содержание   ..  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10    ..

МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ
 

Форма и размеры. Клетки дрожжей имеют разнообразную форму: круглую, овальную или эллиптическую, лимонообразную, цилиндрическую, иногда сильно вытянутую в виде гифов.

По сравнению с другими микроорганизмами дрожжи являются довольно крупными формами. Диаметр клеток дрожжей достигает 1—8 мкм, длина— 1—10 мкм. При таких размерах клеток поверхность их в 1 л сбраживаемого виноградного сока может достигать 10 м2. Именно такая большая поверхность клеток дрожжей определяет интенсивность их метаболизма и процесса обмена веществ с окружающей средой. Масса дрожжевых клеток, равнозначная по массе животному (500 кг), за сутки синтезирует более 50 т белка, а животное — всего около 0,5 кг.

Плотность (удельный вес) клеток дрожжей мало отличается от плотности бактериальных клеток. Относительная плотность бактериальных клеток составляет от 1,050 до 1,112; дрожжевых — от 1,055 до 1,060 [139].

Морфологически неизменные формы клеток дрожжей наблюдаются только у молодых культур на стандартной питательной среде. Одна и та же культура дрожжей может состоять из кле-

ток, различающихся по форме и размерам, особенно в зависимости от стадий развития и условий окружающей среды. Так, хересные дрожжи в период брожения, как правило, крупные, имеют эллиптическую или круглую форму клеток, тогда как в стадии образования пленки они становятся мельче, приобретают более вытянутую конфигурацию [177, 223]. Дрожжи рода Hansenula, обычно образующие пленку на поверхности вина из скоплений клеток сильно вытянутых, мелких, при развитии в среде с ограниченным доступом воздуха, например на дне бутылки, становятся крупнее, круглой формы. Форма и величина клеток дрожжей при введении СО2 в среду значительно изменяется. Размеры клеток пивных дрожжей (Sacch. carlsbergensis ) увеличиваются и„ наоборот, клетки слабо бродящих дрожжей (Torula latvica) становятся значительно мельче [37].

Структура. Клетка дрожжей имеет сложное строение и состав. Размеры отдельных элементов ее находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Значительные успехи, достигнутые в настоящее время в расшифровке структур клетки дрожжей и их функций, основаны на новых методах исследования — электронной микроскопии и комплексной цитологии.

Дрожжевая клетка является одноклеточным микроскопическим организмом и имеет в основном то же строение, что и клетки животных и растений (рис. 16, 17). Внутри клетки содержатся компоненты, которые обычно подразделяются на органеллы и включения. К органеллам относятся клеточная оболочка, цитоплазматическая мембрана, цитоплазма, митохондрии, вакуоли, аппарат Гольджи, ядро. Включения — это временные образования клетки (гликоген, трегалоза, жир, метахроматин и др.К которые появляются и исчезают в процессе обмена веществ.

Клеточная оболочка — плотная, тонкая и эластичная, окружает цитоплазму и придает характерную форму клетке дрожжей, защищает ее от вредных факторов среды, несет электрический заряд. Оболочка поддерживает внутриклеточное осмотическое давление, регулируя поступление в клетку через поры солей и других низкомолекулярных соединений.

 

В химический состав клеточной оболочки входят белково-нолисаха-ридные комплексы, фосфаты и липиды. У Sacch. cerevisiae полисахаридная часть комплекса состоит примерно из равных количеств глю-кана и маннана, сумма которых составляет около 90% от сухой массы оболочки; остальное количество ее приходится на долю белка, липидов, глюкозамина [165]. Белковые комплексы насыщены дисульфидными и сульфгидрильными группами. Липиды в основном (примерно на 2/3) состоят из свободных жирных кислот (олеиновой, пальмитолеиновой, пальмитиновой и стеариновой); остальную часть их представляют триглицериды, стерины и фосфолипиды.

В клеточных оболочках других видов дрожжей содержится глюкан, который не всегда связан с маинаном. Маннан может содержаться в клеточных оболочках дрожжей в небольших количествах (Sacch. guttulata и Endomycopsis capsularis), или совсем отсутствовать (Nadsonia fulvescens, Schizosaccharomyces). Оболочки клеток дрожжей, лишенные маннана, за исключением видов рода Schizosaccharomyces, содержат повышенные количества хитина.

В области периплазмы, которая находится между внутренней поверхностью клеточной оболочки и внешней поверхностью цитоплазматической мембраны, найден ряд ферментов. В основном это гидролитические ферменты, в том числе (3-фруктофуранози-даза (инвертаза) и кислая фосфатаза.

Обычно с составом клеточной оболочки связывают явление хлопьеобразования (флокуляции) дрожжей. Для дрожжей, так же как и для бактерий, установлено, что переход S-форм (гладких) в R-формы (шероховатые) и образование хлопьев в жидкой среде обусловлены превращением гидрофильных групп клеточной оболочки в гидрофобные [115, 146]. Однако анализ клеточных оболочек дрожжей, выделенных из хлопьеобразующих и нехлопьеобразующих штаммов Sacch. cerevisiae и Sacch. carls-bergensis, выращенных на синтетической среде, не выявил значительных различий в содержании основных компонентов, хотя по мере роста как у тех, так и у других количество маннана постепенно уменьшалось, а глюкана — увеличивалось. И лишь активная связь фосфоманнана и ионов кальция у двух соседних хлопьеобразующих клеток дрожжей может служить объяснением явления флокуляции [275].

Электронно-микроскопически также не обнаружены какие-либо особенности клеточных оболочек у флокулирующих дрожжей. По-видимому, эффект флокуляции дрожжей обусловлен наследственностью штамма.

Цитоплазматическая мембрана образует наружный слой цитоплазмы. Она окружает протопласт — отдельную структурную фракцию клетки, которую можно получить при удалении клеточной оболочки с помощью ферментов. Цитоплазматическая мембрана состоит из разных по плотности электронных слоев общей толщиной не более 10 нм тесно связанных с цитоплазмой. При микроскопировании в темном поле мембрану можно наблюдать в виде тонкого светящегося ободка.

В клетке микроорганизма цитоплазматическая мембрана осуществляет 4 основные функции [165]: действует как осмотический барьер, регулирует проникновение питательных веществ из раствора в клетку и удаление продуктов обмена веществ, выполняет биосинтез некоторых составных частей клетки (компонентов клеточной оболочки), представляет собой место локализации некоторых ферментов и органелл (рибосомы).

Поступление (транспорт) веществ в клетку связано с изменением проницаемости мембраны, которая в свою очередь зависит от активности фосфолипазы и липазы [77].

Цитоплазма клетки дрожжей содержит все основные структуры, присущие высокодифференцированным клеткам, а именно: митохондрии, рибосомы, более или менее развитый эндоплазматический ретикулум (эндоплазматическая сеть), запасные вещества и другие внутриклеточные включения липоидной и углеводной природы. Они принимают активное участие в осуществлении важных ферментативных процессов в цитоплазме.

В результате электронно-микроскопических и биохимических исследований установлено, что цитоплазма представляет собой коллоидную систему, состоящую из белков, углеводов, липидов, минеральных веществ, воды и соединений других видов. По консистенции она характеризуется высоким показателем вязкости, превышающим вязкость воды в 800—8000 раз, что соответствует вязкости глицерина или густого сиропа. Вязкость цитоплазмы при старении клеток возрастает.

Структура цитоплазмы изменяется в зависимости от условий культивирования и возраста клетки. Изменения цитоплазмы могут быть обратимые (паранекроз) и необратимые (некротические), что обусловлено степенью воздействия внешних факторов. У молодых клеток дрожжей цитоплазма гомогенна; при старении появляются вакуоли, зернистость, жировые капельки, гранулы полифосфатов и липоидов, т. е. цитоплазма становится гетерогенной.

При длительном дифференциальном центрифугировании цитоплазма делится на растворимую фракцию (клеточный сок) и на фракцию частиц, состоящую из мембран и рибосом. Растворимая фракция, заполняющая пространство между частицами в пнтактной клетке, является основным компонентом, который обеспечивает взаимодействие метаболитов с той средой, где находятся и функционируют структурные элементы. В растворимой фракции содержатся вещества с высокой молекулярной массой, преимущественно ферменты и транспортная РНК (тРНК), а также низкомолекулярные соединения, к которым относятся запасные углеводы, например, трегалоза и фонд (пул) аминокислот и нуклеотидов [165]. В результате наличия в цитоплазме низкомолекулярных соединений возникает заметная разность в осмотическом давлении клеточного содержимого и наружной среды. Величина осмотического давления у дрожжей обычно составляет около 1,2 МПа [165].

Электронно-микроскопические исследования ультратонких срезов клеток показали, что цитоплазму пронизывает эндоплаз-матическая сеть (ретикулум), имеющая гранулярную или гладкую структуру. Тесный контакт ретикулума с другими компонентами клетки позволяет ему выполнять важную роль в обменных процессах клетки.

Одним из компонентов эндоплазматического ретикулума являются рибосомы. Это ультрамикроскопические плотные сферические гранулы. Они содержат почти равное количество РНК. и белка, незначительное — липидов. С функциональной особенностью рибосом связан синтез клеточных белков. На них происходит конденсация активированных аминокислот и укладка их в полипептидную цепь в соответствии с генетической информацией, переданной из ядра через информационную РНК [88].

Митохондрии — это высокоспециализированные обязательные мельчайшие органеллы дрожжевой клетки. Они обычно распределены равномерно между клеточной оболочкой и вакуолью. Их можно обнаружить не только в покоящихся клетках дрожжей, но и в клетках почкующихся, находящихся на различных стадиях роста и размножения, в почках и спорах. В монографии А. В. Котельниковой и Р. А. Звягильской «Биохимия дрожжевых митохондрий» [85] рассмотрена подробно структурно-функциональная организация дрожжевых митохондрий.

Форме и размерам дрожжевых митохондрий присуща изменчивость. Длина их у различных дрожжевых организмов составляет от 0,2 до 7,5 мкм. По форме они могут быть в виде небольших гранул, палочек, нитей, цепочек.
 

Обычно число митохондрий в клетке колеблется от одной да 50. Но даже если в клетке присутствует всего одна митохондрия, она занимает не менее 20% объема клетки. В дрожжах Sacch. cerevisiae объем этих органелл может достигать 80% объема всей клетки. При низкой концентрации глюкозы в среде дрожжевая клетка содержит 100—200 митохондрий, при высокой — 30—40.

Митохондрии совершают свои функции при непрерывном перемещении с изменением размеров и формы, характеризуются быстротой и специфичностью реакции на изменения условий культивирования и физиологического состояния клетки.

Митохондрии отделены от цитоплазмы наружной двухслойной мембраной. Внутренняя мембрана образует выступы-кристы, чаще всего пузырчато-трубчатого строения. Пространство между кристами заполнено гомогенным веществом — матриксом. Слой внешней мембраны митохондрий, прилегающий к цитоплазме, имеет шероховатую поверхность и содержит перфорацию нерегулярного устройства.

Факт обязательного присутствия митохондрий в структуре клетки свидетельствует о локализации в них особых процессов, важных в обмене веществ. Дрожжевые митохондрии состоят главным образом из липидов — около 30% и белков — 65—70% сухой массы митохондрий, из которых около 25—35% находятся в форме структурного белка.

Дрожжевые митохондрии содержат ферменты, которые обеспечивают выполнение основной энергетической функции (окисление субстратов в цикле Кребса, перенос электронов через дыхательную цепь и окислительное фосфорилирование) — участвуют в сложном механизме воспроизведения митохондриальной ДНК, транскрипции и трансляции генетической информации, в биосинтезе фосфолипидов стеринов, в активации жирных кислот и др. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК) составляют количественно небольшой структурный компонент митохондрий.

Одним из наиболее значительных достижений молекулярной биологии последних лет считают обнаружение в митохондриях специфической ДНК [85]. Митохондриальная ДНК (мДНК) существенно отличается от ядерного компонента ДНК клетки.

Вакуоли в дрожжевых клетках являются обязательным органоидом. Кроме растворенных в воде электролитов, в вакуолях содержатся в коллоидном состоянии белки, жиры, углеводы и ферменты. В вакуолях накапливаются: Na, К, Са, Mg, Cl, SO4 и РО4 в виде отдельных элементов и солей, причем концентрация их во много раз превышает содержание солей в окружающей среде [109].

Размеры и форма вакуолей в дрожжевых клетках подвержены значительным изменениям. В одной дрожжевой клетке их может быть или несколько, или одна — центральная вакуоль.
 

Вакуоли содержат разнообразные включения как в состояли раствора, так и в форме кристаллических или аморфных гранул и капель; pH сока вакуоли 5,9—6,0; осмотическое давление составляет величину, близкую осмотическому давлению 2,5— 3,5%-ных растворов хлористого натрия. Содержимое вакуоли обычно оптически пусто. Светятся лишь кристаллические и липо-идные включения, находящиеся в энергичном броуновском движении. В вакуолях протекают активные окислительно-восстановительные процессы [109].

Аппарат Гольджи (диктиосома) состоит из ряда двойных мембран, концентрически изогнутых. Иногда от концов мембран отшнуровываются круглые пузырьки, которые могут затем превращаться в крупные вакуоли. Считают, что функция аппарата Гольджи заключается в управлении общим ходом физиологических процессов.

Ядро является постоянным структурным компонентом дрожжевой клетки. В живых дрожжах ядра можно отчетливо наблюдать в клетках, пробывших несколько дней в стерильной воде, цитоплазма которых вследствие голодания становится более гомогенной и прозрачной, а также при флуоресцентной микроскопии после обработки дрожжевых клеток растворами флуоро-хромов и при фазово-контрастной микроскопии.

Ядро у дрожжей имеет оболочку, ядрышко (кариосому) и основное содержимое — кариоплазму. Оболочка принимает участие в регуляции внутриядерных процессов путем изменения проницаемости и непосредственных сообщений между ядром и внеклеточной средой и ядром и цитоплазмой [109, 168].

Диаметр дрожжевого ядра около 2 мкм, чаще всего ядра имеют шаровидную или эллиптическую форму. Расположение их может меняться в процессе жизнедеятельности клетки.

Размеры дрожжевого ядра неодинаковы не только в клетках различных родов, но и в клетках одной и той же культуры при разном физиологическом состоянии. Крупные ядра с отчетливой кариосомой наблюдаются у дрожжей представителей родов Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Saccharomycodes. В противоположность им клетки, принадлежащие к слабо бродящим и небродящим дрожжам (Torulopsis pulcherrima, Т. utilis), имеют обычно относительно мелкие ядра. У растущих дрожжевых клеток ядра обогащаются нуклеиновыми кислотами и часто перемещаются в активные участки роста ближе к участкам, в которых происходит почкование или деление клеток.

Основным химическим ингредиентом ядра является ДНК. С нею и только с нею связана передача генетической информации от одного поколения клеток к другому. В состав ядра обязательно входит также РНК, но обычно в меньшем количестве, чем ДНК- Ядро содержит и белки, не связанные с нуклеиновыми кислотами. Молекулами ДНК и РНК обусловливаются синтез и особенности белков клетки. Поток генетической информации направлен от ДНК через РНК к белку (ДНК—>РНК—белок).

Содержание ДНК в любой клетке или в организме строго постоянно и не зависит от условий внешней среды, от питания или от воздействия различных факторов, влияющих на метаболизм клетки. Так, количество ДНК в дрожжах Sacch. cerevisiae XII расы на различных фазах роста в пределах 72 ч составляло

0,18—0,17% в расчете на сухую биомассу. Содержание ДНК в дрожжевых клетках винных дрожжей после термической обработки почти не изменяется [6].

Нуклеотидный состав ДНК весьма специфическим образом зависит от вида организма. Однако число остатков аденина равно числу остатков тимина (т. е. А=Т), а число остатков гуанина равно числу остатков цитозина (Г = Ц), т. е. число пиримидиновых остатков равно числу пуриновых остатков (А + Г = Т + Ц). Близкие виды дрожжей имеют сходный нуклеотидный состав, а эволюционно отдаленные организмы весьма заметно различаются по этому показателю. Поэтому часто нуклеотидный состав ДНК используют как таксономический признак [76].

При размножении клеток в ядрах обнаруживаются структуры, содержащие ДНК,— хромосомы, которые у дрожжей можно видеть иногда на фиксированных препаратах при окраске [109]. В хромосомах ДНК, связанная с белками-гистонами, образует нуклеопротеидные нити толщиной около 10 нм [63]. Для конкретного вида дрожжей число хромосом, длина и форма их постоянны.

Однако данные о числе хромосом у дрожжей весьма противоречивы и пока не подкрепляются ни результатами электронномикроскопических исследований, ни генетическими данными [168].

В определенных условиях в природе и в эксперименте при воздействии различных химических и физических агентов число хромосом в клетке может изменяться. У гаплоидных клеток набор хромосом одинарный (п), у диплоидных — двойной (2 п). С увеличением числа хромосомных наборов возрастает содержание ДНК, увеличиваются размеры клетки, ее ядра и ядрышка. Гаплоидные клетки содержат точно половину того количества ДНК, которое обнаруживается в диплоидных.

Внутриклеточные включения и запасные вещества, находящиеся в цитоплазме и вакуолях клеток в процессе их жизнедеятельности,— это морфологически дифференцированные образования гранул гликогена, метахроматина (волютина), жироподобных веществ и капель жира, скоплений серы, кристаллов кислот и сахаров. Они находятся в клетке в осмотически инертной форме, обычно нерастворимы в воде.

Трегалоза (нередуцирующий дисахарид) и гликоген (полисахарид) содержатся в клетке в значительных пределах: трегалоза — от 20 до 150 мг, гликоген — от 30 до 100 мг на 1 г сухих веществ клеток. В дрожжах, выращенных в аэробных условиях, преобладает трегалоза, в то время как в дрожжах, взращенных анаэробно,— гликоген. С повышением температуры среды количество трегалозы в клетках увеличивается [4]. Гранулы гликогена появляются в начале брожения и постепенно исчезают к концу. По современным сведениям, гликоген у дрожжей Sacch. cerevisiae локализован снаружи цитоплазматической мембраны в периплазматическом пространстве и связан с нерастворимыми компонентами клеточных оболочек.

Липиды (жиры и жироподобные вещества), являясь важными компонентами цитоплазматических мембран органоидов клетки, выполняют и роль запасного питательного материала. Жиры дрожжей представляют собой смесь истинных жиров (глицеридов жирных кислот) с фосфолипидами (лецитин, кефалин) и сте-ролами (эргостеролом). Капельки жира в клетках дрожжей хорошо различимы в световом микроскопе благодаря тому, что они сильно преломляют свет. Особенно хорошо они видны у пленчатых дрожжей.

Фосфолипиды наряду со стеринами, каротиноидами и сквале-нами способствуют росту дрожжей и выполнению биосинтетических реакций в анаэробиозе [62, 240].

В зависимости от вида и условий культивирования дрожжи способны синтезировать от 1 до 74% липидов в расчете на сухую массу. Наибольшей способностью накапливать липиды в клетках обладают дрожжи Rhodotorula gracile. В клетках дрожжей этого рода количество липидов может достигать 74% сухой массы клеток.

Метахроматин (волютин), в состав которого входят преимущественно полифосфаты, находится в состоянии коллоидного раствора в вакуолях и без окраски или осаждения фиксаторами как правило неразличим. Однако иногда в результате каких-то отклонений в клеточном обмене веществ в вакуолях можно наблюдать метахроматин, частично выпавший из раствора в виде сферических гранул, хорошо преломляющих свет и энергично броунирующих. Метахроматин используется при построении клеточного протопласта и как источник энергии. Поэтому количество его уменьшается при активных синтетических процессах и увеличивается при задержанном размножении [109].

Сера, иногда содержащаяся в протоплазме дрожжей, обнаруживается по сильному преломлению света. Отложение серы в клетках дрожжей приводит к появлению инволюционных форм [223].

Клетки некоторых родов дрожжей (Rhodotorula, Sporobolo-myces salmonicolor) окрашены в оранжевый и красный цвета, обусловленные содержанием пигментов, принадлежащих к группе каротиноидов. Дрожжи рода Candida (С. pulcherrima, С. reu-kaufii) на средах, содержащих железо, образуют колонии темно-красного цвета за счет красного пиразинового пигмента, в состав которого входит комплексно-связанное железо.

Итак, в структуре дрожжевой клетки содержатся различные вещества, изменения которых в результате биохимических процессов должны быть идеально согласованы между собой.

Переход клеток дрожжей от аэробного существования к анаэробному (брожение) сопровождается укрупнением ядра и ка-риосом, уменьшением содержания дезоксирибонуклеиновой кислоты; поверхность митохондрий по отношению к биомассе их вещества уменьшается; в клетках дрожжей бродильного типа обычно накапливаются метахроматин и гликоген.

Структура клеток дрожжей разных родов неодинакова. Установлено, что митохондрии, эндоплазматический ретикулум и оболочки клеток дрожжей Sacch. vini и Rhodotorula glutinis существенно различаются. Ультраструктурная организация клеток дрожжей Rh. glutinis более развита и специализирована, чем дрожжей Sacch. vini. У Rh. glutinis митохондрии более многочисленны, с более упорядоченной внутренней структурой, со значительно развитым и своеобразно построенным ретикулумом.