содержание   ..  60  61  62  63  64  65  66  67  68 

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ

Выделение чистых культур дрожжей. Для изучения свойств какого-либо микроба прежде всего необходимо получить его в чистой культуре, т. е. в культуре, представляющей потомство одной клетки.

Изолирование (выделение) микробов или получение чистых культур возможно следующими методами:

из отдельной колонии методом посева на плотную питательную среду;

выделением чистой культуры заведомо из одной клетки (методом Линднера или при помощи микроманипулятора).

Выделение микроорганизмов из отдельной колонии. Этим методом часто пользуются для выделения чистых культур винных дрожжей. Метод основан на выделении чистой культуры из дрожжевой колонии, выросшей изолированно на плотной питательной среде. Для получения изолированных колоний можно пользоваться поверхностным посевом. С этой целью заранее за 2—3 сут разливают стерильно в чашки Петри виноградный сусло-агар слоем 5—6 мм.

Каждая клетка дрожжей, попав на плотную питательную среду, начинает размножаться и образует колонию — скопление клеток, расположенных вплотную одна к другой, которые являются потомством одной клетки. Если суспензия дрожжей, из которой делался посев, была густая, то на плотной питательной среде колонии вырастают близко одна к другой, часто сливаются вместе и в таком случае невозможно выделить потомство одной клетки, т. е. чистую культуру дрожжей.

Чтобы получить рост отдельных колоний на поверхности агара при выделении культур из бродящего виноградного сусла, нужно сделать его разведение. Для этого только что прокаленную и остуженную иглу погружают примерно на 1 см в бродящее сусло и сразу переносят в 0,5 мл стерильной водопроводной' воды в пробирке. После перемешивания содержимого пробирки из нее берут одну петлю посевного материала и переносят его на поверхность агара в чашку Петри. Маленькую каплю исследуемого материала размазывают легкими движениями стерильного стеклянного шпателя по поверхности агара.

Если чистую культуру дрожжей выделяют из виноматериала или других проб, содержащих неизвестное количество живых дрожжей, то делают обычно два посева. Первый — более густой делают из первоначального материала без разведения, второй — после предварительного разведения небольшого количества (1 —

2 капли) первоначального материала в 5 мл стерильной воды в пробирке. Из этого разведения и из первоначального материала берут стерильной пипеткой по 1 капле посевного материала и переносят на поверхность агара в чашки Петри, где его распределяют по поверхности агара шпателем.

Можно посевной материал распределять по поверхности агара для получения отдельных колоний не шпателем, а посевом при помощи петли штрихом. Для этого нужно взять стерильной (прокаленной и остуженной) петлей каплю исследуемого материала и сделать штрих по всей поверхности чашки с агаром (рис. 52). Чашки с посевами перевернуть вверх дном и инкубировать 4—5 сут при температуре 25—28°С.

Для выделения чистой культуры дрожжей прокаленной и остуженной петлей или лучше иглой прикасаются к выросшей изолированной колонии и переносят небольшое количество образующих ее клеток в пробирку со стерильным виноградным суслом или сусло-агаром. Через 2—3 сут размножится чистая культура.

Чашечным методом не всегда можно сразу получить колонии чистых культур, так как часть выросших колоний может образоваться не из одной клетки, а из нескольких, склеившихся между собой или из попавших на поверхность агара близко одна к другой и давших сначала изолированные колонии, но вскоре слившихся в одну смешанную. Поэтому необходимо провести повторный рассев выделенной из отдельной колонии культуры одним из выше описанных способов и снова отсеять культуру из изолированной колонии. Чистоту выделенной культуры проверяют как микроскопированием (однородность клеток), так и повторными рассевами в чашках Петри (однородность вырастающих колоний).
 

Выделение дрожжей из одной клетки по методу Линднера. На стерильное покровное стекло наносят стерильным чертежным пером ряд мелких капель из последовательных разведений дрожжей в стерильном сусле. Стекло перевертывают и помещают над лункой стерильного предметного стекла, края покровного стекла замазывают расплавленным парафином или смазывают вазелином, чтобы не происходило испарения. При просмотре под микроскопом отмечают капли, содержащие по одной клетке. Препараты помещают в термостат при температуре 25—28°С. Через 12—24 ч снова просматривают капли и отмечают те, где образовалась одна колония. Эту каплю осторожно снимают стерильной маленькой полоской фильтровальной бумаги, зажатой стерильным пинцетом, и вносят ее в пробирку со стерильным суслом (рис. 53).

Выделение дрожжей из одной клетки при помощи микроманипулятора. Микроманипулятор позволяет производить захват одной клетки дрожжей специальной микроскопической пипеткой или иглой под контролем микроскопа. Микроманипулятор имеет два операционных штатива (ассистента), между которыми расположен микроскоп. В держателях штативов закрепляются микропипетки или иглы. Перемещение их осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов, которые позволяют кончики инструментов вводить в висячую каплю и захватывать ими отдельную клетку [25, 140].
 

Выделение чистых культур уксуснокислых бактерий. Выделение ведут путем высева отдельных хорошо изолированных колоний, выросших на плотной питательной среде. Для выделения уксуснокислых бактерий отбирают образцы вин с запахом уксусноэтилового эфира, в которых при микроскопировании обнаружены отдельные клетки бактерий или скопления их — неподвижные короткие палочки, иногда с инволюционными формами.

Накопительную культуру готовят на вине с суслом. Пробу вина в количестве 0,5—1 мл высевают в среду. После 2—3 сут развития при температуре 28—30°С визуально судят о росте культуры — появление тонкой, гладкой, глянцевато-влажной или сухой пленки на поверхности среды.

Рассев накопительной культуры (разведений в стерильной водопроводной воде) проводят на сусло-агаре в чашках Петри. Через 2—3 сут при температуре 30—35°С вырастают колонии дрожжей и между ними — мелкие, плоские, неправильной формы, беловато окрашенные, влажно блестящие, слизистые колонии уксуснокислых бактерий. Отдельные колонии переносят в пробирки со стерильной жидкой питательной средой и выдерживают при температуре 28—30°С. О развитии бактерий судят по образованию пленки на поверхности питательной среды, внешние признаки которой следующие: тонкая, умеренно прочная, несмачиваемая, всползающая по стенкам пробирки.
При определении чистоты выделенной культуры ее визуально осматривают, чтобы убедиться в росте пленки. Микроскопический контроль должен подтвердить наличие бактерий палочек укороченных или удлиненно-яйцевидных, одиночных или соединенных по 2—3. Для проверки чистоты культуры можно воспользоваться окраской по Граму. Хранят выделенные культуры уксуснокислых бактерий на жидких или плотных питательных средах в холодильнике при температуре 5—10°С с пересевом 1 раз в месяц.

Выделение чистых культур молочнокислых бактерий. Для выделения молочнокислых бактерий берут вина, в которых при микросшширшашш; .обнаружены бактерии, могущие быть отнесенными к выделяемой группе на основании морфологических признаков. Накопительную культуру получают при высеве пробы вина в любую питательную среду, рекомендуемую для развития молочнокислых бактерий, с добавлением этилового спирта. Предпочтение отдается жидкой капустной среде или солодовому суслу с содержанием сухих веществ 3%.

Пробу вина в количестве 0,5—1 мл стерильно высевают в среду. После подращивания в термостате при температуре 28°С в течение суток в посев добавляют этиловый спирт до содержания 12—16% об. и продолжают инкубацию в термостате. О получении накопительной культуры судят по помутнению среды, появлению осадка. Помимо визуальной оценки культуральную жидкость микроскопируют и выявляют присутствие молочнокислых бактерий.

Накопительную культуру можно получить путем подращивания бактерий в пробе вина. Для этого в пробу вина добавляют несколько миллилитров дрожжевого автолизата (20—30 мл на 1 л вина) и оставляют при комнатной температуре на несколько дней без доступа воздуха. Затем вино центрифугируют при 5000 об/мин дважды: первый раз 2—3 мин для отделения дрожжей, второй — 10—20 мин для осаждения бактерий. Вино сливают из центрифужных пробирок, а осадок используют для рассева.

Основным методом выделения чистой культуры молочнокислых бактерий является известный способ выделения отдельной колонии, которую считают результатом развития одной клетки.

Накопительную культуру или ее разведения в стерильной водопроводной воде высевают на поверхность плотной среды — 1,5% солодового сусла-агара, содержащего 3% СВ. Порядок работы при этом такой же, как и при выделении чистых культур дрожжей.

Через 7—14 дней на поверхности плотной среды вырастают крупные выпуклые кремового оттенка колонии дрожжей, а между ними — мельчайшие плоские, голубоватые, опалесцирующие колонии молочнокислых бактерий не совсем правильной округлой формы с неровными краями, хорошо видные в лупу с четырехкратным увеличением. Из выросших на чашках типичных колоний бактерий, далеко отстоящих от колоний других микробов, захватывают посевной петлей или лучше иглой колонию и переносят ее в пробирку с жидкой средой. Пробирки помещают в термостат при температуре 20—25°С на 7—10 дней.

Когда среда в пробирках слегка помутнеет и в ней при встряхивании пробирки станут видны прозрачные шелковистые волны, а на дне — легкий беловатый осадок, это значит, что бактерии размножились.

Чаще бывает достаточно одного посева на плотную среду, чтобы получить чистую культуру. Однако для уверенности в чистоте культур посев на плотную питательную среду повторяют. В качестве посевного материала при этом используют культуру, полученную из отдельной колонии.

Чистота культуры выделенных молочнокислых бактерий должна быть проверена визуальным способом, микроскопическим контролем и высевом на диагностическую питательную среду.

Визуальный осмотр посева на скосе плотной питательной среды должен подтвердить однородность культуры.

Микроскопический контроль должен подтвердить наличие тонких коротких или длинных палочек, или кокковых форм, расположенных по две или цепочками.

Для предварительного ориентировочного определения молочнокислых бактерий делают рассев культуры на поверхность ага-ризованного солодового сусла с 2% мела. Вокруг колоний молочнокислых бактерий возникает зона растворения мела в результате образования ими молочной кислоты и растворимого лактата кальция.

Хранят выделенные культуры молочнокислых бактерий на жидких питательных средах, в том числе и на смеси (1 : 1) виноградного сусла с солодовым, содержащим 3% сухих веществ, в холодильнике при температуре 5—10°С с пересевом 1 раз в месяц.

Для хранения лейконостоков рекомендуется среда АТБ с 1,5% агара. Культуры, посеянные уколом, выращивают в анаэробных условиях в атмосфере Н2 и С02 (9 : 1), а затем хранят в холодильнике в течение нескольких месяцев [73].