содержание   ..  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50  ..

МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

Морфология клеток. Молочнокислые бактерии имеют форму палочек или кокков, размеры которых зависят от состава среды и условий культивирования.

Палочковидные формы могут быть короткими, почти коккообразными, длиной 0,5—0,7 мкм и длинными нитевидными, иногда достигающими длины 8,0 мкм. Располагаются они единично, парами или цепочками, некоторые с характерными «обрубленными» концами.

Кокковые формы молочнокислых бактерий бывают овальными, диаметр клеток от 0,5—0,6 до 1 мкм. Они располагаются единично, парами или цепочками различной длины (рис. 36).

На форму клеток значительное влияние оказывает состав среды. Так, длина клеток молочнокислых бактерий увеличивается в средах с высоким содержанием этилового спирта [69, 73,137]. Этиловый спирт тормозит деление клеток сильнее, чем рост. Поэтому в спиртсодержащих средах палочки вытягиваются в длину, становятся тонкими, кокки сохраняют свою форму [69].

Молочнокислые бактерии, встречающиеся в виноделии, неподвижны, не образуют спор, положительно окрашиваются по

Граму, не образуют пигмент, не восстанавливают нитраты в нитриты, характеризуются неактивной каталазой.

Структура и компоненты клеток молочнокислых бактерий во многом сходны с другими грамположитель-ными бактериями.

Клеточная оболочка представляет собой электронноплотный гомогенный слой толщиной 15—60 нм. Цитоплазматическая мембрана может быть двухслойной или трехслойной толщиной до 7—8 нм [73].

В цитоплазме клеток обнаружены рибосомы диаметром до 15 нм, ядерный материал (нуклеоид), состоящий из тонких плотных нитей, отождествляемых с дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) (рис. 37, 38). Структура и состав клеток могут быть различными у молочнокислых бактерий отдельных видов. Некоторые палочковидные формы содержат в качестве включений зерна метахроматина.

Молочнокислые бактерии размножаются путем простого деления. Бактериальная клетка увеличивается в размерах и делится на две одинаковых клетки. Деление клетки в одной плоскости приводит к образованию цепочек, в двух плоскостях — к образованию тетрад, характерных для рода Pediococcus. При благоприятных условиях некоторые бактерии дают новое поколение через 15 мин и менее, при неблагоприятных — через 24 ч и более.

На поверхности желатиновых, агаризованных сред молочнокислые бактерии образуют мелкие колонии, иногда без выраженного поверхностного роста. По данным О. К. Палладиной [136], палочковидные бактерии на средах, содержащих вещества с восстановительными свойствами, например с 0,2% цистеина, образуют типичные шероховатые формы колоний. У бактерий рода Leuconostoc найдены S-, О- и R-типы колоний.
 

Физиология молочнокислых бактерий. Характерным признаком молочнокислых бактерий является отсутствие каталазы. Однако в последние годы появились сообщения об обнаружении каталазной активности у различных видов молочнокислых бактерий. Псевдокаталаза есть у штаммов некоторых видов родов Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus.

Протеолитическая активность установлена как у кокковых форм, так и у палочек и стрептобактерий, при этом палочковидные бактерии обладают большей активностью, чем кокковые 164 формы. Обнаружены протеазы, разрушающие пептиды. В производстве важно использовать молочнокислые бактерии, образующие в больших количествах свободные аминокислоты. При подборе штаммов важно также отобрать такие, которые не образуют фракции пептидов с горьким вкусом [74].
 

Липолитической активностью обладают штаммы многих видов молочнокислых бактерий кокковых и палочковидных форм. Препарат липазы, полученный из бесклеточных экстрактов L. brevis, довольно легко гидролизовал простые триглицериды [73].

По биохимической деятельности молочнокислые бактерии в зависимости от характера продуктов сбраживания гексоз (глюкоза, фруктоза, манноза, галактоза), дисахаридов (лактоза, мальтоза, сахароза) и полисахаридов (декстрин, крахмал) делятся на гомоферментативные и гетероферментативные. Гомоферментативные бактерии при брожении сахаров образуют в основном молочную кислоту и незначительные количества фума-ровой и янтарной, летучих кислот, этилового спирта и углекислоты; гетероферментативные — наряду с молочной значительно большие количества уксусной кислоты, этилового спирта, углекислого газа и других продуктов, используя на это до 50% сахаров.

Гомоферментативное молочнокислое брожение выражается формулой:
 

Осуществляется гомоферментативное молочнокислое брожение по гликолитической схеме Эмбдена — Мейергофа — Парнаса (см. главу I). При этом выход молочной кислоты от потребленной глюкозы составляет почти 100%.

Процесс расщепления гексозы проходит через те же стадии, что и при спиртовом брожении, т. е. по гексозодифосфатному пути до образования пировиноградной кислоты. Далее пировино-градная кислота не превращается как при спиртовом брожении в уксусный альдегид и углекислый газ из-за отсутствия фермента карбоксилазы, а восстанавливается в молочную кислоту.

В. Н. Шапошников [224] рассматривает процесс гомофермен-тативного брожения как классический пример строгого разграничения в материальном отношении конструктивного и энергетического обменов. Гомоферментативное брожение—-только энергетический обмен. Для построения массы бактерий используется не глюкоза, а готовые аминокислоты субстрата.

Гетероферментативное молочнокислое брожение происходит по другому пути — по пентозофосфатному и выражается общей формулой:

Пировиноградная кислота частично расщепляется до уксусного альдегида и С02. В результате превращений уксусного альдегида и пировиноградной кислоты образуются янтарная и уксусная кислоты и этиловый спирт.

При гетероферментативном брожении может накопиться молочной кислоты до 40% от количества сброженного сахара, янтарной кислоты — около 20%, этилового спирта—10%, уксусной кислоты — 10%, газов — около 20%.

Гетероферментативные бактерии вызывают молочнокислое брожение в крепких, десертных и столовых недоброженных винах. При этом наблюдается уменьшение сахара, увеличение титруемой кислотности (до 9 г/'л) и летучей (до 4 г/л), выделение углекислого газа.

Деление молочнокислых бактерий на гомо- и гетероферментативные было предложено Орла-Иенсеном. Однако следует заметить, что нет строгого функционального различия между этими группами молочнокислых бактерий. Приводится много исследований, свидетельствующих о том, что в зависимости от ряда факторов (pH, присутствия С02 и 02, физиологического состояния клеток) изменяется характер конечных продуктов брожения. Так, некоторые штаммы L. plantarum, L. casei, не обладающие способностью образовывать газ из глюкозы на специальной среде, в аэробных условиях накапливают летучие кислоты, диацетил,, ацетоин [73], т. е. гомоферментативные бактерии в зависимости от состава среды могут образовать кроме молочной кислоты различные вторичные продукты брожения.
 

Е. И. Квасников и Г. Ф. Кондо [68] при исследовании молочнокислых бактерий, развивающихся в винах, наблюдали у штаммов L. buchneri, L. brevis, L. fermenti потерю способности к образованию летучих кислот, углекислоты и спирта. Такое превращение гетероферментативных бактерий в гомоферментативные происходило при длительном культивировании бактерий, выделенных из больных вин, на автолизатглюкозных и люцерновых средах.

А. Ф. Войткевич считал необоснованным отказываться на этом основании от деления бактерий на гомо- и гетероферментативные, так как наличие переходных форм не исключает возможности выделения основных типов.

Молочнокислые бактерии могут также проводить в вине про-', цесс яблочно-молочного брожения, который заключается в разложении яблочной кислоты до молочной по схеме:

В результате превращения двухосновной яблочной кислоты в одноосновную молочную уменьшается титруемая кислотность, увеличивается значение pH, выделяется углекислый газ. В весовом отношении из 134 г яблочной кислоты образуется 90 г молочной кислоты и 44 г углекислого газа, т. е. 1 г яблочной кислоты дает 0,67 г молочной кислоты. Эта реакция не сопровождается выделением энергии. Следовательно, энергетический обмен осуществляется иным путем. Источником энергии при процессе яблочно-молочного брожения являются очень незначительные количества углеводов. Для разложения 1 г яблочной кислоты бактериям достаточно 0,1—0,2 г глюкозы.

Превращение яблочной кислоты в молочную через пирови-ноградную осуществляется при помощи яблочного фермента (малик-фермента), который является адаптивным и образуется бактериями в том случае, если в субстрате имеется яблочная кислота.

Превращение яблочной кислоты в молочную осуществляется молочнокислыми бактериями и через щавелевоуксусную кислоту, а также прямым декарбоксилированием.

• Общепризнано, что гомо- и гетероферментативный тип брожения гексоз вызывается в вине соответственно гомо- и гетеро-ферментативными бактериями. Существенные разногласия вызывает вопрос о принадлежности возбудителей яблочно-молочного брожения к определенному биохимическому типу молочнокислых бактерий, строго приспособленному к гомо- или гетерофермента-тивному процессу.

Е. И. Квасников и Г. Ф. Кондо [68], в течение ряда лет изучавшие биологию молочнокислых бактерий, выделенных из больных вин Средней Азии, считали неправильным связывать процессы молочнокислого скисания и яблочно-молочного брожения с

определенными, узко специализированными видами бактерий. Проведенное ими искусственное заражение вин различными штаммами молочнокислых бактерий показало, что гетерофер-ментативные бактерии вызывают заболевание вин молочнокислым скисанием, сбраживая сахар с образованием молочной и летучих кислот.

Эти же бактерии при недостатке сахара вызывают процесс яблочно-молочного брожения, используя яблочную кислоту.

В настоящее время мнения большинства ученых сходятся на том, что и гомо- и гетероферментативные бактерии могут вести в вине процесс яблочно-молочного брожения [71, 72, 235, 251, 264, 287, 291, 304].

Многочисленные исследования, проведенные в последнее время за рубежом, показали, что из вин, подвергшихся яблочно-молочному брожению, изолируются различные виды молочнокислых бактерий гомоферментативных (L. plantarum, L. casei) и гетероферментативных (палочек L. buchneri, L. brevis, L. hilgar-dii, кокков — Leuconostoc mesenteroides, Leuc. citrovorum, Leuc. vini, Leuc. gracile).

Таким образом, яблочно-молочное брожение в вине может быть вызвано любым видом гомо- и гетероферментативных молочнокислых бактерий. Разложение яблочной кислоты — свойство всех видов молочнокислых бактерий. Его легко обнаружить, выращивая молочнокислые бактерии на средах, в которых единственным источником углерода является яблочная кислота. Лимонная, винная и молочная кислоты используются меньшим количеством молочнокислых бактерий, поэтому деление молочнокислых бактерий на гомоферментативных, гетероферментативных и яблочно-молочного брожения является неверным. Самостоятельно третьей группы бактерий не существует, имеются лишь гомо- и гетероферментативные, вызывающие яблочномолочное брожение в винах с различной кислотной характеристикой.

Продукты обмена веществ. Основными веществами функциональной деятельности молочнокислых бактерий являются молочная кислота, спирты и летучие кислоты, диацетил и ацетоин и др.