Глава 1
ГЕЛИ ДЛЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

ПОЛИАКРИЛАМИДНЫИ ГЕЛЬ (ПААГ)

Исходные материалы

Акриламид (СН₂= СН — CONH₂) представляет собой белый
кристаллический порошок. Хорошо очищенный продажный пре-
парат содержит не более 0,05% акриловой кислоты. Его 5%-ный
водный раствор должен иметь рН не ниже 5, а оптическая плот-
ность 1%-ного раствора при 290 нм (А₂₉₀) не должна превышать
0,15. Такой препарат можно использовать без дополнительной
очистки или перекристаллизации. Акриламид следует хранить
сухим, в темной посуде, предпочтительно на холоду. В этих ус-
ловиях он может храниться до года. Акриламид токсичен (воз-
действует на кожу и нервную систему), поэтому отвешивать и
растворять его следует в перчатках и под тягой.

Недостаточно чистый препарат можно перекристаллизовать.
Для этого 70 г акриламида растворяют в 1 л хлороформа при
50°, фильтруют при этой же температуре, затем охлаждают до
— 20°, быстро промывают кристаллы холодным хлороформом и
высушивают в вакуум-эксикаторе. Для освобождения от УФ-по-
глощающих примесей акриламид можно обработать активиро-
ванным углем. Для этого в маточный 30 — 40%-ный водный рас-
твор акриламида в смеси с метиленбисакриламидом добавляют

7

активированный уголь (примерно 50 г/л), суспензию перемеши-
вают в течение 30 мин и фильтруют сначала через бумажный, а
затем через стекловолокнистый фильтр.

NN'-Метиленбисакриламид («Бис») – (CH₂= CH — CONH)₂–
СН₂ — используют в качестве «сшивки» линейных полимеров ак-
риламида. Продажные препараты, содержащие не более 0,02%
акриловой кислоты, не нуждаются в дополнительной очистке.
В случае необходимости Бис можно перекристаллизовать из
ацетона (12 г/л) в тех же условиях, что и акриламид. Условия
хранения и токсичность — такие же, как у акриламида.

В качестве «сшивки» иногда используют этилендиакрилат —
СН₂= СН — СО — O — СН₂— СН₂— О — СО — СН = СН₂, а также
NN'-диаллилтартардиамид   (ДАТД) — CH₂= CH — CH₂— NH —
CO — CH(OH) — CH(OH) — CO — NH — CH₂— CH = CH₂. С их по-
мощью получают «растворимые» гели. В первом случае эфирную
связь можно разорвать обработкой геля щелочью или водным
раствором пиперидина. Гели, сшитые ДАТД, растворяются за
20 — 30 мин при комнатной температуре в 2%-ной йодной кисло-
те. Использование растворимых гелей на основе акриламида
будет рассмотрено ниже.

Персульфат аммония производится в виде белого кристалли-
ческого порошка или гранул. Его используют в качестве инициа-
тора процесса полимеризации. Гомолитический разрыв связи
между атомами кислорода в молекуле персульфата аммония

приводит к образованию двух достаточно долго живущих сво-
бодных радикалов с одним неспаренным электроном у атома
кислорода:

Такой радикал стимулирует разрыв двойной связи в молекуле
акриламида и присоединяется к ней таким образом, что снова
образуется радикал с неспаренным электроном, но уже у атома
углерода:

Этот радикал, в свою очередь, вызывает разрыв двойной связи
и присоединение следующей молекулы акриламида с образова-

8

нием нового радикала и т. д. Цепная реакция полимеризации
идет до тех пор, пока два радикала, встретившись между собой,
не образуют обычную ковалентную связь. По тому же механизму
в растущую цепочку линейного полимера может одной из своих
концевых винильных групп встроиться и метиленбисакриламид.
Второй его конец может точно так же оказаться в составе дру-
гой линейной полимерной цепочки, и образуется «сшивка».

Персульфат аммония в водном растворе постепенно разлага-
ется, поэтому следует использовать только свежеприготовлен-
ные растворы. Сухой препарат хранится лучше, хотя и он мед-
ленно разлагается с выделением кислорода. Продажные препа-
раты для электрофореза обычно достаточно хорошо очищены,
но их следует проверять. Если 1%-ный раствор персульфата
аммония в воде имеет рН < 2, то он непригоден. Отметим попут-
но, что катион не играет роли в процессе инициации. Можно с
успехом использовать, например, персульфат калия.

Рибофлавин представляет собой кристаллы в виде желто-
оранжевых игл. Он малорастворим в воде, но хорошо растворя-
ется в слабощелочных водных буферах; растворы имеют желто-
зеленую окраску.

Рибофлавин также может служить инициатором полимериза-
ции. При освещении его водного раствора видимым светом
(445 нм) он присоединяет водород и восстанавливается до лей-
корибофлавина. Последний снова легко окисляется растворен-
ным в воде кислородом, образуя перекись водорода. За счет раз-
ложения перекиси продуцируются свободные радикалы (НО·),
инициирующие цепную реакцию полимеризации акриламида.

К чистоте рибофлавина можно предъявлять не слишком
строгие требования, так как он, являясь очень эффективным ини-
циатором, используется в гораздо меньших концентрациях
(~ 0,005%), чем персульфат аммония.

Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) — (СН₃)₂N — CH₂— CH₂—
— N(СН₃)₂ — представляет собой бесцветную жидкость с плот-
ностью 0,78 г/см³. Концентрация неразбавленного ТЕМЕД —
около 6,7 М.

ТЕМЕД не является, собственно говоря, инициатором поли-
меризации акриламида, но служит катализатором этого процес-
са, заметно ускоряя его протекание. Он эффективен только в
своей неионизированной форме, поэтому при полимеризации ак-
риламида в кислой среде содержание ТЕМЕД следует значи-
тельно увеличить. В нейтральной или щелочной средах ТЕМЕД
можно вносить в количестве, эквимолярном по отношению к пер-
сульфату.

В качестве катализатора в последнее время нередко исполь-
зуют диметиламинопропионитрил — (CH₃)₂N — СН₂— CH₂— CN
(M = 102). Он более эффективен, чем ТЕМЕД, поэтому его вно-
сят в три-четыре раза меньше, чем персульфата аммония.

 

9

Процесс полимеризации ПААГ

При подготовке определенной серии опытов удобно заранее
приготовить концентрированный (30 — 40%) водный раствор ак-
риламида и метиленбисакриламида с определенным соотноше-
нием обоих мономеров. Такой раствор можно хранить в холо-
дильнике в течение нескольких недель. Так же хранят и маточ-
ный раствор буфера, например 10-кратной концентрации.
ТЕМЕД хранится хорошо, а персульфат аммония растворяют в
воде непосредственно перед началом опыта.

Для приготовления геля маточные растворы мономеров и бу-
фера смешивают в такой пропорции, чтобы получить нужную ко-
нечную концентрацию акриламида и буфера, дополняют до рас-
четного объема водой и вносят ТЕМЕД. После этого раствор
деаэрируют в колбе Бунзена, присоединенной к водоструйному
насосу, добавляют расчетный объем раствора персульфата и за-
ливают в трубку или между стеклами для формирования пла-
стин. При правильном выборе концентраций персульфата и
ТЕМЕД полимеризация занимает 30 — 40 мин. Ее следует вести
вдали от яркого источника света.

Рассмотрим некоторые факторы, влияющие на этот процесс.
Наибольшую опасность для нормального протекания полимери-
зации акриламида представляет растворенный в воде кислород,
молекула которого является определенного рода бирадикалом
и потому способна оборвать цепную реакцию свободнорадикаль-
ной полимеризации акриламида. Деаэрация смеси растворов
необходима именно для удаления из нее растворенного кислоро-
да. Ее можно вести достаточно энергично и с перемешиванием —
так, чтобы жидкость при пониженном давлении закипела, но
как только интенсивное выделение пузырей газа закончится,
деаэрацию следует прекратить, не допуская заметного испаре-
ния воды. Обычно эта процедура занимает несколько минут при
комнатной температуре.

Кислород воздуха в контакте с раствором мономеров может
помешать полимеризации, поэтому на поверхность раствора ос-
торожно наслаивают до высоты 3 — 5 мм деаэрированную кипя-
чением воду или изобутанол. Наслаивать следует по стенке фор-
мы через иглу от шприца с помощью перистальтического насо-
са. Им же удобно отсосать воду после окончания полимеризации
геля. Вначале граница между гелем и водой исчезает, но затем
вновь появляется, что указывает на окончание процесса полиме-
ризации.

Если в качестве инициатора используют рибофлавин, то фор-
му с раствором мономеров освещают люминесцентной лампой
«дневного света» с расстояния около 5 см в течение 30 — 45 мин.
Уже указывалось, что рибофлавин является более эффективным
инициатором, чем персульфат. Кроме того, продукты его распа-
да не опасны для белков и нуклеиновых кислот, в то время как
ион персульфата может вступать в реакцию с белками, созда-

10

вая артефакты при их фракционировании. В тех случаях, когда
это существенно, персульфат удаляют путем предварительного
электрофореза («преэлектрофореза») геля до внесения в него
препарата, однако полностью это сделать не удается. Тем не ме-
нее в последние годы в качестве инициатора предпочтение отда-
ют персульфату, поскольку при работе с рибофлавином доволь-
но трудно подобрать оптимальную степень деаэрирования рас-
творов. С одной стороны, растворенный кислород препятствует
полимеризации, а с другой — он необходим, хотя и в небольшом
количестве, для самого процесса инициации с участием рибо-
флавина.

Полимеризация — экзотермический процесс, поэтому в слу-
чае высокой концентрации акриламида во избежание образова-
ния пузырей газа и нарушения однородности геля необходимо
обеспечить отвод тепла. Вместе с тем скорость полимеризации
увеличивается с ростом температуры за счет ускорения образо-
вания свободных радикалов. Этим можно воспользоваться для
замедления полимеризации: при охлаждении геля на 1° ее про-
должительность увеличивается примерно на 2 мин. Полимери-
зацию гелей, содержащих более 15% акриламида, лучше вести
на холоду.

Гель получается наиболее однородным, если время полиме-
ризации составляет 30 — 40 мин. Обычно этого добиваются эм-
пирически, подбирая оптимальную концентрацию персульфата.
Она может варьировать в пределах от 0,02 до 0,2% в зависимо-
сти от концентрации акриламида и качества самого персульфа-
та. С увеличением содержания акриламида концентрацию пер-
сульфата приходится уменьшать. Имеет смысл предварительно
внести различные количества данного препарата персульфата
в ряд пробирок с рабочим раствором мономеров акриламида,
наблюдая продолжительность полимеризации в них.

Количество ТЕМЕД в объемных процентах можно брать
примерно вдвое меньшим, чем персульфата. С учетом различия
молекулярных масс и плотности ТЕМЕД это обеспечит их при-
близительную эквимолярность. Напомним, что при использова-
нии кислых буферов количество ТЕМЕД следует увеличивать
вплоть до 10-кратного по сравнению с персульфатом. Впрочем,
нередко вносят избыток ТЕМЕД и в нейтральные буферы. Су-
щественной роли это не играет, если только гель не обнаружи-
вает склонности к растрескиванию при высушивании (для ав-
торадиографии). В этом случае содержание ТЕМЕД надо сни-
зить.

Состав буферов, используемых для электрофореза белков и
нуклеиновых кислот, не влияет на процесс полимеризации ак-
риламида. Природа, концентрация и рН буфера определяются
особенностями самого процесса электрофореза, которые будут
рассмотрены ниже. Полимеризации ПААГ не мешает также при-
сутствие мочевины (даже в высоких концентрациях), гуанидин-
хлорида, формамида, сахарозы или таких детергентов, как до-

11

децилсульфат натрия, Тритон Х-100, цетавлон и др. Сахароза
даже способствует полимеризации и улучшает механические
свойства геля. Разумеется, все эти добавки не должны содер-
жать посторонних примесей.

Весьма существенно обеспечить чистоту поверхности стеклян-
ных форм для геля. Их тщательно моют лабораторными детер-
гентами и обильно споласкивают водой. Трубки можно мыть ще-..
точкой для курительной трубки. Неплохо дополнительно погру-
зить пластины или трубки на 1 — 2 ч в хромпик. Иногда их моют
горячей азотной кислотой. По хорошо промытой стеклянной
поверхности вода должна стекать, не оставляя капель.

ПААГ хорошо прилипает к стеклу даже при малой концент-
рации акриламида (менее 5%). Это существенно для поддержа-
ния геля в устройствах с вертикальным расположением трубок
или пластин. Кроме того, хорошее прилипание улучшает тепло-
передачу от геля к стеклу и уменьшает опасность образования
шунтирующей ток пленки жидкости у поверхности стекла. Такой
шунт, а иногда и канал, по которому вытекает буфер из верхне-
го электродного резервуара, может образоваться между боко-
выми торцами пластины геля и прокладками, определяющими
его толщину, в случае загрязнения прокладок или неудачного
выбора их материала. Прокладки из тефлона, плексигласа или
чистой силиконовой резины не мешают полимеризации геля
вблизи их поверхности. Однако некоторые сорта резины с на-
полнителями, а также смазки, которыми нередко герметизиру-
ют прокладки, могут препятствовать полимеризации. Смазку
(лучше всего силиконовую) следует наносить тонким валиком
из шприца со снятой иглой на таком расстоянии от внутреннего
края прокладки, чтобы она не выдавливалась внутрь формы
при ее сжатии пружинными зажимами (см. ниже). Для доста-
точно ровных стекол тефлоновые прокладки можно использо-
вать без смазки.

Гели с высоким содержанием акриламида могут настолько
прочно связываться со стеклом, что их последующее извлечение
из трубок или снятие стеклянных пластин с геля становится за-
труднительным. В этом случае можно силиконировать стекло
или использовать формы, изготовленные из плексигласа, к ко-
торому ПААГ прилипает хуже, чем к стеклу, но при высокой
концентрации акриламида — вполне надежно. Полимеризацию
геля между тонким стеклом и толстой (для жесткости) пласти-
ной плексигласа удобно проводить для последующего горизон-
тального электрофореза. После окончания полимеризации плек-
сиглас можно легко снять, а гель на стекле перенести на ох-
лаждающий столик прибора. Полимеризацию ПААГ для гори-
зонтального электрофореза можно вести просто в тонком слое,
налитом на строго горизонтальное стекло, если его поместить в
камеру, заполненную азотом.

Особого внимания требует полимеризация «градиентных» ге-
лей с меняющейся по высоте концентрацией акриламида. Тепло-

12

выделение при полимеризации такого геля будет заметно боль-
ше в его нижней части, где содержание акриламида выше, а это
может привести к тепловой конвекции в жидкости и нарушению
градиента. Во избежание такого явления вместе с концентраци-
ей акриламида по высоте геля варьируют и содержание в нем
инициирующих добавок с таким расчетом, чтобы, полимеризация
начиналась с верхнего края пластины или трубки и постепенно
распространялась вниз.

Выбор концентраций мономеров

Для удобства изложения используются следующие обозна-
чения: Т — процентное отношение суммарной массы обоих мо-
номеров к объему их раствора, С — процентное отношение мас-
сы метиленбисакриламида к общей массе обоих мономеров. Ве-
личина Т практически варьирует в пределах 3 — 30%, а С, как
правило, составляет 1—5%, что соответствует отношению акри-
ламид/Бис в пределах от 99 : 1 по 19 : 1. Однако в некоторых
особых случаях, рассмотренных ниже, имеет смысл увеличивать
С до 20% и более. При указании значений Т и С значок «%» да-
лее будет опущен.

Чем же диктуется выбор значений T и С? Прежде всего, на
этот выбор накладывают ограничения механические и адсорб-
ционные свойства геля. Например, гели с T £ 5 и С = 1 оказыва-
ются слишком мягкими и липкими — их невозможно извлечь
из стеклянной формы. Для крупнопористых гелей надо увели-
чивать степень сшивки (повышать величину С до 3 — 5), т. е. от-
ношение акриламид/Бис брать в пределах от 35 : 1 до 20 : 1. При
этом происходит одновременное повышение прочности геля и
ухудшение его способности прилипать к стеклу — гель как бы
«замыкается». Мелкопористые гели (T около 20) при высоком
содержании «сшивки» оказываются хрупкими и мутными, по-
этому для них величина С не должна превышать 1 — 2.

На первый взгляд кажется очевидным, что поры ПААГ тем
мельче, чем больше содержание в нем мономеров, т. е. величи-
на Т. Но это не всегда так; имеет смысл разобраться в этом
глубже.

Неправильно было бы считать ПААГ регулярной простран-
ственной решеткой с жесткими ячейками определенного средне-
го размера. При малых значениях С он представляет собой ско-
рее длинные нити, заполняющие весь объем и лишь в отдельных
точках случайным образом сшитые между собой. Расстояние
между этими точками вдоль нити (при C £ 2) в среднем равно
50 — 100 мономерных единиц. Такая система не может быть
внутренне жесткой. Мигрирующие в геле макромолекулы, по-
видимому, могут раздвигать гибкие длинные участки линейных
полимеров акриламида. Разумеется, на это расходуется энер-
гия, миграция молекул замедляется и происходит своеобразное
«трение» их о гель. Однако жестких ограничений на размер

13

мигрирующих молекул такая система не накладывает, и это
очень существенно.

Чем больше содержание акриламида (а величина Т, в основ-
ном, определяется им), тем гуще нити полимера, меньше проме-
жутки между ними и сильнее трение. Увеличение содержания
«сшивки» (С) сначала повышает жесткость геля так как сред-
няя длина свободных участков нитей уменьшается. Трение при
этом увеличивается, а миграция биополимеров в геле замедля-
ется, — именно этого и можно было ожидать. Однако далее кар-
тина меняется. Эксперимент обнаруживает, что с увеличением
С выше 10 тормозящий эффект геля (при одних и тех же значе-
ниях Т) ослабляется. При С > 15 гель ведет себя как крупнопо-
ристый даже при высоких значениях Т. Дело в том, что внутрен-
няя структура геля в этом случае приобретает, по-видимому,
совсем иной характер. Благодаря частым сшивкам, располо-
женным теперь на расстоянии всего лишь нескольких мономер-
ных единиц друг от друга, оказывается энергетически выгодным
и вероятным многократное связывание нескольких параллельно
идущих нитей в своего рода пучки, которые также образуют
хаотически сшитую пространственную сетку. Однако эта сетка
оказывается действительно жесткой — нити в пучках раздвинуть
невозможно. Зато между пучками полимерных нитей образу-
ются достаточно большие пустоты, заполненные жидкой фазой
геля, по которым могут свободно мигрировать молекулы биопо-
лимеров.

Между прочим, такая же ситуация возникает и при затверде-
вании агара или агарозы, однако нити линейных полисахаридов
связываются в пучки не ковалентными, а водородными связями.
Такая структура и обеспечивает удивительное сочетание круп-
нопористости и прочности, характерное для этих гелей.

Возвращаясь к ПААГ, следует указать, что гели с очень вы-
соким содержанием метиленбисакриламида (С > 15) хрупки,
легко отстают от стенок, непрозрачны и сильно окрашиваются.
Этих недостатков лишены гели, сшитые NN^/-диaллилтapтapдиa-
мидом. Например, гель с T = 5 и С = 15, сшитый ДАТД, оказы-
вается настолько крупнопористым, что не тормозит миграцию
биополимеров с молекулярной массой 0,5 млн. дальтон; при
этом он механически прочен, хорошо сцепляется со стеклом и
прозрачен [Baumann, Chrambach, 1976]. Вспомним, что такой
гель к тому же растворим в йодной кислоте. Недавно описано
успешное использование для электрофореза белков еще сильнее
сшитого геля этого типа. В нем величина С достигала 27, т. е.
отношение акриламид/ДАТД не превышало 4 : 1 [Spath, Koblet,
1979].

Рассмотрим теперь подробнее влияние выбора значений Т и
С для обычного ПААГ на скорость миграции в нем биополиме-
ров. Тормозящий эффект трения о гель проявляется в снижении
электрофоретической подвижности заряженных макромолекул в
геле (и') по сравнению с их подвижностью в свободной жидко-

14

сти с такими же, как у буфера геля, значениями рН и ионной си-
лы раствора (u₀). Электрофоретическую подвижность определя-
ют как величину скорости миграции заряженных молекул (см/ч)
при напряженности поля 1 В/см. Величина и₀ зависит от соотно-
шения суммарного электрического заряда макромолекулы (при
данном рН) и ее массы. Сила, действующая на молекулу в элек-
трическом поле, пропорциональна заряду, а противодействую-
щая миграции вдоль силовых линий поля сила трения о жид-
кость пропорциональна линейному размеру молекулы, а следо-
вательно, кубическому корню из ее массы. Для ориентировки
заметим, что электрофоретическая подвижность большинства
кислых белков в свободной жидкости при рН 8,8 лежит в пре-
делах 0,1 — 0,5 см/ч на 1 В/см. Прямой корреляции между мас-
сой молекулы и величиной и₀, очевидно, быть не должно.

В геле трение существенно возрастает, причем тем сильнее,
чем больше масса молекул и меньше средний размер пор, т. е.
чем больше величина Т (для малых значений С). Показано, что
имеет место соотношение: ln(и'/и₀) = — k_RT. Величина коэффи-
циента торможения k_R (порядка 0,1— 0,4) зависит от среднего
радиуса молекулы R и степени сшивки геля С, слабо увеличи-
ваясь с ростом последней в пределах от 1 до 7. Для глобуляр-
ных белков R лежит в диапазоне от 1,57 нм для лактальбумина
(M = 12400) до 3,61 нм для церулоплазмина (M = 151 000).

Для эффективного разделения белков при электрофорезе в
ПААГ соотношение u'/u₀ должно составлять 0,1 — 0,2. Отсюда
следует, что оптимальная электрофоретическая подвижность
белков в ПААГ лежит в пределах 0,01— 0,1 см/ч на 1 В/см. При
напряженности поля 10  —  20 В/см этому соответствуют скорости
миграции белков в диапазоне 0,1 — 2 см/ч. Таким образом, при
рабочей длине геля 10 см за 5 ч электрофореза наиболее быст-
рые белки могут достигнуть конца геля, в то время как наименее
подвижные продвинутся лишь на 0,5 см. Цифры эти — сугубо
приближенные и приведены здесь лишь для общей ориентиров-
ки. В конкретных случаях возможны существенные отклонения
от них. Например, если заранее известно, что разделяемые бел-
ки сильно различаются между собой по заряду или размерам, то
можно вести электрофорез в условиях более высоких подвижно-
стей (и'), т. е. в более крупнопористых гелях, и тем сократить
время фракционирования в 2 — 3 раза.

Выбор значения Т зависит от природы различия электрофо-
ретических подвижностей белков в геле. Если сильно различа-
ются размеры молекул, а отношение заряда к массе у них более
или менее одинаково, то имеет смысл выбрать Т максимальным.
Разделение в этом случае будет происходить только за счет
трения о гель, причем тем эффективнее, чем больше Т, хотя при
этом в связи с увеличением продолжительности электрофореза
усилится диффузия белков. Если же компоненты анализируемой
смеси имеют различные отношения заряда к массе, то может
оказаться выгодным вести разделение в крупнопористом геле

15

при малых значениях Т), т. е. как бы в свободной жидкости,
почти не используя эффект трения молекул о гель. По крайней
мере, это обеспечит выигрыш во времени фракционирования.

Ориентировочно о характере различия электрофоретических
подвижностей двух белков в данных условиях разделения мож-
но судить в том случае, когда известны их молекулярные мас-
сы и изоэлектрические точки, а также содержание в них ионо-
генных аминокислот. Чаще всего бывают, хотя бы приблизитель-
но, известны молекулярные массы. Если они различаются не-
значительно, то имеет смысл ориентироваться сначала на круп-
нопористый гель и попробовать поварьировать рН буфера.

Пожалуй, самый существенный вывод из проведенного каче-
ственного рассмотрения — заключение об определенной свобо-
де выбора концентрации ПААГ и, особенно, содержания в нем
«сшивки» (С в пределах 2 — 5). В любом случае выбор значений
Т должен быть сделан на основе ряда пробных опытов, в кото-
рых, в частности, следует варьировать рН буфера и продолжи-
тельность электрофореза (электрофорез белков в присутствии
додецилсульфата натрия пока не рассматривается).

В качестве сугубо ориентировочной можно рекомендовать
следующую полученную на практике таблицу соответствия мо-
лекулярных масс разделяемых белков (М) и концентраций
ПААГ (Т):

 

Приступая к электрофоретическому фракционированию био-
полимеров, необязательно в точности воспроизводить значения
Т и С, приведенные в литературе для сходного типа эксперимен-
тов, но выбранные однажды условия следует, разумеется, точно
воспроизводить в собственной серии опытов для надежной иден-
тификации и сопоставления положения соответствующих полос.

АГАРОЗА

Сочетание прочности и крупнопористости делает гели агаро-
зы незаменимыми при электрофорезе особенно крупных макро-
молекул, в частности нуклеиновых кислот. Агароза — это особо
чистая фракция природного линейного полисахарида агара, ко-
торый извлекают из некоторых видов морских водорослей. В по-
лимерной цепи агарозы чередуются b-D-галактопираноза и 3,6-
ангидро-a-L-галактопираноза. Молекулярная масса ее состав-
ляет 10⁴— 10⁵. Гелеобразование идет, как уже указывалось, пу-
тем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет
водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы обра-
зуют прочные гели уже при концентрации 0,3%.

 

16

При температурах 84 — 96° (а у специальных типов — уже
при 70°) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость —
«плавится». Вязкость расплавленного 1%-ного раствора агаро-
зы составляет 10 — 15 сП, что примерно соответствует вязкости
50%-ного раствора сахарозы при комнатной температуре. Рас-
творы агарозы характеризуются ярко выраженным гистерези-
сом: они затвердевают, образуя гель, при значительно более низ-
ких температурах (36 — 42°). У легкоплавких типов агарозы эта
температура снижается до 30°. Такая особенность облегчает
манипуляции с расплавленной агарозой — можно не опасаться
преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплав-
ленную на кипящей бане агарозу предварительно охлаждают
до 50 — 55° и уже при этой температуре дозируют и заливают в
формы; это удобно и не связано с возникновением значительных
тепловых деформаций.

Гели агарозы не вполне прозрачны, однако это обусловлено
не наличием примесей, а своего рода «кристаллизацией» геля и
свидетельствует, скорее, о чистоте агарозы. Затвердевший гель
представляет собой не вполне равновесную систему: со време-
нем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жидкость.
Этот процесс идет вначале довольно быстро, а потом — очень
медленно. Тем не менее гели агарозы перед опытом следует вы-
держивать в течение, по крайней мере, 12 ч (открытые пластины
для горизонтального электрофореза выдерживают во влажной
камере). Сжатие сильнее выражено у более концентрированных
гелей агарозы.

Температуры плавления и гелеобразования зависят от содер-
жания в агарозе метоксильных групп, которое может достигать
3 — 4%. Наличие этих групп затрудняет гелеобразование. В ага-
розе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Их при-
сутствие существенно влияет не только на температуры плавле-
ния и застывания гелей, но и на сам процесс электрофореза.
В частности, именно эфиры серной кислоты обусловливают силь-
но выраженное при электрофорезе в гелях агарозы явление эн-
досмоса, сущность которого сводится к следующему.

Отрицательно заряженные остатки серной кислоты непо-
движно связаны с полимерными нитями агарозы. Соответствую-
щие им положительные ионы, напротив, находятся в водной фа-
зе и под действием электрического поля мигрируют в направле-
нии катода. Их место занимают катионы, поступающие из анод-
ного буфера. Возникает дополнительный ток сильно гидратиро-
ванных катионов, которые увлекают за собой всю массу жидко-
сти, находящейся внутри геля, и вместе с ней — растворенные в
водной фазе геля макромолекулы. Они «дрейфуют» вместе с
жидкостью, и это движение накладывается на их миграцию под
действием электрического поля.

В большинстве случаев электрофорезом в агарозе разделя-
ют отрицательно заряженные макромолекулы, мигрирующие к
аноду. Эндосмос направлен в противоположную сторону и ухуд-

17

Рис. 4. Влияние эндосмоса в агарозном геле на характер
фракционирования двунитевых ДНК одинакового разме-
ра [Johnson et al., 1980]

1 — сверхскрученная ДНК; 2 — линейная; 3 — кольцевая; сте-
пень эндосмоса увеличивается слева направо

шает разделение. Ввиду этого агарозу под-
вергают специальной очистке, и содержание
иона сульфата в продажных препаратах не
превышает 0,5%. Типы агарозы, отличающие-
ся слабо выраженным эндосмосом, содержат
менее 0,3% сульфата. В случае необходимо-
сти можно провести дополнительную очистку
агарозы от сульфата обработкой 1 М NaOH
в 0,05%-ном боргидриде натрия и переосаж-
дением 50%-ным этанолом [Lönnerdal, Laas, 1976].

Насколько существенно эндосмос может влиять на резуль-
таты электрофореза, видно из данных Джонсона и др. [John-
son et al., 1980]. Авторы использовали три типа агаро-
зы с различной способностью к эндосмосу (значения —m_r со-
ставляли соответственно 0,081, 0,175 и 0,441; см. ниже). В одном
и том же опыте на параллельных полосках 1%-ной агарозы
этих типов они разделяли смесь трех форм репликативной ДНК
фага ФХ 174-сверхскрученной, кольцевой и линейной. С усиле-
нием эндосмоса не только происходило сильное замедление ско-
рости миграции всех ДНК (более чем втрое), но и (что хуже)
менялось взаимное расположение полос (рис. 4). По-видимому,
различные формы ДНК увлекаются потоком эндосмоса по-раз-
ному.

Наличие заряженных сульфогрупп иногда обусловливает
еще и неспецифическую сорбцию белков на агарозе, в результа-
те чего полосы расплываются с образованием «хвостов».

Степень эндосмоса количественно оценивают с помощью ко-
эффициента относительной миграции (—m_r). Знак «минус» здесь
только напоминает о том, что за счет эндосмоса нуклеиновые
кислоты «сносит» в сторону, противоположную направлению их
миграции. Коэффициент представляет собой отношение скоро-
стей миграции незаряженного полимера (за счет только эндос-
моса) и сходного с ним по структуре полианиона при электро-
форезе в агарозе данного типа. Для обозначения типов агарозы
ниже будет использована номенклатура фирмы «Miles». По дан-
ным каталогов, в частности по значениям —m_r ее нетрудно сопо-
ставить с обозначениями других фирм, тем более что большин-
ство из них получает свои препараты от одного и того же произ-
водителя — фирмы «Marine Colloids Inc.».

Для агарозы с малой степенью эндосмоса (тип LE) —m_r=
= 0,1 — 0,15. Для агарозы типа НЕ характерен сильно выражен-
ный эндосмос (—m_r= 0,23 — 0,26). Агароза типа ME занимает
промежуточное положение (—m_r= 0,15 — 0,2). Чем меньше в ага-

18

розе заряженных сульфогрупп, тем слабее силы электростати-
ческого отталкивания между молекулами полимера и выше их
способность к связыванию водородными связями. Агароза с по-
вышенными температурами плавления и гелеобразования (тип
НGТ) имеет —m_r< 0,1; именно она чаще всего используется
для обычного электрофореза. Вместе с тем специальная техно-
логическая обработка (введение оксиэтильных групп) позволя-
ет получать агарозу с малой степенью эндосмоса и пониженны-
ми температурами плавления и затвердевания — тип LGT («Sea
plaque» по номенклатуре фирмы «Marine Colloids»). Такая ага-
роза может быть полезна тем, что ее 1%-ный раствор остается
жидким при физиологической температуре (37°); кроме того,
плавление геля можно осуществить при температуре более низ-
кой, чем температура денатурации ДНК. Наконец, для иммуно-
электрофореза, при котором иммуноглобулины мигрируют к ка-
тоду и эндосмос способствует, а не препятствует их разделению,
была разработана специальная агароза типа НЕЕО с сильно вы-
раженным эндосмосом (—m_r> 0,3). Этого удалось добиться не
за счет увеличения числа сульфатов, содержание которых по-
прежнему не превышает 0,3%, поэтому неспецифическая сорб-
ция белков на агарозе этого типа почти не происходит.

Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лио-
филизированного порошка. Для приготовления геля выбранной
концентрации навеску порошка растворяют в соответствующем
буфере и выдерживают на кипящей водяной бане или в термо-
стате при 90—95° около 2 ч для образования истинного раство-
ра полимера. Иногда раствор агарозы просто кипятят с обрат-
ным холодильником.

Разнообразные буферы, детергенты и другие добавки смеши-
вают с раствором агарозы в горячем виде (при 50 — 60°). Они
не препятствуют ее застыванию. Впрочем, надо иметь в виду,
что высокая концентрация агентов, диссоциирующих водород-
ные связи, несколько затрудняет образование геля. Например,
гели обычной агарозы с 6 М мочевиной плавятся за 1,5 мин при
75°, но не застывают за 1 ч. при 20° [Langridge et al., 1980].

Контакт с кислородом воздуха не мешает застыванию ага-
розы, поэтому плоские гели для горизонтального электрофореза
готовят путем заливки дозированного объема расплавленной
агарозы на строго горизонтальную стеклянную пластинку нуж-
ного размера. Тем не менее горячую смесь агарозы с буфером
имеет смысл кратковременно деаэрировать под вакуумом.

Выбор концентрации агарозы, т. е. пористости ее геля, дик-
туется размерами фракционируемых макромолекул. Средний
размер пор 2%-ного геля агарозы приблизительно соответству-
ет диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с
массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием
агарозы используют для гель-фильтрации. При электрофорезе
поры геля должны быть легко проницаемы для молекул биопо-
лимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом

19

поле за счет трения, поэтому для электрофореза применяют ага-
розные гели с концентрацией 0,4 — 2%. Ниже для ориентировки
представлены примерные концентрации гелей агарозы (в %)
для некоторых распространенных объектов фракционирования:

Высокомолекулярная ДНК вирусов и плазмид             0,4
Рестрикты ДНК (5 — 20 тыс. пар оснований)               0,7
мРНК, денатурированная обработкой метилртутью          1,0
Реовирусная двунитевая РНК (500 — 5000 пар оснований)      1,5
Рибосомная РНК                                        1,75
Нативные мРНК; рестрикты ДНК (100 — 1000 пар оснований)                          2,0

Перед заливкой в форму или на пластину раствор горячей
агарозы охлаждают до 50° и выдерживают не менее 1 ч в тер-
мостате при данной температуре. Это необходимо для полного
выравнивания температуры раствора по всему его объему, чем
обеспечивается одновременное застывание всего геля и одно-
родность его структуры.

СМЕШАННЫЙ ГЕЛЬ (АГАРОЗА+ПААГ)

Электрофорез крупных белков иногда бывает целесообразно
вести в крупнопористом ПААГ, содержащем 1,5 — 2,5% акрила-
мида. Для придания прочности такому гелю его полимеризуют
совместно с 0,5 — 0,6% агарозы. Имеет место своеобразный «сим-
биоз»: чистая 0,5%-ная агароза, застывая, дает очень мягкий
гель, 2%-ный ПААГ не удается даже заполимеризовать, а их
комбинация образует гели с отличными механическими характе-
ристиками.

Пространственная сетка агарозы в силу указанных выше
причин имеет гораздо более крупные поры, чем полимеризую-
щийся внутри этой сетки ПААГ, и мало влияет на электрофоре-
тическую подвижность белков, зато образует жесткий каркас,
придающий необходимую прочность гелю в целом. Для образо-
вания такой структуры надо обеспечить условия, при которых
агароза затвердевает раньше, чем полимеризуется ПААГ. Ис-
ходя из этого, подбирают концентрацию персульфата аммония
и ТЕМЕД.

Агарозу растворяют в буфере с учетом последующего раз-
бавления, прогревают, как описано выше, и выдерживают в те-
чение часа при 50°. При этой же температуре добавляют соот-
ветствующий раствор мономеров акриламида, быстро деаэри-
руют смесь, вносят инициирующие добавки и немедленно зали-
вают между подогретыми до 37° стеклами. Сначала застывает
агароза; полимеризация акриламида обнаруживает себя появ-
лением границы, лежащей на 2 — 5 мм ниже края геля агарозы.
Для обеспечения формирования узкой начальной полосы пре-
парата при вступлении его в гель имеет смысл спустя час после
окончания полимеризации ПААГ снять одну стеклянную пла-
стину и обрезать гель ниже границы полимеризации акрилами-
да. Затем можно снова наложить пластину, зажать гель и за-

20

лить поверх него 0,3%-ную чистую агарозу, в которой и форми-
ровать «карманы» для внесения препаратов [Schwinghamer,
Shepherd, 1980].

В качестве примера можно назвать успешное разделение пу-
тем электрофореза в смешанном геле (1,7% ПААГ + 0,5 агаро-
зы) полисом печени мыши от мономеров до пентамеров [Nishi-
naga, Yamamoto, 1980].

АЦЕТАТЦЕЛЛЮЛОЗНАЯ ПЛЕНКА,
ИМПРЕГНИРОВАННАЯ ПААГ

Вместо агарозы можно использовать жесткую, крупнопори-
стую пространственную сетку ацетатцеллюлозы. Полоску этого
полимера сначала помещают на поверхность раствора, где она
смачивается, а затем погружают в раствор мономеров акрила-
мида с инициирующими добавками. ПААГ полимеризуется во
всем объеме раствора, а также полоски целлюлозы. По оконча-
нии полимеризации гель с поверхности полоски можно отслоить
и отмыть. Таким способом нетрудно получить «пластинку» тол-
щиной 0,1 мм. Конец полоски следует оставить свободным от ге-
ля (не погружать). На него удобно наносить исходный белковый
препарат, который легко впитывается в ацетатцеллюлозу [Fren-
kel, Blagrove, 1978].