свободная кислота, а на катоде — щелочь, кото-
рые по плотности отличаются от электродных буферов, а это
может вызвать конвекцию. Если электрофорез идет более 24 ч,
электродные буферы следует заменять. Если же они одинаковы
и между электродными резервуарами обеспечена циркуляция
жидкости, то кислота и щелочь взаимно нейтрализуются — и бу-
фер можно не заменять. В изображенном на схеме приборе

«Мультифор» (LKB, Швеция) циркуляция буфера не преду-
смотрена, но объем каждой камеры составляет 1,2 л.

Во избежание подсыхания фитилей и геля прибор во время
работы закрывают прозрачной крышкой (рис. 12), которую ино-
гда называют антиконденсационной. Она предохраняет гель в
случае существенного охлаждения от конденсации на его поверх-
ности влаги из окружающего воздуха. Впрочем, сама крышка
изнутри может запотевать за счет влаги, испаряющейся с фити-
лей, особенно в случае их перегрева. Это ухудшает условия на-
блюдения за ходом электрофореза, поэтому в аналогичном по
конструкции приборе фирмы «Bio-Rad» (модель 1415) по пери-
метру крышки у ее краев с внутренней стороны проходит трубка
с охлаждающей водой. Пары влаги конденсируются на трубке,
оставляя крышку прозрачной. Электродные резервуары у этого
прибора съемные, что облегчает их промывку. В качестве фити-
лей используется специально обработанная целлюлоза с повы-
шенной влагоемкостью.

Рис. 12. Наложение антиконденсацион- Рис. 13. Внесение препарата в ко-
ной крышки лодцы геля

Описанные приборы не предъявляют строгих требований к
качеству полимеризации геля у его краев, поскольку края геля
не участвуют в электрофорезе. Полимеризацию пластины ПААГ
для прибора «Мультифор» ведут в форме, уплотненной по всем
четырем краям сплошной резиновой прокладкой. У одного из
своих углов она разрезана, и через этот разрез, слегка отогнув
прокладку, заливают раствор мономеров в форму. Последняя
образована двумя пластинами: стеклянной (толщиной 1 мм) и
толстой плексигласовой. На стеклянной пластине гель остается
во время электрофореза. Пластину из плексигласа после поли-
меризации геля снимают; на ней имеется ряд прямоугольных
выступов, которые при заливке формируют колодцы для внесе-
ния препаратов. Колодцы имеют фиксированный объем (для
«Мультифора» — 5 и 10 мкл). В таком же объеме надо вносить
и препарат, чтобы он заполнял все сечения геля, но не разли-
вался по его поверхности. Для этого препарат дозируют микро-
шприцем (рис. 13).

При сборке формы на стеклянную пластину накладывают
еще одну толстую пластину из плексигласа и все вместе зажи-
мают пружинными зажимами. Здесь нет необходимости наслаи-
вать воду, да и к материалу уплотнительной прокладки можно
не предъявлять высоких требований, поскольку в контакте с ней
гель может и не заполимеризоваться. После освобождения геля
оставшийся раствор мономеров по его краям можно убрать филь-
тровальной бумагой. Для облегчения разборки формы ее сле-
дует охладить в холодильнике.

Перед использованием ПААГ желательно выдержать не ме-
нее 12 ч обернутым в полиэтиленовую пленку во избежание под-
сыхания. Гели, содержащие додецилсульфат натрия (ДДС-Na),

не следует хранить в холодильнике, так как ДДС-Na мо-
жет выпасть в осадок. При установке пластины с гелем на ох-
лаждающий столик следует налить на него несколько милли-
литров раствора детергента, чтобы обеспечить хороший тепловой
контакт между столиком и пластиной. До этого имеет смысл про-
вести на столике водонесмываемым фломастером две линии на
расстоянии примерно 15 — 20 мм от каждого из противополож-
ных краев. Эти линии будут видны через гель и помогут ровно
уложить края фитилей, что немаловажно для создания в геле
однородного электрического поля.

Следует быстро вносить препараты в колодцы и сразу же
начинать электрофорез, так как бромфеноловый краситель
склонен диффундировать в геле. В процессе разделения нужно
следить за тем, чтобы колодцы с оставшимся в них буфером пре-
парата не обсыхали. Это нежелательно, так как искажает рас-
пределение тока по сечению геля. В ходе электрофореза можно
пополнять колодцы буфером или с самого начала добавить в
препарат 10—20% глицерина.

После электрофореза можно хранить гель на том же стекле,
обернув его целлофаном, или предварительно перенести на ме-
таллическую фольгу. Можно положить на гель фильтровальную
бумагу, которая хорошо к нему прилипает, и снять стекло. На
этой же бумаге (после фиксации и окрашивания) гель можно
и высушить.

Пластины для горизонтального электрофореза в агарозе
можно приготовить чрезвычайно просто. На горизонтально ус-
тановленную (по уровню) плоскость кладут тонкое стекло опре-
деленного размера и на него выливают расплавленный раствор
агарозы в буфере. Его объем надо рассчитать или подобрать
так, чтобы получить пластину нужной толщины. Колодцы для
препаратов в этом случае можно и не делать. Фирма LKB реко-
мендует наносить препараты прямо на поверхность агарозы че-
рез прорези наложенного на пластину специального шаблона со
щелями. Препарат объемом 2 — 4 мкл вносят в щель шаблона,
откуда он полностью впитывается в агарозу. Впрочем, сравни-
тельно простое приспособление, смонтированное на столике для
заливки, позволяет установить над пластиной (перпендикулярно
к ее плоскости) гребенку и с ее помощью при заливке агарозы
образовать колодцы для препаратов. Перед использованием
пластину агарозы тоже следует выдержать во влажной атмосфе-
ре в течение суток.

При электрофорезе нуклеиновых кислот в агарозе использу-
ют относительно большие токи, которые могут нагревать фити-
ли из фильтровальной бумаги. Было предложено фитили делать
тоже из агарозы — заливкой ее 1 — 2%-ного раствора в специ-
альные камеры; описаны конструкции соответствующих прибо-
ров [Kaplan et al., 1977; McDonell et al., 1977; Herrick, 1980].
На рис. 14 показан разрез одного из таких простых приборов.
В приборе фирмы «Bio-Rad» (модель 1415) фитилями из 0,5%-

ного геля агарозы толщиной 6 мм оснащены специальные мо-
стики, на которых можно вести препаративный электрофорез
ДНК в пластинах геля агарозы толщиной до 1 см.

Вместе с тем для работы с микроколичествами препарата
описано приготовление гелей для горизонтального электрофоре-
за толщиной 0,1 мм на предметных стеклах. После высушива-
ния такой гель образует настолько тонкую, не заметную глазом
пленку, что она позволяет вести авторадиографию даже мечен-
ных ³H препаратов [Amaldi, 1972].

Высоковольтный горизонтальный электрофорез в пластинах
ПААГ толщиной 0,5 мм был использован для секвенирования
нуклеиновых кислот. Для улучшения теплоотвода гель разме-
ром 30 ´ 50 см, подложив под него тонкую пленку, укладывали
на металлический охлаждающий столик самодельного прибора,
накрывали еще одной пленкой и плотно, по всей поверхности
прижимали к столику давлением наполненной воздухом подуш-
ки [Kutateladze et а1., 1979].