содержание   ..  60  61  62  63  64  65  66  67  68 

МЕТОД ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЖИВЫХ И МЕРТВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Метод состоит в окрашивании препарата в флуорохромом примулином. При рассматривании препарата в люминесцентном микроскопе тела мертвых микроорганизмов люминесцируют в результате проникновения красителя внутрь клеток. Живые микроорганизмы не видны.

При микроскопировании белых вин бактериологической петлей диаметром не более 2 мм помещают на предметное стекло каплю осадка и рядом каплю водного раствора примулина (1 : 20 000), смешивают кх и накрывают покровным стеклом, на которое затем кладут каплю нелюминесцирующего иммерсионного масла.

При микроскопировании красных вин в связи с гашением люминесценции красным цветом вина последний необходимо устранить, что достигается созданием в препарате щелочной среды. Красный цвет вина при этом превращается в синий. Бактериологической петлей помещают на предметное стекло рядом каплю осадка вина и 2 капли раствора примулина (1 : 20000) в фосфатном буферном растворе pH 8—9.

Все капли тщательно смешивают петлей и покачиванием стекла в течение 1—2 мин, накрывают покровным стеклом, на которое помещают каплю нелюминесцирующего иммерсионного масла.

Приготовленные препараты рассматривают в люминесцентном микроскопе в фиолетовой и синей видимой части спектра.

Для этого пользуются светофильтрами «синий свет», «сине-зеленый свет», «белый свет» и запирающим желтым.

Применяют объектив масляной иммерсии 90Х, окуляр 5Х и дополнительное увеличение 1,6Х (для микроскопа MЛ-2).

Сначала препарат рассматривают в проходящем свете и подсчитывают общее количество микроорганизмов, а затем в свете люминесценции, подсчитывая только количество мертвых клеток.

В свете люминесценции живые микроорганизмы не видны, иногда у дрожжевых клеток светится только оболочка в виде

тонкого зеленого кольца (рис. 50). Мертвые дрожжи и бактерии в свете люминесценции светятся зеленым и желтым светом разной интенсивности. Исключение составляют уксуснокислые бактерии в красных винах, погибшие под воздействием высоких температур. В этом случае мертвые бактерии не люминесцируют, так же, как и живые.

Рис. 50. Дифференциация живых и мертвых клеток дрожжей, обработанных примулином при люминесцентной микроскопии. Мертвые клетки светятся, живые окружены светящимся кольцом оболочки.
 

Для уточнения физиологического состояния уксуснокислых бактерий рекомендуется производить контрольное микроскопирование убитой культуры. Для этого на два предметных стекла наносят по капле осадка вина. На первом стекле готовят препарат для микроскопирования, как описано выше, для красного вина. Каплю вина на втором стекле осторожно подогревают, несколько раз проводя стекло нижней поверхностью над пламенем горелки, пока оно не станет горячим (определяется тыльной стороной кисти руки). После остывания продолжают приготовление препарата. Сравнивают микроскопическую картину в обоих препаратах. Если уксуснокислые бактерии в исследуемой пробе вина живы, то в первом препарате они не светятся, а во втором (погибшие в результате мягкого термического воздействия) — ярко люминесцируют. Если бактерии в пробе вина были мертвы — в обоих препаратах микроскопическая картйна будет одинаковой.

Контрольное параллельное микроскопирование препаратов можно применять во всех случаях, когда определение физиологического состояния микроорганизмов затруднительно.

При подсчете микроорганизмов необходимо учитывать разведение исследуемого материала в 2 раза для белых вин и в 3 раза — для красных.